全 文 ：·生物技术· 北方园艺２０１２（１０）：１３８～１４０
第一作者简介：崔巍（１９８５－），男，硕士，研究方向为苔藓植物组织
培养。Ｅ－ｍａｉｌ：ｃｕｉｗｅｉ３１３＠１６３．ｃｏｍ。
责任作者：沙伟（１９６３－），女，博士，教授，博士生导师，现从事植物
学和植物遗传学教学与科研工作。Ｅ－ｍａｉｌ：ｓｈｗ１１２９＠２６３．ｎｅｔ。
基金项目：国家自然科学基金资助项目（３１０７０１８０）。
收稿日期：２０１２－０２－２４
毛尖紫萼藓外植体消毒方法及接种培养基的筛选
崔 巍，张 梅 娟，沙 伟
（齐齐哈尔大学 生命科学与农林学院，黑龙江 齐齐哈尔１６１００６）
摘 要：以毛尖紫萼藓（Ｇｒｉｍｍｉａ ｐｉｌｉｆｅｒａ Ｐ．Ｂｅａｕｖ．）配子体为试材，以Ｂｅｎｅｋ、ＭＳ、Ｋｎｏｐ ３种
培养基为基本培养基，通过预培养和预处理，借助旋流振荡器，对毛尖紫萼藓组织培养消毒方法
及接种培养基类型进行了筛选。结果表明：预培养１５ｄ左右的外植体，０．０２５％升汞溶液旋流振
荡１０５ｓ能有效地对外植体进行消毒，Ｂｅｎｅｋ培养基适合毛尖紫萼藓返绿生长。
关键词：毛尖紫萼藓；组织培养；消毒方法；培养基
中图分类号：Ｓ ６０３．６ 文献标识码：Ｂ 文章编号：１００１－０００９（２０１２）１０－０１３８－０３
毛尖紫萼藓（Ｇｒｉｍｍｉａ ｐｉｌｉｆｅｒａ Ｐ．Ｂｅａｕｖ．）属紫萼藓
科（Ｇｒｉｍｍｉａｃｅａｅ）紫萼藓属（Ｇｒｉｍｍｉａ）植物，体粗壮，稀疏
成片丛生，高３～４ｃｍ。茎倾立，挺硬，衡疏叉状分枝，中
轴细胞不分化的小型旱生藓类。在我国南北各省区均
有分布，呈现出东亚与北美的间断分布［１］。苔藓植物具
有很强的耐旱性，很多种类的苔藓可以随着环境改变将
植物体内的含水量降到最低，以休眠状态生存［２］。毛尖
紫萼藓的抗性尤为突出，在自然风干状态下，半年前采
集的材料仍具有很强的生命力，在复水后数十秒就能复
水返绿，可见毛尖紫萼藓具有典型的抗性。植物组织培
养研究自Ｈａｂｅｒｌａｎｄｔ（１９０２）的工作开始，至今已有１００
多年的历史［３］。要做到既彻底灭菌，又保持组织细胞的
生命力，使外植体成活又不污染，是长期困扰植物组培
工作的难题［４］。该试验对毛尖紫萼藓组织培养最关键
的步骤消毒，进行探讨研究。
１ 材料与方法
１．１ 试验材料
毛尖紫萼藓采自黑龙江省五大连池市石龙地区。
１．２ 试验方法
１．２．１ 材料预培养 将野外采集的毛尖紫萼藓，用自来
水冲洗干净，充分复水，装入培养瓶，放在培养箱中培养
１５ｄ左右。培养温度（２３±１）℃、光照强度３ ０００ｌｘ、光照
周期１２ｈ／１２ｈ。
１．２．２ 材料预处理 在长有新生茎段的材料中，挑选生
长细长的茎段，在解剖镜下取茎尖部约５ｍｍ。流水冲
洗５ｈ左右。冲洗后将材料泡在水中，防止材料风干。
１．２．３ 消毒方法 浸泡消毒：试验在超净工作台中进
行，培养皿中加入一定浓度的消毒液，用无菌镊子将外
植体浸于消毒液中，计时。用无菌镊子将材料取出转入
另一个装有无菌水的培养皿中清洗，每次清洗３０ｓ以
上，清洗５～８次。热击法浸泡消毒：将预处理过的材料，
４０℃水浴５ｍｉｎ，再进行浸泡消毒；４０℃水浴１０ｍｉｎ，再
进行浸泡消毒。旋流振荡消毒：试验在超净工作台中进
行，将配好的不同浓度的升汞溶液加入１．５ｍＬ离心管
中，放入预处理好的材料，立刻在旋流振荡器上剧烈振
荡，计时。用无菌镊子将材料取出转入另一只无菌离心
管中用无菌水的清洗，每次清洗剧烈振荡３０ｓ以上，清
洗５～８次。消毒液种类、消毒液浓度及消毒时间见
表１。
表１ 消毒液种类、浓度及消毒时间
Ｔａｂｌｅ １ Ｄｉｓｉｎｆｅｃｔａｎｔ ｔｙｐｅ，ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｔｅｒｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｔｉｍｅ
消毒液种类
Ｄｉｓｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｌｉｑｕｉｄ
消毒液浓度
Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｄｉｓｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｌｉｑｕｉｄ／％
消毒时间
Ｔｉｍｅ ｏｆ ｄｉｓｉｎｆｅｃｔｉｏｎ／ｓ
次氯酸钠 ０．５ ４５ ６０ ７５
Ｓｏｄｉｕｍ ｈｙｐｏｃｈｌｏｒｉｔｅ １．０ ４５ ６０ ７５
升汞
０．０２５ ９０ １０５ １２０
Ｍｅｒｃｕｒｉｃ ｃｈｌｏｒｉｄｅ
０．０５ ４５ ６０ ７５
０．１ １５ ３０ ４５
１．２．４ 接种 将消好毒的材料用无菌滤纸吸干残留水
份，分别接种到 ＭＳ、Ｋｎｏｐ、Ｂｅｎｅｋ ３种培养基上，每瓶接
５个外植体。
１．２．５ 培养条件 培养温度（２３±１）℃、光照强度３ ０００ｌｘ、
光照周期１２ｈ／１２ｈ，每隔１５ｄ转接１次。
２ 结果与分析
２．１ 毛尖紫萼藓外植体消毒条件筛选
采用次氯酸钠对毛尖紫萼藓进行消毒，外植体迅速
８３１
北方园艺２０１２（１０）：１３８～１４０ ·生物技术·
失绿，接种后全部染菌，次氯酸钠不适合于毛尖紫萼藓
的消毒试验。７０％的酒精穿透能力很强，用其处理后苔
藓植物配子体迅速失绿，对外植体伤害非常大，可见酒
精消毒法对苔藓植物并不适用［４］。用升汞对毛尖紫萼
藓进行浸泡消毒，染菌率极高，浸泡消毒并不适用于毛
尖紫萼藓的消毒试验。经４０℃水浴热击处理过的外植
体，在一定浓度的升汞溶液浸泡消毒后，能有效的降低
染菌率，但接种后全部死亡。一定浓度的升汞溶液，以
外植体旋流振荡，能有效的降低外植体染率。由表２可
知，浓度为０．０２５％的升汞消毒１０５ｓ，无污染率高为
７６％，成活率高为７２％（成活率＝能生长出原丝体且不
染菌的个数／接种个数×１００％），是最好的处理毛尖紫
萼藓消毒的方法。０．５％的升汞消毒６０ｓ次之，无污染
率为７０％，成活率为６６％。毛尖紫萼藓的叶片没有特殊
的抗旱、抗寒及抗紫外线的结构，生命力较脆弱［５］。使
用０．１％的升汞对毛尖紫萼藓进行消毒试验使得外植体
全部死亡。０．０２５％浓度的升汞浓度较低，短时间的振荡
消毒并不能起到很好的消毒效果。
表２ 升汞消毒的浓度和处理时间
Ｔａｂｌｅ ２ Ｍｅｒｃｕｒｉｃ ｃｈｌｏｒｉｄｅ ｄｉｓｉｎｆｅｃｔａｎｔ
ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｔｉｍｅ
浓度
Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ
／％
时间
Ｔｉｍｅ
／ｓ
接种数
Ｉｎｏｃｕｌａｔｅｄ
ｎｕｍｂｅｒ／个
未污染数
Ｕｎｃｏｎｔａｍｉｎａｔｅｄ
ｎｕｍｂｅｒ／个
无污染率
Ｕｎｃｏｎｔａｍｉｎａｔｅｄ
ｒａｔｅ／％
成活率
Ｓｕｒｖｉｖａｌ
ｒａｔｅ／％
０．０２５ ９０ ５０ ３０ ６０ ４４
０．０２５ １０５ ５０ ３８ ７６ ７２
０．０２５ １２０ ５０ ４４ ８８ ５２
０．０５ ４５ ５０ ３０ ６０ ４０
０．０５ ６０ ５０ ３５ ７０ ６６
０．０５ ７５ ５０ ４２ ８４ ３２
０．１ ３０ ５０ ４１ ８２ ０
０．１ ４５ ５０ ５０ １００ ０
０．１ ６０ ５０ ５０ １００ ０
２．２ 外植体消毒培养基的筛选
图１ 毛尖紫萼藓原丝体
Ｆｉｇ．１ Ｐｒｏｔｏｎｅｍｅ ｏｆ Ｇｒｉｍｍｉａ ｐｉｌｉｆｅｒａ
该试验共选用了３种培养基，其中ＭＳ培养基使外植
体发黑，返绿情况极差；Ｂｅｎｅｋ和Ｋｎｏｐ ２种培养基材料返
绿情况较好，但接在Ｋｎｏｐ培养基上的外植体５ｄ后开始
发黑，渐渐死亡。只有Ｂｅｎｅｋ培养基上的外植体返绿情况
较好（图１）。Ｂｅｎｅｋ较适合于毛尖紫萼藓的消毒试验。
３ 讨论与结论
毛尖紫萼藓的消毒试验中，预培养的时间要适度，
培养时间过长，材料出现褐化现象，预培养时间过短，毛
尖紫萼藓不能长出较好的芽体，预培养１５ｄ左右的材料
能够在茎尖处长出新的芽体，新生的芽体含菌量相对较
少，细胞分裂较旺盛，适用于消毒试验。预处理的材料
大小要适中，材料过大染菌率较高，材料过小，外植体极
易被消毒液杀死。
图２ 毛尖紫萼藓内生菌
Ｆｉｇ．２ Ｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃ ｂａｃｔｅｒｉａ ｏｆ Ｇｒｉｍｍｉａ ｐｉｌｉｆｅｒａ
该试验中，染菌的外植体材料多染同一种菌（图２），
染其它杂菌的机率极小。有的外植体已死亡，未染菌，
培养瓶内藻类繁茂（图３）。由此推断，毛尖紫萼藓可能
是与内生菌、藻类共生的一种藓类植物。宋艳祥等［５］将
桉树外植体进行４０℃热击处理，有效地降低了内生细菌
的污染率。李贵等［８］在研究蛇足杉外植体表面消毒时，
采用４７℃热水浴热击处理，再进行消毒液处理，能降低
内生菌污染率。苔藓植物多为阴生植物，毛尖紫萼藓对
温度较敏感，相对过高的温度很容易对毛尖紫萼藓外植
体造成一定伤害，因此，热击法并不适用于毛尖紫萼藓
的消毒试验。
图３ 毛尖紫萼藓共生藻
Ｆｉｇ．３ Ｓｙｍｂｉｏｔｉｃ ａｌｇａｅ ｏｆ Ｇｒｉｍｍｉａ ｐｉｌｉｆｅｒａ
肖显华等［４］采用浸泡消毒、玻璃棒搅拌、磁力搅拌
器进行苹果枝条外植体消毒方法的筛选，结果表明，用
磁力搅拌器能有效的降低外植体的污染率。采用浸泡
消毒方法处理的毛尖紫萼藓外植体染菌率较高，并不适
用于毛尖紫萼藓的消毒。采用旋流振荡，能使外植体与
消毒液充分接触，降低染菌率，适用于毛尖紫萼藓的消
毒试验。
采用次氯酸钠溶液消毒，由于消毒后，氯气很容易
挥发，不会因为消毒剂残留在材料中而对材料造成伤
害，这种消毒剂已被广泛用于苔藓植物的组织培养［９］。
９３１
·生物技术· 北方园艺２０１２（１０）：１３８～１４０
韩继臣等［１０］使用１％的次氯酸钠消毒３ｍｉｎ也可得到较
好的成活率，但由于消毒时间长，对蛇苔叶状体影响严
重。多数外植体边缘细胞已失去活力，由此可见次氯酸
钠不适用于某些苔藓类植物的组织培养消毒试验。该
研究借助于小离心管、旋流振荡器剧烈振荡，使外植体
与升汞溶液充分接触，能够有效地对外植体进行消毒，
并保证了外植体的成活率。但升汞溶液不易祛除，在无
菌水冲洗过程中，要进行剧烈振动，清洗至少５次，以尽
可能减小升汞溶液对外植体的伤害。
ＭＳ培养基是常规的组织培养常用的培养基，由于
苔藓植物组织培养的特殊性，Ｋｎｏｐ、Ｂｅｎｅｋ等无机培养
基也是苔藓植物组织培养重要的培养基。朱瑞良等［１１］
使用Ｋｎｏｐ、Ｂｅｎｅｋ及ＭＳ ３种培养基，对５种具有代表性
的苔藓植物进行组织培养方面的基础研究。相对简单
的Ｋｎｏｐ和Ｂｅｎｅｃｋ培养基能促进短月藓（Ｂｒａｃｈｙｍｅｎｉｕｍ
ｎｅｐａｌｅｎｓｅ）孢子萌发，并能够在５０ｄ左右生长出茎叶体，
而复杂的 ＭＳ和１／２ＭＳ培养基使萌发的孢子发生褐
变［１２］。金灰藓（Ｐｙｌａｉｓｉｅｌａ ｐｏｌｙａｎｔｈａ）在Ｋｎｏｐ培养基
上的孢子萌发率最高［１３］。ＭＳ与Ｋｎｏｐ培养基不适合毛
尖紫萼藓外植体返绿生长，Ｂｅｎｅｃｋ培养基为毛尖紫萼藓
外植体生长较理想的培养基，不同种类苔藓植物的组织
培养对于培养基种类的需求有所不同。对于某一种苔
藓植物的组织培养，应多选用几种培养基进行筛选，确
保外植体能够成活，以达到组织培养消毒实验的目的。
参考文献
［１］ 黎兴江．中国苔藓志［Ｍ］．北京：科学出版社，２０００：１６－１７．
［２］ Ｌｅｅ Ｊ Ａ，Ｓｔｅｗａｒｔ Ｇ Ｒ．Ｄｅｓｉｃｃａｔｉｏｎ ｉｎｊｕｒｙ ｉｎ ｍｏｓｓｅｓ．Ｉ．Ｉｎｔａｓｐｅｃｉｆｉｃ ｄｉｆｅｒ－
ｅｎｃｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｅｆｅｃｔ ｏｆ ｍｏｉｓｔｕｒｅ ｓｔｒｅｓｓ ｏｎ ｐｈｏｔｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ［Ｊ］．Ｎｅｗ Ｐｈｙｔｏｌｏｇｉｓｔ，
１９７１，７０（６）：１０６１－１０６８．
［３］ 杨丽琴，李瑞．植物组织培养的三大难题［Ｊ］．北方园艺，２００８（４）：
１０４－１０７．
［４］ 肖显华．植物材料表面消毒方法的改进［Ｊ］．生物技术，１９９９，９（１）：
４３－４５．
［５］ 付素静．五种观赏藓类植物的配子体发生与组织培养［Ｄ］．南京：南
京林业大学，２００６．
［６］ 张晗，沙伟．紫萼藓科植物ＤＮＡ提取及遗传多样性的分析［Ｊ］．山东
农业科学，２００６（１）：７－９．
［７］ 宋艳祥，王玉凤，冉隆贤．热处理和抗生素对桉树固有内生细菌去除
的研究［Ｊ］．河北农业大学学报，２０１１，３３（４）：６４－６８．
［８］ 李贵，李菁，黎有有，等．蛇足石杉外植体表面消毒及内生菌消除方
法［Ｊ］．吉首大学学报（自然科学版），２００９，３０（４）：１００－１０３．
［９］ Ｓｏｋａｌ Ｉ，Ｋｕｔａ Ｅ，Ｐｒｚｙｗａｒａ Ｌ．Ｃａｌｕｓ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｇａｍｅｔｏｐｈｙｔｅ ｒｅｇｅｎｅｒ－
ａｔｉｏｎ ｉｎ ｍｏｓｓ ｃｕｌｔｕｒｅｓ［Ｊ］．Ａｃｔａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａ Ｃｒａｃｏｖｉｅｎｓｉａ Ｓｅｒｉｅｓ Ｂｏｔａｎｉｃａ，１９９７，
３９：３５－４２．
［１０］韩继臣，沙伟．蛇苔组织培养初探［Ｊ］．北方园艺，２００９（７）：１１７－１１９．
［１１］于传梅．五种苔藓植物的组织培养［Ｄ］．上海：华东师范大学，２００７．
［１２］刘俊华，陈坤，段代祥．植物组织培养技术及其在苔藓植物中的应用
［Ｊ］．安微农业科学，２０１０（１）：５６－５７．
［１３］王振杰，黄士良，李志，等．不同ｐＨ值和培养基对金灰藓（Ｐｙｌａｉｓｉｅｌｌａ
ｐｏｌｙａｎｔｈａ）孢子萌发的影响［Ｊ］．河北师范大学学报，２００８，３２（６）：８１３－８１６．
Ｓｃｒｅｅｎ ｏｆ Ｓｔｅｒｉｌｉｚｅｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｕｍ Ｆｉｌｔｅｒ ｆｏｒ
Ｅｘｐｌａｎｔｓ ｏｆ Ｇｒｉｍｍｉａ ｐｉｌｉｆｅｒａ
ＣＵＩ Ｗｅｉ，ＺＨＡＮＧ Ｍｅｉ－ｊｕａｎ，ＳＨＡ Ｗｅｉ
（Ｃｏｌｅｇｅ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ａｎｄ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ Ｆｏｒｅｓｔｒｙ，Ｑｉｑｉｈａｒ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｑｉｑｉｈａｒ，Ｈｅｉｌｏｎｇｊｉａｎｇ １６１００６）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｃｈｏｓｅｎ Ｇｒｉｍｍｉａ ｐｉｌｉｆｅｒａ ｇａｍｅｔｏｐｈｙｔｉｃ ａｓ ｔｅｓｔ ｍａｔｅｒｉａｌ，Ｂｅｎｅｋ，ＭＳ，Ｋｎｏｐ ａｓ ｂａｓｉｃ ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉｕｍ，ｔｈｅ ｔｉｓｓｕｅ
ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ ｄｉｓｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ａｎｄ ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ ｍｅｄｉｕｍ ｔｙｐｅｓ ｗｅｒｅ ｓｃｒｅｅｎｅｄ，ｔｈｒｏｕｇｈ ｐｒｅ－ｃｕｌｔｕｒｅ，ｐｒｅｔｒｅａｔｍｅｎｔ，ｈａｄ ｔｈｅ ａｉｄ
ｏｆ ｓｗｉｒｌ ｏｓｃｉｌａｔｏｒ．Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ ｅｘｐｌａｎｔｓ ｐｒｅ－ｃｕｌｔｕｒｅ ｆｏｒ ａｂｏｕｔ ｆｉｆｔｅｅｎ ｄａｙｓ，ｓｗｉｒｌ ｏｓｃｉｌａｔｉｎｇ ｂｙ ０．０２５％
ｍｅｒｃｕｒｉｃ ｃｈｌｏｒｉｄｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｆｏｒ １０５ｓｅｃｏｎｄｓ ｃｏｕｎｄ ｄｉｓｉｎｆｅｃｔ ｅｆｅｃｔｉｖｅｌｙ ｆｏｒ ｅｘｐｌａｎｔｓ．Ｂｅｎｅｋ ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉｕｍ ｗａｓ ｓｕｉｔａｂｌｅ ｆｏｒ
Ｇｒｉｍｍｉａ ｐｉｌｉｆｅｒａｔｏ ｒｅｔｕｒｎ ｔｏ ｇｒｅｅｎ ｇｒｏｗｔｈ．
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：Ｇｒｉｍｍｉａ ｐｉｌｉｆｅｒａ；ｔｉｓｓｕｅ ｃｕｌｔｕｒｅ；ｓｔｅｒｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ；ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉｕｍ
０４１