全 文 ：首都师范大学学报(自然科学版)第 25 卷　第 2期
2004 年 6 月
Journal of Capital Normal University
(Natural Science Edition)
Vol.25 , No.2
June　2004
仙鹤藓 RNA提取不同方法比较
欧阳浩淼1, 2　夏桂先2　刘祥林1＊
(1 首都师范大学生物系　北京　100037;2 中国科学院微生物所植物生物技术开放实验室 ,北京　100080)
摘 要
　　用从雾灵山寒冷干燥生境中采集到的仙鹤藓 ,建立可控制的“干燥-复水”工作体系 ,用于寻找与耐旱相关的
差异表达基因 , 为进行植物抗旱基因工程提供可以利用的目的基因.总 RNA 的分离是进行分子操作的关键和基
础.然而 , 仙鹤藓材料以其组分的特殊性造成了提取组织总 RNA的困难.同时干燥和复水处理过的材料 , 由于次生
代谢物增多 ,严重的影响到总 RNA的提取和质量.本文通过探索行之有效的材料处理方法 , 比较不同提取藓类植
物总 RNA 方法的优劣 ,提供可供参考的总 RNA提取方法.
关键词:仙鹤藓 , 干旱复水材料 , RNA提取.
中图分类号:Q 552;Q949.35
收稿日期:2003-04-01
＊通讯联系人.
　　全世界有苔藓植物23 000种 ,分布十分广泛 ,中
国有 2 200种 ,占全世界的 9.1%.在漫长的生物进
化历程中 ,苔藓植物形成了一套独特的适应恶劣环
境的机制.在干燥的极端生态环境中 ,苔藓植物仍然
能够生存 ,可以生长在裸岩上 ,促进岩石风化成为土
壤.我国 2 000多米海拔高度的北方山区 ,由于长年
寒冷 、局部干旱等气候条件 ,常可见到一种被称为
“冻原”(tundra)的植被类型 ,其显著特征之一是群落
内的苔藓植物十分发达.苔藓也成为极地(南极)地
带的优势植被类群(李学东等 ,1995).干旱在我国普
遍发生 ,Brown等(1998)指出 ,水资源正成为包括中
国在内的部分国家制约农业发展的重要因素.随着
分于生物学的发展 ,能否利用生物技术来改良农作
物的抗旱性 ,引起越来越多科学家的关注.藓类植物
由于其独特的抗旱能力 ,成为研究植物抗旱机理和
相关基因克隆的模式植物.而针对抗旱植物而进行
的多种处理的总 RNA 提取是进行点杂交 、Northern
杂交 、RT-PCR、建立 cDNA文库以及从分子生物学的
角度研究抗旱植物的必经步骤.藓类物质的 RNA提
取难点在于藓类中普遍含有萜类 ,包括单萜 、倍半萜
及双萜.同时固醇类的 campesterol 、豆固醇 、和谷固
醇也十分常见.此外 ,还含有一种结构十分独特的环
状双二苄基醚类 、少量的三萜苯烷型C30 、落叶酸.研
究显示 ,萜类化合物和 RNase会分别造成 RNA的化
学降解和酶解 ,而藓类中经常含有的黄酮醇类物质
也是影响 RNA提取的物质 ,使提取的 RNA 易于降
解.此外 ,干燥处理以及复水处理的仙鹤藓材料 ,经
过再处理后 ,酚类物质的含量随之增加.在植物匀浆
时 ,酚类物质会释放出来 ,氧化后使匀浆液变为褐
色 ,被氧化后的酚类化合物能与 RNA 稳定的结合 ,
导致总 RNA 提取产量降低或降解.此外大量的多
糖 、色素 、脂类 、酚类等杂质 ,形成难溶的胶状物 ,与
RNA共沉淀下来 ,也会造成提出的 RNA 不仅量少 ,
而且经常会出现部分降解.因此能否有效的去除多
糖 、萜类物质 、酚类物质以及 RNase和干燥复水处理
材料的其他代谢产物 ,是提出高质量藓类 RNA的关
键.本文通过探索干燥材料和复水材料中 RNA 提
取 ,得出提取仙鹤藓总 RNA的较理想方案.
1　材料和方法
1.1　材料
实验植物材料仙鹤藓(Atrichum undulatum),取
材自雾灵山寒冷干燥地区.
1.2　植物组织培养
采用无菌培养的方法 , 用 MS 盐培养基和
BENECK培养基对材料进行无菌培养 ,21℃,光照 14
h ,黑暗 10 h.
1.3　材料处理及取材方法
正常处理:直接取出新鲜材料放入液氮中冻存.
干燥处理:取新鲜材料若干 ,放入培养皿中 ,在培养
皿中垫上吸水纸 ,并敞开盖在超净工作台 ,无菌风
吹.干燥 1 h 后 ,把干燥材料一半直接用液氮冻起
来.复水处理:把另一半干燥处理的材料又重新放回
原来的培养基中 ,在 21℃光照培养箱中 ,让它继续
生长 ,6 h后放入液氮中冻存.
1.4　RNA提取的不同方法
1.4.1　CsCI超离提取植物总 RNA
称取 1 g 植物材料在液氮中研磨匀浆.磨碎的
组织转入 50mL 离心管中 ,待液氮蒸发以后 ,按每克
组织加入 10mL提取缓冲液 ,振荡混匀.12℃, 12 000
g 离心 10min ,上清转入另一离心管 ,加入 0.1 倍体
积的 20%十二烷基氨酸钠 ,65℃加热 2 min.每毫升
液体加入 0.1 g CsCl ,并使之溶解.用 12.5mL 离心管
中加入 9 mL CsCl溶液(5.7mol L 垫层 ,然后加入约
4 mL的组织液 ,封口后用 Ti90转子 4 000 rpm(1.1×
10
5
g)离心16 h.小心移走上清 ,倒置管子 ,倒去剩余
液体.把沉淀转入 1.5mL灭菌离心管中 ,加入 TE缓
冲液或 DEPC 处理水 ,用枪头反复抽吸 ,使之溶解.
加入 1 10体积的 3mol L pH5.2的 NaAc和 2.5倍体
积无水乙醇 , -20℃至少沉淀 2 h.70%乙醇清洗沉
淀2次 ,晾干乙醇后溶于 DEPC处理水中.
1.4.2　TRIZOL提总 RNA(进口)
称取 100 mg 植物材料 , 研磨 ,把样品加入到 1
mL TRIZOL 中.室温温育匀浆后的样品 5min.12 000
g ,4℃离心 10 min ,用移液管把上清转移到新离心管
中.加入 200μL氯仿 ,把盖子合紧 ,用手强烈振荡管
子15 s ,室温温育2 ～ 3min ,12 000 g ,4℃离心15min.
离心以后 ,混合物分离成一个红色的酚仿层 ,一个中
间相 ,和一个无色的液相.RNA完全存在于液相当
中.液相的体积大约是600μL.转移液相到一个新管
中 ,加入 0.5 mL 异丙醇 1 mL Trizol.室温育样品 10
min , 12 000 g ,4℃离心10min.移走上清 ,立刻用至少
1mL 的 75%乙醇洗两次.快速干燥 RNA ,用 DEPC
处理水溶解总 RNA保存在-70℃.
1.4.3　TRIZOL提取总 RNA(国产)
提取方法:类似于 TRIZOL进口.
1.4.4　异硫氰酸胍
取 1 g 左右植物材料在液氮中研磨成粉状倒入
50mL离心管中 ,加入 3 mL 4 mol L的异硫氰酸胍溶
液 ,冰浴 , 震荡.加 0.3 mL 2 mol L NaAc(pH4.0 ～
5.0),振荡 ,加入 3mL水饱和酸酚 ,震荡 ,加入 1mL
氯仿 ,震荡 ,置于冰上 20 min.4℃ 8 000 rpm 离心 13
min ,吸取上清 ,加入 2.5倍体积乙醇 , -70℃沉淀 1
h.4℃6 000 rpm离心 13 min ,沉淀重悬于 1mL 4mol
L Li Cl溶液中 ,并转移至 1.5mL离心管 ,置于冰上
10min ,然后 13 000 rp离心 15 min.沉淀重新溶解于
0.4 mL DEPC处理水中 ,加入 1倍氯仿(或 1 2体积
氯仿和 1 2体积的酸酚)抽提 ,混合物 10 000 rpm 离
心 5min.上清液(大约 400μL)加入 0.1倍体积的 3
mol L NaAc和2倍体积乙醇(800μL), -70℃沉淀30
min.13 000 rpm离心 15 min ,70%乙醇洗 ,空干.沉淀
溶于 40 ～ 100μL DEPC处理水中 , -70℃保存.
1.4.5　热硼酸法
取 1 g 材料于液氮中研磨成粉末.加入 4 mL 预
热 RNA抽提缓冲液于另一预热研钵中 ,倒入粉末 ,
继续研磨 2min ,匀浆移入 4支 1.5mL离心管.每管
加入 20μg 蛋白酶K.130 rpm 42℃振荡1.5 h ,每管加
入 160μL mol L KCl溶液 ,置冰上 1 h.13 000 rpm 4℃
离心 20min ,转移上清于新离心管 ,每管 1.2 mL.每
管加入 300 μL 8 mol L LiCl , 13 000 rpm 4℃离心 2
min ,沉淀用 0.5 mL 2 mol L LiCl洗 3 次.13 000 rpm
离心 10min ,用 10mmol L Tris.HCl pH7.5悬浮沉淀 ,
加 1mol L KAc至终浓度 200mmol L KAc ,置冰上 15
min.13 000 rpm ,4℃离心 15 min.上清用等体积酸酚
和氯仿各抽提一次 , 加 2.5 倍体积的无水乙醇 ,
-20℃沉淀 3 h.13 000 rpm , 4℃离心 10 min 沉淀
RNA ,总 RNA 用 70%乙醇洗 ,室温干燥 ,溶于 DEPC
处理水中 , -70℃待用.
1.5　RNA紫外分光分析
用 1μL RNA样品 ,加 DEPC处理水 1 000μL ,置
于石英比色杯中 ,用紫外分光光度计测定 260 nm 与
280 nm 处吸收峰的OD值.
1.6　RNA非甲醛琼脂糖凝胶电泳的测定
把电泳槽和梳子先用 10%SDS 浸泡过夜 ,无菌
水洗.10%H2O 2浸泡 2 h.无菌水洗.用 0.8%的琼脂
糖-TAE胶 ,电泳1 h.电泳结束后 ,紫外灯下观察 ,拍
摄记录试验结果.
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2　结果与讨论
2.1　不同提取方法总 RNA紫外比色结果比较:
通过对几种 RNA提取方法的比较(参见表 1),
TRIZOL 相对快速 ,然而去蛋白和去糖不充分 , RNA
与糖共沉淀 ,形成难溶胶状物质.异硫氰酸胍法是时
间长 ,需要材料量大 ,得率低.针对多酚材料 ,不能有
效地去除酚的干扰 , 2∶1 不明显 , OD260 OD280不是很
理想 ,不太适合大规模提取仙鹤藓 RNA.超离提取
植物总 RNA优点是提取方法简单 ,提取 RNA 量大 ,
却不能有效地抑制仙鹤藓材料 RNA的降解.相对而
说 ,热硼酸法提取所得的 RNA产率高 ,OD260 OD280比
值高 ,RNA提取结果比较理想.
表 1　处理复水材料的各种方法比较
提取方法 材料 g 时间 h OD260 OD280 OD260 OD230 含量(μg) 产率(μg 克材料)
TRIZOL进口 0.1 4 1.85～ 1.65 ～ 1.6 20～ 50 200～ 500
TRIZOL国产 0.1 2 1.50～ 1.65 — 8～ 15 80～ 150
氯化铯超速离心 1 48 1.90～ 2.1 >2.0 50～ 170 50～ 170
热硼酸法 0.5 48 1.95～ 2.0 >2.0 60～ 140 120～ 280
异硫氰酸胍法 1 48 1.40～ 2.0 1.6～ 2.0 15～ 30 15～ 30
提总 RNA 试剂盒Ⅰ 0.1 4 — — <5 —
提总 RNA 试剂盒Ⅱ 0.1 4 — — <5 —
　　注:以上均指仙鹤藓提取 RNA 的实验结果
2.2　总 RNA电泳图象结果
用不同方法提取 RNA的电泳结果如图 1所示.
从图中可知 ,几种提取方法所提 RNA28S 和 18S 条
带完整 ,降解很少.相对来说 ,热硼酸法和异硫氰酸
胍法的 RNA 带型更为清晰 ,杂带很少 ,并在-70℃
较为长久.
图 1　不同方法提取NRA带型比较
a:热硼酸法　b:异硫氰酸胍法　c:TRIZOL(进口)　d:TRIZOL(国产)
e:氯化铯超速离心　f:提总 RNA试剂盒Ⅰ 　g:提总 RNA试剂盒Ⅱ
2.3　不同方法提取总 RNA效果分析
认为热硼酸法是最适合提取仙鹤藓总 RNA的
一种方法 ,特点是去蛋白杂质干净 ,带型好 ,量大.热
硼酸缓冲液中含有的 DTT 通过打断多酚氧化酶的
二硫键而使之失活 ,有效的防止了酚类的氧化.硼酸
可以和酚类物质依靠 H 键形成复合物 ,从而抑制了
酚类物质的氧化及其与 RNA的结合 ,消减了缓冲液
的褐色.蛋白酶有效的抑制了蛋白对 RNA提取的干
扰.LiCl沉淀 RNA以及不断的酚仿抽提可以除去一
些多糖 ,低浓度的乙醇进一步沉淀了多糖的干扰 ,纯
化了 RNA样品.
综上所述 ,提取藓类植物的干旱及复水处理过
程中 ,材料处理是极为重要的环节 , 直接影响到
RNA提取的质量.在几种不同的 RNA 的提取方法
中 ,热硼酸法是比较适合于藓类干燥材料的一种
RNA提取的方法 ,其特点是提取量大 ,能有效抑制
萜类物质 、酚类物质以及 RNAse 和干燥藓类 RNA提
取的其他代谢产物对干燥和复水处理 RNA的影响.
参 考 文 献
1 　萨姆布鲁克 J ,费里奇 , E F ,曼尼阿斯蒂.分子克隆-实验指南.第 2 版 ,北京:科学出版社 , 1992
2 　F奥斯伯 , R布伦特 , R E 金斯顿 ,等.精编分子生物学实验指南.北京:科学出版社 , 1998.120 ～ 126
59第 2期 欧阳浩淼等:仙鹤藓 RNA提取不同方法比较
3 　李宏 , 王新力.植物组织 RNA的提取的难点和对策.生物技术通报 , 1999 , 1
4 　刘家熙 , 李学东 , 陈阜东.Three species of bryophytes from the Fildes Peninsula of Antaretica under the observation of SEM.
Chinese Journal of Polar Science , 1998 , 2:154～ 156
5 　李学东 , 刘家熙 ,胡东 , 等.南极长城站及附近岛屿南极发草的形态特征与分布.极地研究 , 1996:61 ～ 64
6 　陈阜东 , 刘家熙.苔藓植物离体培养和多倍体研究.植物学通报 , 1994 , S1:90
7 　Chomeczynski P , Sacchi N.Single-step Method of RNA Isolation by Acidguanidinium Thiocyanate-phenol-chloroform Extraction.
Anal Biochem , 1987 , 162:156～ 159
8 　Jin zhou Dong , David.A reliable method for extraction of RNA from various conifer tissues.Plant Cell Rep , 1996 , (15):516 ～ 521
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phenolic compounds.Plant Physiol , 1977 , 60:543 ～ 547
10　Graham G C.A method for extraction of total RNA from Pinus radiata and other conifers.Plant Mol Biol Reptr , 1993 , 11:32～ 37
11　Chang S , Puryear J , Cairney J.A simple and efficient method for isolating RNA from pine tress.Plant Mol Biol Reptr , 1993 , 11:113
～ 116
Dehydration Rehydration Treat in Atrichum undulatum and
Comparison with Different Methods on RNA Extraction
Ouyang Haomiao
1 , 2　Xia Guixian2　Liu Xianglin 1
(1 Biology department , Capital Normal University , Beijing　100037;2 Institute of Microbilogy of Chinese Academy of Science , Beijing　100037)
Abstract
Due to unique structure and strong resurrection ability to survive sever water stress in Atrichum undulatum tissue
from Wuling Mountain , an controlled system of dehydration rehydrationmaterial was constructed , to seek the desiccation-
tolerance genes.While the abundant phenolic component and other secondary constitutes in Atrichum undulatum tissue
usually induced RNA′s degration which prevented RNA extraction.By comparison different methods for RNA extraction
and some improved methods , the RNA extraction methods of dehydration rehydration material were discussed in Atrichum
undulatum tissue.
Key words:Atrichum undulatum , dehydration rehydration material , RNA extraction.
60 首都师范大学学报(自然科学版) 2004年