全 文 ： 第５４卷 第１２期
Ｖｏｌ．５４ Ｎｏ．１２
山 东 大 学 学 报 （医 学 版）
ＪＯＵＲＮＡＬＯＦＳＨＡＮＤＯＮＧＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ（ＨＥＡＬＴＨＳＣＩＥＮＣＥＳ）
２０１６年１２月
Ｄｅｃ．２０１６
收稿日期：２０１６０９０９；网络出版时间：
网络出版地址：
基金项目：国家自然科学基金（３１３７０３３０）
通讯作者：程爱霞。Ｅｍａｉｌ：ａｉｘｉａｃｈｅｎｇ＠ｓｄｕ．ｅｄｕ．ｃｎ
文章编号：１６７１－７５５４（２０１６）１２－００２０－０７ ＤＯＩ：１０．６０４０／ｊ．ｉｓｓｎ．１６７１７５５４．０．２０１６．１１３７
一个蛇苔氧甲基转移酶基因的
克隆与功能鉴定
李丹丹，刘慧，程爱霞
（山东大学药学院 天然产物化学生物学教育部重点实验室，山东 济南 ２５００１２）
摘要：目的 克隆蛇苔氧甲基转移酶（ＣｃＯＭＴ１）基因并对其进行功能鉴定。方法 通过 ＲＴＰＣＲ技术获得
ＣｃＯＭＴ１基因的ｃＤＮＡ全长。构建原核表达质粒 ｐＥＴ３２ａＣｃＯＭＴ１，在大肠杆菌 ＢＬ２１（ＤＥ３）中表达后，利用
ＮｉＮＴＡ吸附柱对表达的重组蛋白进行纯化，并通过体外酶活分析其活性。采用 ＤＮＡＭＡＮ７．０和 ＭＥＧＡ５．１软
件分别进行氨基酸多序列比对和进化关系分析。结果 克隆得到的ＣｃＯＭＴ１开放读码框为８３７ｂｐ，编码２７８个氨
基酸，预测分子量为３０．９５ｋＤａ，等电点为５．５９。与来自钝鳞紫背苔、紫花苜蓿和冰叶日中花的氧甲基转移酶的同
源性分别为７３．１８％、５３．６０％和４４．６０％。对纯化的重组蛋白进行酶活检测，结果表明融合蛋白可以催化具有邻
二酚羟基的黄酮和苯丙类化合物，产生相应的氧甲基化产物，其最适底物为槲皮素。结论 克隆并鉴定了一个
ＣｃＯＭＴ１基因，为通过酶法实现化合物的氧甲基化修饰提供了一个候选基因。
关键词：蛇苔；氧甲基转移酶；黄酮；基因克隆；酶活分析
中图分类号：Ｑ７８９ 文献标志码：Ａ
ＣｌｏｎｉｎｇａｎｄｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆａｎＯｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ
ｇｅｎｅｆｒｏｍＣｏｎｏｃｅｐｈａｌｕｍｃｏｎｉｃｕｍ
ＬＩＤａｎｄａｎ，ＬＩＵＨｕｉ，ＣＨＥＮＧＡｉｘｉａ
（ＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＣｈｅｍｉｃａｌＢｉｏｌｏｇｙｏｆＮａｔｕｒａｌＰｒｏｄｕｃｔｓ，ＭｉｎｉｓｔｒｙｏｆＥｄｕｃａｔｉｏｎ；Ｓｃｈｏｏｌｏｆ
ＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ，ＳｈａｎｄｏｎｇＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｊｉｎａｎ２５００１２，Ｓｈａｎｄｏｎｇ，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ ＴｏｉｓｏｌａｔｅａｎｄｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅａｎＯｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ＯＭＴ）ｇｅｎｅｆｒｏｍＣｏｎｏｃｅｐｈａｌｕｍｃｏｎｉｃｕｍ．
Ｍｅｔｈｏｄｓ ＴｈｅｆｕｌｌｅｎｇｔｈｃＤＮＡｓｅｑｕｅｎｃｅｏｆＣｃＯＭＴ１ｗａｓｏｂｔａｉｎｅｄｂｙＲＴＰＣＲａｎｄｉｎｓｅｒｔｅｄｉｎｔｏｔｈｅｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ
ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｐｌａｓｍｉｄｐＥＴ３２ａ，ａｎｄｔｈｅｎｗａｓｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄｉｎｔｏＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＢＬ２１（ＤＥ３）ｆｏｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ｔｈｅｒｅｃｏｍｂｉ
ｎａｎｔｐｒｏｔｅｉｎｗａｓｃｏｌｅｃｔｅｄｂｙＮｉＮＴＡａｆｉｎｉｔｙｃｏｌｕｍｎａｎｄｐｕｒｉｆｉｅｄｆｏｒｅｎｚｙｍｅｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ．Ｔｈｅａｎａｌｙｓｅｓｏｆｍｕｌｔｉｐｌｅ
ａｌｉｇｎｍｅｎｔａｎｄｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃｔｒｅｅｗｅｒｅｐｅｒｆｏｒｍｅｄｕｓｉｎｇＤＮＡＭＡＮ７．０ａｎｄＭＥＧＡ５．１ｓｏｆｔｗａｒｅｓ．Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ
ａｎａｌｙｓｉｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｆｕｌｌｅｎｇｔｈｃＤＮＡｏｆＣｃＯＭＴ１ｗａｓ８３７ｂｐａｎｄｅｎｃｏｄｅｄａ２７８ａａｐｒｏｔｅｉｎｗｉｔｈａｃａｌｃｕｌａｔｅｄｍｏ
ｌｅｃｕｌａｒｗｅｉｇｈｔｏｆ３０．９５ｋＤａａｎｄａｎｉｓｏｅｌｅｃｔｒｉｃｐｏｉｎｔｏｆ５．５９．ＴｈｅａｍｉｎｏａｃｉｄｓｅｑｕｅｎｃｅｏｆＣｃＯＭＴ１ｓｈｏｗｅｄ７３．１８％，
５３．６０％，ａｎｄ４４．６０％ ｉｄｅｎｔｉｔｙｗｉｔｈＯｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ＯＭＴ）ｆｒｏｍＰｌａｇｉｏｃｈａｓｍａａｐｐｅｎｄｉｃｕｌａｔｕｍ，Ｍｅｄｉｃａｇｏｓａｔｉｖａ
ａｎｄＭｅｓｅｍｂｒｙａｎｔｈｅｍｕｍｃｒｙｓｔａｌｉｎｕｍ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｔｈｅｐｕｒｉｆｉｅｄｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｒｏｔｅｉｎｗａｓａｂｌｅｔｏｍｅｔｈｙｌａｔｅａｖａｒｉｅｔｙｏｆ
ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓａｎｄｐｈｅｎｙｌｐｒｏｐａｎｏｉｄｓｗｉｔｈａｒｏｍａｔｉｃｖｉｃｉｎａｌｄｉｈｙｄｒｏｘｙｌｇｒｏｕｐｓ，ａｎｄｔｈｅｐｒｅｆｅｒｅｄｓｕｂｓｔｒａｔｅｗａｓｑｕｅｒｃｅｔｉｎ．
Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ ＡｎＯＭＴｇｅｎｅｆｒｏｍＣｏｎｏｃｅｐｈａｌｕｍｃｏｎｉｃｕｍｉｓｃｌｏｎｅｄａｎｄｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ．Ｔｈｅｐｒｅｓｅｎｔｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎｗｏｕｌｄ
ｐｒｏｖｉｄｅａｃａｎｄｉｄａｔｅｇｅｎｅｆｏｒｓｙｎｔｈｅｓｉｓｏｆｍｅｔｈｙｌａｔｅｄｃｏｍｐｏｕｎｄｓａｔｓｐｅｃｉｆｉｃｐｏｓｉｔｉｏｎｔｈｒｏｕｇｈｅｎｚｙｍａｔｉｃｍｅｔｈｏｄ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ｃｏｎｏｃｅｐｈａｌｕｍｃｏｎｉｃｕｍ；Ｏｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ；Ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ；Ｇｅｎｅｃｌｏｎｉｎｇ；Ｅｎｚｙｍｅａｃｔｉｖｉｔｙａｓｓａｙ
2016-11-14 15:10:25
http://www.cnki.net/kcms/detail/37.1390.R.20161219.1443.118.html
李丹丹，等．一个蛇苔氧甲基转移酶基因的克隆与功能鉴定 ２１
苔藓植物资源丰富，分布广泛，是最早的陆生植
物［１］。为适应陆地环境，苔藓植物体内产生了极为
丰富的次级代谢产物，包括联苄类［２］、木脂素［３］、香
豆素［４］、黄酮类［５］化合物等。这些次级代谢产物具
有各种各样的生物活性［６］，其后修饰需要氧甲基转
移酶（Ｏｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ，ＯＭＴ）的参与，它可以将
甲基供体 Ｓ腺苷 －甲硫氨酸（ＳａｄｅｎｏｓｙＬｍｅｔｈｉｏ
ｎｉｎｅ，ＳＡＭ）的甲基转移到化合物的氧原子上，生成
氧甲基化产物和 Ｓ腺苷Ｌ高半胱氨酸（Ｓａｄｅｎｏｓｙｌ
Ｌｈｏｍｏｃｙｓｔｅｉｎｅ，ＳＡＨ），该反应对植物自身的生长
发育以及植物适应环境有重要影响［７８］。植物的
ＯＭＴ分为两类，一类是 Ｍｇ２＋依赖的Ⅰ型 ＯＭＴ，包
括真正的咖啡酰辅酶 Ａ氧甲基转移酶（ｃａｆｅｏｙｌ
ＣｏＡＯｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ，ＣＣｏＡＯＭＴ）和ＣＣｏＡＯＭＴ
ｌｉｋｅ；另一类是不需要 Ｍｇ２＋的Ⅱ型 ＯＭＴ，通常命名
为咖啡酸氧甲基转移酶（ｃａｆｅｉｃａｃｉｄＯｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓ
ｆｅｒａｓｅｓ，ＣＯＭＴ）。ＣＣｏＡＯＭＴ属于Ⅰ型 ＯＭＴ，可以
催化咖啡酰辅酶Ａ（ｃａｆｅｏｙｌＣｏＡ，ＣＣｏＡ）生成阿魏
酰辅酶Ａ，是木质素生物合成途径中一类重要的甲
基转移酶［９１１］。紫花苜蓿的氧甲基转移酶（Ｍｅｄｉｃａ
ｇｏｓａｔｉｖａｃａｆｅｏｙｌＣｏＡ Ｏｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ，ＭｓＣ
ＣｏＡＯＭＴ）属于真正的ＣＣｏＡＯＭＴ，其催化机制和晶
体结构已被阐明［１２］。研究表明，经典的ＣＣｏＡＯＭＴ也
可以催化某些黄酮类化合物［１３１４］。作为 ＣＣｏＡＯＭＴ
的亚类，ＣＣｏＡＯＭＴｌｉｋｅ存在于一些植物中，例如拟
南芥（ＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａＣＣｏＡＯＭＴｌｉｋｅ）［１５］、水
稻［１６］、香草兰［１７］、白杨［１８］、冰叶日中花等，可以催
化各种黄酮、花青素和苯丙素类化合物。来源于冰
叶日中花的氧甲基转移酶（Ｍｅｓｅｍｂｒｙａｎｔｈｅｍｕｍ
ｃｒｙｓｔａｌｉｎｕｍＯｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ，ＭｃＰＦＯＭＴ）是首
次发现的可同时催化 ＣＣｏＡ和黄酮类化合物的
ＯＭＴ［９］；ＣＣｏＡＯＭＴｌｉｋｅ虽然均具有广泛的底物选
择性，但最适底物一般都不同。本研究首次克隆了
蛇苔氧甲基转移酶（ＣｏｎｏｃｅｐｈａｌｕｍｃｏｎｉｃｕｍＯｍｅｔｈ
ｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ，ＣｃＯＭＴ１）基因，并鉴定了体外重组蛋
白的催化活性，为一些化合物的氧甲基化提供了工
具酶，同时也为研究其在蛇苔次生代谢中的生物学
功能提供了依据。
１ 材料与方法
１．１ 材料
１．１．１ 植物材料、菌种和质粒 蛇苔生长于１２ｈ
光周期、２５℃的温室中，通过胞芽和有性杂交的方
式繁殖。大肠杆菌 ＤＨ５α和 ＢＬ２１（ＤＥ３）购自北京
全式金生物技术有限公司；原核表达载体 ｐＥＴ３２ａ
（＋）（Ａｍｐｒ，Ｔ７ｌａｃ启动子）购自德国 Ｎｏｖａｇｅｎ公
司；ｐＭＤ１９Ｔ载体购自宝生物工程（大连）有限
公司。
１．１．２ 主要试剂及仪器 槲皮素、木犀草素、圣草
酚、黄芩素、野黄芩素和秦皮乙素购自成都曼斯特生
物科技有限公司；ｒＴａｑＤＮＡ聚合酶、ＫＯＤＰｌｕｓ
ＤＮＡ聚合酶购自东洋纺（上海）生物科技有限公
司；ＢａｍＨⅠ和 ＸｈｏⅠ限制性内切酶、Ｔ４ＤＮＡ连接
酶、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔＲＴＭａｓｔｅｒＭｉｘ反转录试剂盒均购自
宝生物工程（大连）有限公司；ＤＮＡ凝胶回收试剂
盒、质粒提取试剂盒购自天根生化科技（北京）有限
公司；其他试剂均为国产分析纯。阳性克隆由上海
铂尚科技有限公司进行序列测定。
ＳＷＣＪＩＣ型双人单面净化工作台（苏州净化
设备有限公司）、ＡｌｅｇｒａＸ１２Ｒ型离心机（美国
ＢｅｃｋｍａｎＣｏｕｌｔｅｒ公司）、ＥＣ２５０９０ＤＮＡ电泳仪（美
国ＴｈｅｒｍｏＥｌｅｃｔｉｏｎ公司）、ＰＣＲ仪（美国 ＢＩＯＲＡＤ
公司）、１２６０高效液相色谱仪（美国 Ａｇｉｌｅｎｔ科技有
限公司）。
１．２ 方法
１．２．１ ＲＮＡ提取与ｃＤＮＡ第一链的合成 取生长
两个月的蛇苔叶状体数片，洗净、吸干表面水分、液
氮速冻，采用 ＣＴＡＢ法［１９］提取 ＲＮＡ。利用 Ｐｒｉｍｅ
ＳｃｒｉｐｔＲＴＭａｓｔｅｒＭｉｘ逆转录体系反转录合成ｃＤＮＡ
第一链。取１μｇ总 ＲＮＡ作为模板进行 ＲＴＰＣＲ，
１０μＬ体系中含总 ＲＮＡ１μｇ，５×ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔＲＴ
ＭａｓｔｅｒＭｉｘ２μＬ，ＤＥＰＣ水补齐至１０μＬ。ＰＣＲ程序
为：３７℃ １５ｍｉｎ；８５℃ １５ｓ，４℃保温。逆转录产物
保存于－２０℃，使用前稀释１０倍。
１．２．２ 蛇苔ＣＣｏＡＯＭＴ基因 ｃＤＮＡ全长序列克隆
根据转录组测序数据（ＳＲＰ０７６９６６），设计引物
ＣｃＯＭＴ１Ｆ：５′ＣＴＭＳＧＣＡＴＡＧＣＶＧＡＹＡＴＣＡＴ３′和
ＣｃＯＭＴ１Ｒ：５′ＣＴＴＣＡＴＲＡＡＲＡＹＷＧＭＡＴＣＡＧ３′。
用ＫＯＤＰｌｕｓＤＮＡ聚合酶扩增，产物电泳后用凝胶
成像分析系统进行拍照及分析。扩增产物按照说明
书进行回收。
１．２．３ 克隆载体 ＰＭＤ１９ＴＣｃＯＭＴ１的构建 回
收目的片段通过 ＴＡ克隆连接到 ｐＭＤ１９Ｔ载体，
连接产物转化大肠杆菌 ＤＨ５α感受态细胞，筛选阳
性单克隆。
１．２．４ 生物信息学分析 通过查询文献［９，２０２１］
以及比对 ＮＣＢＩ数据库，获得不同植物的 ＯＭＴ序
列。将测序得到的ｃＤＮＡ序列通过ＮＣＢＩ数据库进
行同源性比对（ｈｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／
２２ 山 东 大 学 学 报 （医 学 版） ５４卷１２期
Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ），用ＤＮＡＭＡＮ７．０和 ＭＥＧＡ５．１软件分
别进行氨基酸多序列比对和进化关系分析。
１．２．５ 蛋白表达载体 ｐＥＴ３２ａＣｃＯＭＴ１的构建
以ｐＭＤ１９ＴＣｃＯＭＴ１质粒为模板，分别以ＣｃＯＭＴ１
ＢａｍＨⅠＦ：５′ＣＧＧＧＡＴＣＣＡＴＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＡＣ
ＴＧＡＡＧＣ３′和 ＣｃＯＭＴ１ＸｈｏⅠＲ：５′ＣＣＣＴＣＧＡ
ＧＴＣＡＴＡＣＣＡＧＴＣＴＴＣＧＧＣＡＧＡ３′为引物，用 ＫＯＤ
ＰｌｕｓＤＮＡ聚合酶进行 ＰＣＲ扩增电泳检测后，将回
收目的片段连接到 ｐＥＴ３２ａ载体，以 ＢａｍＨⅠ和 ＸｈｏⅠ
分别双酶切ｐＥＴ３２ａ质粒和含酶切位点的目的ＤＮＡ
片段，胶回收后用Ｔ４ＤＮＡ连接酶连接，转化大肠杆
菌ＤＨ５α感受态细胞。经过含 Ａｍｐ１００ｍｇ／Ｌ抗生
素的ＬＢ平板筛选。挑取阳性单菌落扩大培养，阳性
质粒命名为 ｐＥＴ３２ａＣｃＯＭＴ１。选取测序正确的单
克隆存菌并提取质粒。
１．２．６ 目的蛋白在重组菌株中的诱导表达 构建
含有目的片段的载体和 ｐＥＴ３２ａ空载体，用热击法
将其转入表达型大肠杆菌 ＢＬ２１（ＤＥ３）感受态细胞
中。挑取阳性单克隆接种于４ｍＬ含 Ａｍｐ抗性的
ＬＢ培养基中，３７℃、２００ｒ／ｍｉｎ振荡培养过夜。将
重组菌株扩大培养至 ＯＤ６００＝０．４～０．６时，加入
ＩＰＴＧ至终浓度为０．５ｍｍｏｌ／Ｌ，１６℃、１１０ｒ／ｍｉｎ培
养１３ｈ，诱导蛋白表达。诱导完成后，离心收集细
菌，超声破碎，用ＮｉＮＴＡ亲和层析柱对融合蛋白进
行纯化，得到目的蛋白。分别取６～８μＬ超声破碎
后的上清和纯化蛋白点样进行 ＳＤＳＰＡＧＥ蛋白电
泳，结束后染色２ｈ，脱色４０ｍｉｎ（过程中换两次脱
色液）。
１．２．７ ＣｃＯＭＴ１的体外酶活功能检测 对照组加
入表达的空载体 ｐＥＴ３２ａ蛋白，底物包括：槲皮素、
木犀草素、圣草酚、黄芩素、野黄芩素、秦皮乙素和
ＣＣｏＡ。反应体系为：ＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ７．５）２００ｍｍｏｌ／Ｌ，
ＳＡＭ０．５ｍｍｏｌ／Ｌ，ＭｇＣｌ２２．０ｍｍｏｌ／Ｌ，ＤＴＴ４．０ｍｍｏｌ／Ｌ，底
物０．２ｍｍｏｌ／Ｌ，蛋白４．０μｇ，ｄｄＨ２Ｏ补齐至１００μＬ，
３７℃反应３０ｍｉｎ，加入１００μＬＣＨ３ＣＮ终止反应。
当底物为ＣＣｏＡ时，加入５ｍｏｌ／ＬＮａＯＨ（１２μＬ）终
止反应，４０℃反应２０ｍｉｎ；用６ｍｏｌ／ＬＨＣｌ（２８μＬ）
中和后，等体积的乙酸乙酯萃取咖啡酸和阿魏酸，乙
酸乙酯挥发后，加５０μＬ甲醇复溶。在上述反应体
系的基础上，不加入 ＭｇＣｌ２，加入 ２．０ｍｍｏｌ／Ｌ的
ＥＤＴＡ二钠进行Ｍｇ２＋依赖性实验。
酶活反应产物通过 ＨＰＬＣ进行鉴定，所用
ＨＰＬＣ分析柱为ＺＯＲＢＡＸＳＢＣ１８，５μｍ，４．６ｍｍ×
１５０ｍｍ（Ａｇｉｌｅｎｔ）色谱柱；流速 １．０ｍＬ／ｍｉｎ；进样
２０μＬ；检测波长为２５４、２８０、３２０、３４６ｎｍ；流动相：Ａ
相为０．１％乙酸－水，Ｂ相为１００％甲醇。当底物为
ＣＣｏＡ和秦皮乙素时的分析条件：０～２０ｍｉｎ：２０％～
５０％ Ｂ；２０～２５ｍｉｎ：１００％ Ｂ；２５～３０ｍｉｎ：２０％ Ｂ。
当底物为木犀草素、槲皮素、圣草酚时的分析条件：
０～２０ｍｉｎ：３５％～６５％ Ｂ；２０～２５ｍｉｎ：１００％ Ｂ；
２５～３０ｍｉｎ：３５％ Ｂ。当底物为黄芩素和野黄芩
素时的分析条件：０～２０ｍｉｎ：４５％ ～７５％ Ｂ；２０～
２５ｍｉｎ：１００％ Ｂ；２５～３０ｍｉｎ：４５％ Ｂ［２０］。
２ 结 果
２．１ ＣｃＯＭＴ１基因的生物信息学分析 见图１～
２、表１。进化树由两个大的分支组成，分别为Ⅰ型
的ＯＭＴ和Ⅱ型的ＣＯＭＴ，其中Ⅰ型的ＯＭＴ又包括
ＣＣｏＡＯＭＴ和ＣＣｏＡＯＭＴｌｉｋｅ两个小分支。进化树
结果显示，ＣｃＯＭＴ１和ＰａＯＭＴ１位于 ＣＣｏＡＯＭＴ和
ＣＣｏＡＯＭｌｉｋｅ分支的根部，属于Ⅰ型ＯＭＴｓ。
图１ ＣｃＯＭＴ１及其他植物ＯＭＴｓ的进化关系分析图
Ｆｉｇ．１ ＰｈｙｌｏｇｅｎｙｏｆＣｃＯＭＴ１ａｎｄｏｔｈｅｒｐｌａｎｔＯＭＴｓ
李丹丹，等．一个蛇苔氧甲基转移酶基因的克隆与功能鉴定 ２３
图２ ＣｃＯＭＴ１与ＰａＯＭＴ１、ＭｓＣＣｏＡＯＭＴ及ＭｃＰＦＯＭＴ的序列比对结果
红色三角标注的为ＭｓＣＣｏＡＯＭＴ的基因底物结合位点，绿色三角标注的为金属离子和 ＳＡＭ结合位点，蓝色
方框环绕的为插入环部分。
Ｆｉｇ．２ ＳｅｑｕｅｎｃｅａｌｉｇｎｍｅｎｔｏｆＣｃＯＭＴ１ｗｉｔｈｔｈｅｓｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆＰａＯＭＴ１，ＭｓＣＣｏＡＯＭＴ，ａｎｄＭｃＰＦＯＭＴ
ＴｈｅｓｕｂｓｔｒａｔｅｂｉｎｄｉｎｇｒｅｓｉｄｕｅｓｏｆＭｓＣＣｏＡＯＭＴｗｅｒｅｍａｒｋｅｄｂｙｔｈｅｒｅｄｔｒｉａｎｇｌｅｓ，ｔｈｅｇｒｅｅｎｔｒｉａｎｇｌｅｓｂｅｌｏｗｔｈｅ
ｓｅｑｕｅｎｃｅｓｉｎｄｉｃａｔｅｄｔｈｅｍｅｔａｌｉｏｎａｎｄＳＡＭｂｉｎｄｉｎｇｒｅｓｉｄｕｅｓ，ａｎｄｔｈｅｉｎｓｅｒｔｉｏｎｌｏｏｐｗａｓｓｈｏｗｎｂｏｘｅｄｉｎｂｌｕｅ．
表１ 物种中英文对应关系
物种来源中文名称 基因英文（拉丁文）名称 基因简称 序列号
拟南芥 ＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａＣＣｏＡＯＭＴｌｉｋｅ ＡｔＣＣｏＡＯＭＴｌｉｋｅ ＡＢＨ０４５１９．１
葡萄 ＶｉｔｉｓｖｉｎｉｆｅｒａＦＡＯＭＴ ＶｖＦＡＯＭＴ ＡＤＪ５７３３２．１
冰叶日中花 ＭｅｓｅｍｂｒｙａｎｔｈｅｍｕｍｃｒｙｓｔａｌｉｎｕｍＰＦＯＭＴ ＭｃＰＦＯＭＴ ＡＹ１４５５２１．１
紫花苜蓿 ＭｅｄｉｃａｇｏｓａｔｉｖａＣＣｏＡＯＭＴ ＭｓＣＣｏＡＯＭＴ ＡＡＣ２８９７３．１
玉米 ＺｅａｍａｙｓＣＣｏＡＯＭＴ ＺｍＣＣｏＡＯＭＴ ＡＪ２４２９８０
火炬松 ＰｉｎｕｓｔａｅｄａＣＣｏＡＯＭＴ ＰｔＣＣｏＡＯＭＴ ＡＡＤ０２０５０
钝鳞紫背苔 ＰｌａｇｉｏｃｈａｓｍａａｐｐｅｎｄｉｃｕｌａｔｕｍＯＭＴ１ ＰａＯＭＴ１ ＫＰ７２９１７９．１
紫花苜蓿 ＭｅｄｉｃａｇｏｓａｔｉｖａＩＯＭＴ ＭｓＩＯＭＴ ＡＡＣ４９９２８．１
火炬松 ＰｉｎｕｓｔａｅｄａＣＯＭＴ ＰｔＣＯＭＴ Ｕ３９３０１．１
蛇苔 ＣｏｎｏｃｅｐｈａｌｕｍｃｏｎｉｃｕｍＯＭＴ１ ＣｃＯＭＴ１ ＫＹ０１２３１９
ＣｃＯＭＴ１与ＰａＯＭＴ１、ＭｓＣＣｏＡＯＭＴ和ＭｃＰＦＯ
ＭＴ的同源性分别为７３．１８％、５３．６０％和４４．６０％；
与ＭｓＣＣｏＡＯＭＴ的序列对比结果表明，ＣｃＯＭＴ１中
与底物、金属离子、ＳＡＭ结合相关的１８个氨基酸残
基高度保守，只有９２位和２３５位的氨基酸与 ＭｓＣ
ＣｏＡＯＭＴ不同。
２．２ ＣｃＯＭＴ１基因的克隆与重组质粒 ｐＥＴ３２ａ
ＣｃＯＭＴ１的构建 见图３。目的基因条带位于７５０～
１０００ｂｐ之间（泳道１），大于５０００ｂｐ的条带为空载
体（泳道２）。
２．３ 大肠杆菌中ＣｃＯＭＴ１编码蛋白的诱导表达与
纯化 见图４。蛋白电泳结果表明，表达的融合蛋
白在泳道１和泳道３有明显条带，以可溶性形式存
在；纯化之后得到的融合蛋白，其分子量约为５１ｋＤａ
（包含２０．４ｋＤａ的Ｈｉｓ标签）。
图３ ＣｃＯＭＴ１基因全长克隆以及重组质粒 ｐＥＴ３２ａ
ＣｃＯＭＴ１酶切验证结果
Ｍ：ＤＮＡｍａｒｋｅｒ（ＤＬ５０００）；１：ＣｃＯＭＴ１基因全长ＰＣＲ
结果；２：重组质粒ｐＥＴ３２ａＣｃＯＭＴ１双酶切验证。
Ｆｉｇ．３ ＣｌｏｎｉｎｇｏｆｆｕｌｌｅｎｇｔｈｃＤＮＡｏｆＣｃＯＭＴ１ｇｅｎｅａｎｄｄｏｕｂ
ｌｅｄｉｇｅｓｔｓｗｉｔｈｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎｅｎｚｙｍｅｓｏｆｐＥＴ３２ａＣｃＯＭＴ１
Ｍ：ＤＮＡｍａｒｋｅｒ（ＤＬ５０００）；１：ＰＣＲａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆ
ｔｈｅｆｕｌｌｅｎｇｔｈｃＤＮＡ ＣｃＯＭＴ１；２：Ｄｏｕｂｌｅｄｉｇｅｓｔｓ
ｗｉｔｈｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎｅｎｚｙｍｅｓｏｆｐＥＴ３２ａＣｃＯＭＴ１．
２４ 山 东 大 学 学 报 （医 学 版） ５４卷１２期
图４ ｐＥＴ３２ａＣｃＯＭＴ１重组蛋白和空载体 ｐＥＴ３２ａ重组蛋
白的ＳＤＳＰＡＧＥ电泳结果
Ｍ：已知蛋白分子量标准；泳道 １：重组表达的
ｐＥＴ３２ａＣｃＯＭＴ１上 清 液 蛋 白；泳 道 ２：纯 化 的
ＣｃＯＭＴ１蛋白；泳道３：空载体 ｐＥＴ３２ａ上清液蛋白；
泳道４：纯化的空载体ｐＥＴ３２ａ表达的蛋白。
Ｆｉｇ．４ ＳＤＳＰＡＧＥｏｆｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐＥＴ３２ａＣｃＯＭＴ１ａｎｄ
ｅｍｐｔｙｐＥＴ３２ａｐｒｏｔｅｉｎ
Ｍ：ｍｏｌｅｃｕｌａｒｍａｓｓｓｔａｎｄａｒｄｓ；ｌａｎｅ１：ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ
ｆｒａｃｔｉｏｎｏｆｐＥＴ３２ａＣｃＯＭＴ１；ｌａｎｅ２：ｐｒｏｔｅｉｎｓｐｕｒｉ
ｆｉｅｄｆｒｏｍ ｐＥＴ３２ａＣｃＯＭＴ１；ｌａｎｅ３：ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ
ｆｒａｃｔｉｏｎｏｆｐＥＴ３２ａ；ｌａｎｅ４：ｐｒｏｔｅｉｎｓｐｕｒｉｆｉｅｄｆｒｏｍ
ｐＥＴ３２ａ．
２．４ ＣｃＯＭＴ１酶活性的分析结果 酶活结果显示
ＣｃＯＭＴ１对槲皮素、木犀草素、圣草酚、黄芩素、野黄
芩素、秦皮乙素和 ＣＣｏＡ均具有催化活性（表 ２）。
ＨＰＬＣ分析产物与标准品的保留时间以及紫外图谱
结果显示，ＣｃＯＭＴ１可以催化槲皮素（图５）和木犀
草素，分别生成异鼠李素和金圣草素。ＣｃＯＭＴ１也
可以催化圣草酚生成相应的高圣草素和橙皮素，催
化黄芩素和野黄芩素分别生成千层纸素 Ａ和高车
前素。ＣｃＯＭＴ１能够将 ＣＣｏＡ转化为阿魏酰辅酶
Ａ，产物被水解后以阿魏酸的形式被检测（图 ６）。
Ｍｇ２＋依赖性的实验结果表明，当没有Ｍｇ２＋存在时，
ＣｃＯＭＴ１对于底物无催化活性（图７）。
表２ ＣｃＯＭＴ１重组蛋白酶活结果
底物 产物生成速率［ｎｍｏｌ／（ｍｇ·ｍｉｎ）±ＳＴＤＥＶ］
槲皮素 １１２．３６±３．１０
木犀草素 ４０．５５±５．８０
圣草酚 ３５．４４±６．０３
黄芩素 ４０．５５±５．８０
野黄芩素 ７１．１４±５．９８
秦皮乙素 １３．７７±１．７５
ＣＣｏＡ １６．４７±１．０８
图５ ＣｃＯＭＴ１以槲皮素为底物的酶活产物液相分析结果
Ａ：ＣｃＯＭＴ１催化产物；Ｂ：空载体表达蛋白催化；Ｃ：异鼠李素；Ｄ：槲皮素；Ｅ：ＣｃＯＭＴ１酶活产物紫外图谱；Ｆ：空载体
对照紫外图谱；Ｇ：异鼠李素标准品紫外图谱；Ｈ：槲皮素标准品紫外图谱。
Ｆｉｇ．５ ＨＰＬＣａｎａｌｙｓｉｓｏｆｃａｔａｌｙｔｉｃｐｒｏｄｕｃｔｓｏｆｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔＣｃＯＭＴ１ｕｓｉｎｇｑｕｅｒｃｅｔｉｎａｓｓｕｂｓｔｒａｔｅ
Ａ：ｃａｔａｌｙｔｉｃｐｒｏｄｕｃｔｏｆＣｃＯＭＴ１；Ｂ：ｃａｔａｌｙｔｉｃｐｒｏｄｕｃｔｏｆｅｍｐｔｙｖｅｃｔｏｒｃｏｎｔｒｏｌ；Ｃ：ｉｓｏｒｈａｍｎｅｔｉｎ；Ｄ：ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ；Ｅ：ＵＶ
ｓｐｅｃｔｒａｏｆｃａｔａｌｙｔｉｃｐｒｏｄｕｃｔｏｆＣｃＯＭＴ１；Ｆ：ＵＶｓｐｅｃｔｒａｏｆｔｈｅｅｍｐｔｙｖｅｃｔｏｒｃｏｎｔｒｏｌ；Ｇ：ＵＶｓｐｅｃｔｒａｏｆｉｓｏｒｈａｍｎｅｔｉｎｓｔａｎｄ
ａｒｄ；Ｈ：ＵＶｓｐｅｃｔｒａｏｆｑｕｅｒｃｅｔｉｎｓｔａｎｄａｒｄ．
３ 讨 论
ＯＭＴｓ是在植物次生代谢产物合成过程中普遍
存在的酶，能够调控木质素的合成［２１］，并且对于天
然产物生物合成中苯丙素类、香豆素类和黄酮类化
合物的后修饰具有重要意义。植物的 ＯＭＴｓ可以
分为两类，Ⅰ型 ＯＭＴ分子量较小，约２３～２９ｋＤａ，
反应需要辅助因子 Ｍｇ２＋的参与，以 ＣＣｏＡＯＭＴ为
代表；Ⅱ型ＯＭＴ分子量在３８～４２ｋＤａ之间，可以催
化咖啡酸、香豆素以及各种黄酮和生物碱类化合
物［２２］。ＣＣｏＡＯＭＴｌｉｋｅ是Ⅰ型 ＯＭＴ的一个分支，
李丹丹，等．一个蛇苔氧甲基转移酶基因的克隆与功能鉴定 ２５
可以催化各种黄酮、花青素、香豆素和苯丙素类化合
物的甲基化［２３］。目前 ＣＣｏＡＯＭＴ的研究主要集中
于含有维管组织的高等植物，而其在苔藓植物中却
较少被鉴定。
图６ ＣｃＯＭＴ１催化ＣＣｏＡ的酶活产物液相检测结果
Ａ：ＣｃＯＭＴ１催化产物；Ｂ：空载体表达蛋白催化；Ｃ：阿魏酸标准品；Ｄ：ＣｃＯＭＴ１酶活产物紫外吸收光谱；Ｅ：阿魏酸标
准品紫外吸收光谱。
Ｆｉｇ．６ ＨＰＬＣａｎａｌｙｓｉｓｏｆｃａｔａｌｙｔｉｃｐｒｏｄｕｃｔｓｏｆｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔＣｃＯＭＴ１ｕｓｉｎｇｃａｆｅｏｙｌＣｏＡａｓｓｕｂｓｔｒａｔｅ
Ａ：ｃａｔａｌｙｔｉｃｐｒｏｄｕｃｔｏｆＣｃＯＭＴ１；Ｂ：ｃａｔａｌｙｔｉｃｐｒｏｄｕｃｔｏｆｅｍｐｔｙｖｅｃｔｏｒｃｏｎｔｒｏｌ；Ｃ：ｆｅｒｕｌｉｃａｃｉｄ；Ｄ：ＵＶｓｐｅｃｔｒａｏｆｃａｔａｌｙｔｉｃ
ｐｒｏｄｕｃｔｏｆＣｃＯＭＴ１；Ｅ：ＵＶｓｐｅｃｔｒａｏｆｆｅｒｕｌｉｃａｃｉｄｓｔａｎｄａｒｄ．
图７ 无Ｍｇ２＋存在时，ＣｃＯＭＴ１以槲皮素为底物进行酶活
反应的液相分析结果
Ａ：ＣｃＯＭＴ１表达蛋白催化；Ｂ：空载体对照表达蛋白
催化。
Ｆｉｇ．７ ＨＰＬＣａｎａｌｙｓｉｓｏｆｃａｔａｌｙｔｉｃｐｒｏｄｕｃｔｓｏｆｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ
ＣｃＯＭＴ１ｕｓｉｎｇｑｕｅｒｃｅｔｉｎａｓｓｕｂｓｔｒａｔｅｗｉｔｈｏｕｔＭｇ２＋
Ａ：ｃａｔａｌｙｔｉｃｐｒｏｄｕｃｔｏｆＣｃＯＭＴ１；Ｂ：ｃａｔａｌｙｔｉｃｐｒｏｄ
ｕｃｔｏｆｅｍｐｔｙｖｅｃｔｏｒｃｏｎｔｒｏｌ．
本研究从蛇苔中克隆了一个 ＯＭＴ基因：
ＣｃＯＭＴ１，其预测分子量（３０．９５ｋＤａ）与两类 ＯＭＴｓ
均不同。进化树分析可以看出，ＣｃＯＭＴ１与ＰａＯＭＴ１
聚成一簇，它们既不属于真正的ＣＣｏＡＯＭＴ，也不属
于ＣＣｏＡＯＭＴｌｉｋｅ，而是同时位于Ⅰ型 ＯＭＴｓ的根
部，因此推测其可能是 Ｉ型 ＯＭＴｓ的起源。氨基酸
序列比对结果表明，相对于 ＭｃＰＦＯＭＴ，ＣｃＯＭＴ１更
接近于ＭｓＣＣｏＡＯＭＴ，ＣｃＯＭＴ１与 ＰａＯＭＴ１的相似
性最高。ＣｃＯＭＴ１、ＰａＯＭＴ１与来自其他植物的
ＣＣｏＡＯＭＴ相比，都具有较长的 Ｎ端。据文献报
道，截掉 ＰａＯＭＴ１的 Ｎ端前５０个氨基酸后表达的
ＰａＯＭＴ１蛋白对于底物亲和性无影响，但可以提高
蛋白转化率。亚细胞定位结果表明，截掉 Ｎ端序列
不影响蛋白表达位置，序列上不存在信号肽［２０］。而
如果截掉ＣｃＯＭＴ１Ｎ端的一部分后，是否也会出现
上述结果还需要深入研究。酶活结果显示，
ＣｃＯＭＴ１可以催化一系列含有邻苯二酚结构的黄酮
类、苯丙类及香豆素类化合物。其催化特点为苯丙
素类化合物ＣＣｏＡ生成间位甲基化产物，这是Ⅰ型
ＯＭＴ最常见的产物；香豆素（秦皮乙素）在间位或
者对位甲基化；Ｂ环上有邻二羟基的黄酮（木犀草
素、槲皮素）在３′位甲基化；二氢黄酮（圣草酚）除了
在３′位甲基化，还能生成少见的４′位甲基化产物，
其原因可能是因为碳环上存在手性碳；而当 Ａ环上
含有３个相邻羟基（黄芩素、野黄芩素）时，可特异
性生成６位甲基化产物。本研究的酶活检测发现，
ＣｃＯＭＴ１能够催化ＣＣｏＡ生成阿魏酰辅酶 Ａ，表明
其在植物体内可能参与了木质素的生物合成。此外，
ＣｃＯＭＴ１对黄酮和香豆素也具有广谱的催化特性。
尽管ＯＭＴ在高等植物中被广泛鉴定，但是对
于低等陆生植物的苯丙素类、香豆素类和黄酮类
ＯＭＴ研究较少。苔藓植物在植物进化中具有特殊
的地位，处于藻类和维管束植物之间，被称为“非维
管植物”，其细胞壁中含有类木质素化合物［２４］。鉴
定参与木质素生物合成相关的ＯＭＴ，有助于理解木
质素类化合物的起源。本研究为第一次从蛇苔中鉴
定出ＯＭＴ，它可催化一系列的黄酮和苯丙素类化合
物，生成相应的甲氧基化产物，最适底物为槲皮素，
ＣｃＯＭＴ１催化槲皮素产生异鼠李素，这为异鼠李素
２６ 山 东 大 学 学 报 （医 学 版） ５４卷１２期
的生物合成提供了工具酶，也为研究原始陆生植物
中的ＯＭＴ奠定了基础。
参考文献：
［１］ＺｉｎｓｍｅｉｓｔｅｒＨＤ，ＢｅｃｋｅｒＨ，ＥｉｃｈｅｒＴ．Ｂｒｙｏｐｈｙｔｅｓ，ａ
ｓｏｕｒｃｅｏｆｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｙａｃｔｉｖｅ，ｎａｔｕｒａｌｙｏｃｃｕｒｉｎｇｍａｔｅｒｉ
ａｌ？［Ｊ］．ＡｎｇｅｗＣｈｅｍＩｎｔＥｄ，１９９１，３０（２）：１３０１４７．
［２］ＡｓａｋａｗａＹ．Ｒｅｃｅｎｔａｄｖａｎｃｅｓｉｎｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙｏｆｂｒｙｏ
ｐｈｙｔｅｓａｃｅｔｏｇｅｎｉｎｓ，ｔｅｒｐｅｎｏｉｄｓａｎｄｂｉｓ（ｂｉｂｅｎｚｙｌ）ｓｆｒｏｍ
ｓｅｌｅｃｔｅｄＪａｐａｎｅｓｅ，Ｔａｉｗａｎｅｓｅ，ＮｅｗＺｅａｌａｎｄ，Ａｒｇｅｎｔｉｎｅ
ａｎａｎｄＥｕｒｏｐｅａｎｌｉｖｅｒｗｏｒｔｓ［Ｊ］．Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００１，
５６（３）：２９７３１２．
［３］ＳｃｈｅｒＪＭ，ＺａｐｐＪ，ＢｅｃｋｅｒＨ．Ｌｉｇｎａｎｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓｆｒｏｍｔｈｅ
ｌｉｖｅｒｗｏｒｔＢａｚｚａｎｉａｔｒｉｌｏｂａｔａ［Ｊ］．Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００３，
６２（６２）：７６９７７７．
［４］ＪｕｎｇＭ，ＺｉｎｓｍｅｉｓｔｅｒＨＤ，ＧｅｉｇｅｒＨ．Ｎｅｗｔｈｒｅｅａｎｄｔｅ
ｔｒａｏｘｙｇｅｎａｔｅｄｃｏｕｍａｒｉｎｇｌｕｃｏｓｉｄｅｓｆｒｏｍｔｈｅｍｏｓｓｅｓＡｔｒｉ
ｃｈｕｍ ｕｎｄｕｌａｔｕｍ ａｎｄＰｏｌｙｔｒｉｃｈｕｍ ｆｏｒｍｏｓｕｍ［Ｊ］．Ｚ
ＮａｔｕｒｆｏｒｓｃｈＣ：Ｂｉｏｓｃｉ，２０１４，４９（１１１２）：６９７７０２．
［５］ＬｏｕＨＸ，ＬｉＧＹ，ＷａｎｇＦＱ．Ａｃｙｔｏｔｏｘｉｃｄｉｔｅｒｐｅｎｏｉｄａｎｄ
ａｎｔｉｆｕｎｇａｌｐｈｅｎｏｌｉｃｃｏｍｐｏｕｎｄｓｆｒｏｍＦｒｕｌａｎｉａｍｕｓｃｉｃｏｌａ
Ｓｔｅｐｈ．［Ｊ］．ＪＡｓｉａｎＮａｔＰｒｏｄＲｅｓ，２００１，４（２）：８７９４．
［６］ＷｅｌｍａｎＣＨ，ＯｓｔｅｒｌｏｆＰＬ，ＭｏｈｉｕｄｄｉｎＵ．Ｆｒａｇｍｅｎｔｓｏｆ
ｔｈｅｅａｒｌｉｅｓｔｌａｎｄｐｌａｎｔｓ［Ｊ］．Ｎａｔｕｒｅ，２００３，４２５（６９５５）：
２８２２８５．
［７］李波，倪志勇，王娟，等．木质素生物合成关键酶咖啡酸
Ｏ甲基转移酶基因（ＣＯＭＴ）的研究进展［Ｊ］．分子植物
育种，２０１０，８（１）：１１７１２４．
ＬＩＢｏ，ＮＩＺｈｉｙｏｎｇ，ＷＡＮＧＪｕａｎ，ｅｔａｌ．Ａｄｖａｎｃｅｓｏｎ
ｋｅｙｅｎｚｙｍｅｇｅｎｅ（ＣＯＭＴ）ｉｎｖｏｌｖｅｄｉｎｌｉｇｎｉｎｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ
［Ｊ］．ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｌａｎｔＢｒｅｅｄｉｎｇ，２０１０，８（１）：１１７１２４．
［８］张传丽，仲月明，沈丹红，等．植物类黄酮 Ｏ甲基转移酶
研究进展［Ｊ］．西北植物学报，２０１２，３２（６）：１２７４１２８１．
ＺＨＡＮＧＣｈｕａｎｌｉ，ＺＨＯＮＧＹｕｅｍｉｎｇ，ＳＨＥＮＤａｎｈｏｎｇ，ｅｔ
ａｌ．ＲｅｃｅｎｔｐｒｏｇｒｅｓｓｉｎｐｌａｎｔｆｌａｖｏｎｏｉｄＯｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ
［Ｊ］．ＡｃｔａＢｏｔａｎｉｃａＢｏｒｅａｌｉＯｃｃｉｄｅｎｔａｌｉａＳｉｎｉｃａ，２０１２，３２
（６）：１２７４１２８１．
［９］ＷａｇｎｅｒＡ，ＴｏｂｉｍａｔｓｕＹ，ＰｈｉｌｉｐｓＬ，ｅｔａｌ．ＣＣｏＡＯＭＴ
ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎｍｏｄｉｆｉｅｓｌｉｇｎｉｎｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｉｎＰｉｎｕｓｒａｄｉａｔａ
［Ｊ］．ＰｌａｎｔＪ，２０１１，６７（１）：１１９１２９．
［１０］赵华燕，魏建华，路静，等．利用反义ＣＣｏＡＯＭＴ基因培
育低木质素含量毛白杨的研究［Ｊ］．自然科学进展，
２００４，１４（９）：１０６７１０７１．
ＺＨＡＯＨｕａｙａｎ，ＷＥＩＪｉａｎｈｕａ，ＬＵＪｉｎｇ，ｅｔａｌ．Ｒｅｓｅａｒｃｈ
ｏｎｆｏｓｔｅｒｉｎｇＰｏｐｕｌｕｓｔｏｍｅｎｔｏｓａｗｉｔｈｌｏｗｌｉｇｎｉｎｃｏｎｔｅｎｔ
ｂｙａｎｔｉｓｅｎｓｅｎｕｃｌｅｉｃＣＣｏＡＯＭＴｇｅｎｅ［Ｊ］．ＰｒｏｇＮａｔｕｒａｌ
Ｓｃｉ，２００４，１４（９）：１０６７１０７１．
［１１］黄春琼，刘国道，郭安平．反义 ＣＣｏＡＯＭＴ基因调控烟
草木质素的生物合成［Ｊ］．安徽农业科学，２００８，３６
（１９）：８０２６８０２７．
ＨＵＡＮＧＣｈｕｎｑｉｏｎｇ，ＬＩＵＧｕｏｄａｏ，ＧＵＯＡｎｐｉｎｇ．Ｌｉｇ
ｎｉｎｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓｒｅｇｕｌａｔｅｄｂｙａｎｔｉｓｅｎｓｅＣＣｏＡＯＭＴｇｅｎｅ
ｉｎｔｏｂａｃｃｏ［Ｊ］．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＡｎｈｕｉＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ，
２００８，３６（１９）：８０２６８０２７．
［１２］ＦｅｒｅｒＪＬ，ＺｕｂｉｅｔａＣ，ＤｉｘｏｎＲＡ，ｅｔａｌ．Ｃｒｙｓｔａｌｓｔｒｕｃ
ｔｕｒｅｓｏｆａｌｆａｌｆａｃａｆｅｏｙｌｃｏｅｎｚｙｍｅＡ３ＯＭｅｔｈｙｌｔｒａｎｓ
ｆｅｒａｓｅ［Ｊ］．ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌ，２００５，１３７（３）：１００９１０１７．
［１３］ＩｂｄａｈＭ，ＺｈａｎｇＸＨ，ＳｃｈｍｉｄｔＪ，ｅｔａｌ．ＡｎｏｖｅｌＭｇ２＋
ｄｅｐｅｎｄｅｎｔＯＭｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｉｎｔｈｅｐｈｅｎｙｌｐｒｏｐａｎｏｉｄ
ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍｏｆＭｅｓｅｍｂｒｙａｎｔｈｅｍｕｍｃｒｙｓｔａｌｉｎｕｍ［Ｊ］．Ｊ
ＢｉｏｌＣｈｅｍ，２００３，２７８（４５）：４３９６１４３９７２．
［１４］ＬｕｋａｃˇｉｎＲ，ＭａｔｅｒｎＵ，ＳｐｅｃｋｅｒＳ，ｅｔａｌ．Ｃａｔｉｏｎｓｍｏｄｕ
ｌａｔｅｔｈｅｓｕｂｓｔｒａｔｅｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙｏｆｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｃｌａｓｓＩ
ＯｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｆｒｏｍＡｍｍｉｍａｊｕｓ［Ｊ］．ＦＥＢＳＬｅｔ，
２００４，５７７（３）：３６７３７０．
［１５］ＲａｅｓＪ，ＲｏｈｄｅＡ，ＣｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎＪＨ，ｅｔａｌ．Ｇｅｎｏｍｅｗｉｄｅ
ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｌｉｇｎｉｆｉｃａｔｉｏｎｔｏｏｌｂｏｘｉｎＡｒａｂｉｄｏｐ
ｓｉｓ［Ｊ］．ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌ，２００３，１３３（３）：１０５１１０７１．
［１６］ＬｅｅＹＪ，ＫｉｍＢＧ，ＣｈｏｎｇＹ，ｅｔａｌ．Ｃａｔｉｏｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ
Ｏｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｓｆｒｏｍｒｉｃｅ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔａ，２００８，２２７
（３）：６４１６４７．
［１７］ＷｉｄｉｅｚＴ，ＨａｒｔｍａｎＴＧ，ＤｕｄａｉＮ，ｅｔａｌ．Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｃｈａｒ
ａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆｔｗｏｎｅｗｍｅｍｂｅｒｓｏｆｔｈｅｃａｆｅｏｙｌＣｏＡ
Ｏｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｌｉｋｅｇｅｎｅｆａｍｉｌｙｆｒｏｍｖａｎｉｌａｐｌａｎｉｆｏ
ｌｉａ，ｒｅｖｅａｌｓａｎｅｗｃｌａｓｓｏｆｐｌａｓｔｉｄｌｏｃａｌｉｚｅｄＯｍｅｔｈｙｌ
ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｓ［Ｊ］．ＰｌａｎｔＭｏｌＢｉｏｌ，２０１１，７６（６）：４７５４８８．
［１８］ＴｓａｉＣＪ，ＨａｒｄｉｎｇＳＡ，ＴｓｃｈａｐｌｉｎｓｋｉＴＪ，ｅｔａｌ．Ｇｅｎｏｍｅ
ｗｉｄｅａｎａｌｙｓｉｓｏｆｔｈｅｓｔｒｕｃｔｕｒａｌｇｅｎｅｓｒｅｇｕｌａｔｉｎｇｄｅｆｅｎｓｅ
ｐｈｅｎｙｌｐｒｏｐａｎｏｉｄｍｅｔａｂｏｌｉｓｍｉｎＰｏｐｕｌｕｓ［Ｊ］．ＮｅｗＰｈｙ
ｔｏｌ，２００６，１７２（１）：４７６２．
［１９］ＸｕＲＸ，ＧａｏＳ，ＺｈａｏＹ，ｅｔａｌ．Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａ
ｔｉｏｎｏｆａＭｇ（２＋）ｄｅｐｅｎｄｅｎｔＯｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｗｉｔｈ
ｃｏｕｍａｒｉｎａｓｐｒｅｆｅｒｅｄｓｕｂｓｔｒａｔｅｆｒｏｍｔｈｅｌｉｖｅｒｗｏｒｔＰｌａｇｉｏ
ｃｈａｓｍａａｐｐｅｎｄｉｃｕｌａｔｕｍ［Ｊ］．ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌＢｉｏｃｈｅｍ，
２０１６，１０６：２６９２７７．
［２０］许瑞雪．苔类植物黄酮和苯丙素类化合物氧甲基转移
酶功能研究［Ｄ］．济南：山东大学，２０１６．
［２１］ＬｉＬ，ＺｈｏｕＹ，ＣｈｅｎｇＸ，ｅｔａｌ．Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌｍｏｄｉｆｉｃａ
ｔｉｏｎｏｆｍｕｌｔｉｐｌｅｌｉｇｎｉｎｔｒａｉｔｓｉｎｔｒｅｅｓｔｈｒｏｕｇｈｍｕｌｔｉｇｅｎｅ
ｃｏｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ［Ｊ］．ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ，２００３，
１００（８）：４９３９４９４４．
［２２］ＸｕＲＸ，ＺｈａｏＹ，ＧａｏＳ，ｅｔａｌ．Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａ
ｔｉｏｎｏｆａｐｌａｓｔｉｄａｌｃａｔｉｏｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔＯｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ
ｆｒｏｍ ｔｈｅｌｉｖｅｒｗｏｒｔＰｌａｇｉｏｃｈａｓｍａａｐｐｅｎｄｉｃｕｌａｔｕｍ［Ｊ］．
Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２０１５，１１８：３３４１．
［２３］ＨａｍｂｅｒｇｅｒＢ，ＥｌｉｓＭ，ＦｒｉｅｄｍａｎｎＭ，ｅｔａｌ．Ｇｅｎｏｍｅ
ｗｉｄｅａｎａｌｙｓｅｓｏｆｐｈｅｎｙｌｐｒｏｐａｎｏｉｄｒｅｌａｔｅｄｇｅｎｅｓｉｎＰｏｐｕ
ｌｕｓｔｒｉｃｈｏｃａｒｐａ，Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａ，ａｎｄＯｒｙｚａｓａｔｉｖａ：
ｔｈｅＰｏｐｕｌｕｓｌｉｇｎｉｎｔｏｏｌｂｏｘａｎｄｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎａｎｄｄｉｖｅｒｓｉｆｉ
ｃａｔｉｏｎｏｆａｎｇｉｏｓｐｅｒｍ ｇｅｎｅｆａｍｉｌｉｅｓ［Ｊ］．ＣａｎＪＢｏｔ，
２００７，８５（１２）：１１８２１２０１．
［２４］ＬｉｇｒｏｎｅＲ，ＣａｒａｆａＡ，ＤｕｃｋｅｔＪＧ，ｅｔａｌ．Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏ
ｃｈｅｍｉｃａｌｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｌｉｇｎｉｎｒｅｌａｔｅｄｅｐｉｔｏｐｅｓｉｎｃｅｌｗａｌｓ
ｉｎｂｒｙｏｐｈｙｔｅｓａｎｄｔｈｅｃｈａｒａｌｅａｎａｌｇａＮｉｔｅｌａ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ
ＳｙｓｔＥｖｏｌ，２００８，２７０（３４）：２５７２７２．
（编辑：相峰）