全 文 :植物学报 Chinese Bulletin of Botany 2013, 48 (6): 651–657, www.chinbullbotany.com
doi: 10.3724/SP.J.1259.2013.00651
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收稿日期: 2012-09-12; 接受日期: 2012-12-27
* 通讯作者。E-mail: huruoyang@aliyun.com
仙鹤藓的孢子萌发及愈伤组织诱导
吴小凤, 胡若洋*, 李学东
首都师范大学生命科学学院, 北京 100048
摘要 通过对采自河北雾灵山海拔1 500 m的仙鹤藓(Atrichum undulatum)的孢子萌发以及原丝体发育的观察, 发现仙鹤藓
孢子无休眠现象, 孢子接种3天左右萌发; 其原丝体发育分为绿丝体和轴丝体两个阶段。扩大培养实验结果表明, 仙鹤藓茎
叶体在添加2%葡萄糖的MS培养基上, 置于25°C/20°C、14小时光照/10小时黑暗、36 μmol·m–2·s–1条件下培养, 产生新生
茎叶体最多, 且茎叶体长势最好, 可以获得大量无菌材料。仙鹤藓愈伤组织诱导实验显示, 形成愈伤组织的最佳培养基为添
加2%葡萄糖和1.0 mg·L–1 6-BA的MS培养基。
关键词 仙鹤藓, 愈伤组织, 孢子萌发
吴小凤, 胡若洋, 李学东 (2013). 仙鹤藓的孢子萌发及愈伤组织诱导. 植物学报 48, 651–657.
苔藓是地球上古老的非维管陆生植物, 它作为从
水生到陆生的过渡生物类群, 对其研究具有重大的系
统进化意义。但相对于种子植物, 苔藓类植物具有更
为复杂的生活史, 造成对苔藓类植物的组织培养以及
再生体系建立比较困难, 导致苔藓植物研究远落后于
种子植物。
我国对苔藓植物的认识和利用较早, 但缺少系统
深入的培养研究。1990年, 李文安(1990)首次报道了
地钱(Marchantia polymorpha)在离体条件下无性繁
殖、脱分化及再分化的研究。陈阜东和刘家熙(1994)
对葫芦藓(Funaria hygrometrica)的离体培养和多倍
化进行了研究。张朝晖等(1998)采用液体培养基研究
了pH值对贵州喀斯特生境苔藓植物孢子萌发及原丝
体生长的影响。刘晓红(1998)用组织培养的方法探讨
了细胞分裂素和钙调蛋白专一性抑制剂对葫芦藓发
育过程的影响。陈蓉蓉等(1998)分析了钙离子浓度对
喀斯特生境苔藓孢子萌发及原丝体生长的影响。赵建
成等 (2002)对红蒴立碗藓 (Physomitrium eurysto-
mum)、无疣墙藓 (Tortula mucronifolia)、钟帽藓
(Venturiella sinensis)等10种藓类植物的孢子萌发及
原丝体发育过程进行了研究。Gang等(2003)报道了
几种药用苔藓植物的培养及生物学特性, 其中包括部
分仙鹤藓孢子萌发原丝体的探索性工作。
愈伤组织可以提供大量比较纯净的实验材料, 有
关苔藓植物愈伤组织诱导的研究始于1950–1960年。
Allsopp(1957)率先成功诱导出苔类的愈伤组织。
Ward(1960)则首次诱导了藓类的愈伤组织。1962年,
Machlis和Doyle(1962)培养西亚立碗藓 (Hyscomi-
trium coorgense)配子体的叶和颈卵器壁并获得愈伤
组织。Takami等(1988)诱导角苔类的愈伤组织, 并且
建立了悬浮培养体系。Sokal等(1997)从波叶仙鹤藓
(Atrichum undulatum)、丛生真藓 (Ryum caespiti-
cium)和金发藓及提灯藓(Plagiomnium affine)的原丝
体培育出配子体。同年, Kowalczyk等(1997)也从苔类
的大萼苔(Cephalozia biscupidata)诱导形成愈伤组
织, 并且再生出配子体。根据Felix于1994年的统计,
苔藓植物中共有31种苔类、18种藓类和1种角苔类成
功诱导出了愈伤组织。此外, 已有27种苔类、16种藓
类和1种角苔类成功建立了细胞悬浮培养体系。然而,
有关苔藓植物组织培养研究远不如其它高等植物细
胞培养研究得深入, 所取得的成果仍然不能充分满足
各研究领域的需要(Felix, 1994)。
仙鹤藓(Atrichum undulatum)是金发藓科(Poly-
trichaceae)的较小属种, 在苔藓植物当中属于结构较
为复杂、演化水平较高的类型。仙鹤藓为主要药用苔
藓植物, 具有止血消炎的作用(王振杰等, 2008)。据我
们观察, 雾灵山生长的仙鹤藓对寒冷和干燥具有很强
的抵抗能力, 可能蕴含重要的抗性资源, 并且其配子
·技术方法·
652 植物学报 48(6) 2013
体染色体数目为7, 远远少于应用较多的模式植物小
立碗藓(Physcomitrella patens)的27条染色体(Reski
et al., 1994)。目前尚未见其组织培养方面较全面系统
的报道。本研究建立了针对仙鹤藓的增殖培养体系,
通过该体系可以简便高效地获得大量无菌材料, 同时
还建立了愈伤组织诱导再生体系, 这为进行仙鹤藓基
因组学及蛋白质组学研究奠定了系统的实验基础。
1 植物材料
1.1 材料
本研究所用材料仙鹤藓(Atrichum undulatum (Hedw.)
P. Beauv)取自河北雾灵山(40°34′N, 117°28′E)海拔
约1 500 m的林缘山坡湿土层。采集时选取整体健壮、
孢蒴饱满且色泽深绿的植株。将材料连同其下层土壤
取下, 密闭于保鲜袋, 置于4°C冰箱中保存备用。
1.2 材料表面消毒
选取健康成熟的仙鹤藓孢蒴进行消毒。先用无菌蒸馏
水清洗材料5次, 每次3分钟; 再用75%乙醇消毒5秒,
用无菌蒸馏水清洗 5次 , 每次 1分钟 ; 最后用
0.05%HgCl2消毒120秒, 用无菌蒸馏水清洗5次, 每
次1分钟。
2 培养基成分与培养条件
2.1 无菌接种培养基
将消毒并洗净后的材料置于无菌蒸馏水中, 剥离蒴
壁, 制成适当浓度的孢子悬浊液, 在无菌条件下接种
于Beneke培养基(200 mg·L–1NH4NO3, 100 mg·L–1
MgSO4·7H2O, 100 mg·L–1KH2PO4, 100 mg·L–1
CaCl2, FeCl3·6H2O微量)上。
2.2 愈伤组织诱导的激素类型及组合
初步筛选愈伤组织诱导培养基以MS(Murashige and
Skoog, 1962)及MS+40 g·L–1葡萄糖为基本培养基,
并分别附加相同浓度(1 mg·L–1)的6-BA、2,4-D、IAA、
IBA、NAA、KT。经过大量筛选实验后, 确定选用不
同浓度的6-BA、2,4-D激素组合, 共设置25个组合,
进一步诱导愈伤组织。所有固体培养基均附加6 g·L–1
琼脂, 灭菌前pH值为5.8–5.9。
2.3 孢子萌发培养条件
将无菌条件下接种在Beneke培养基上的孢子悬浊液
置于25°C/20°C昼夜变温、14小时光照/10小时黑暗、
36 μmol·m–2·s–1光强下培养。定期观察并记录生长情
况。
2.4 增殖培养条件
以无菌条件下由孢子萌发得到的原丝体为材料, 破碎
成2 mm左右的匀浆片段, 分别接种在含有不同浓度
葡萄糖的增殖培养基上, 置于与孢子萌发相同的培养
条件下培养。定期观察并记录生长情况。
2.5 愈伤组织诱导培养
将前期增殖培养获得的仙鹤藓材料, 分别接种于含有
相同浓度或不同浓度的不同激素组合的脱分化培养
基上, 置于与孢子萌发相同的培养条件下培养。定期
观察并记录生长情况。
3 结果与结论
3.1 孢子萌发培养
接种第1天, 孢子吸水膨胀。接种第2天, 孢子内部有
叶绿体出现(图1A)。接种第3天, 叶绿体移至细胞核周
围, 孢子壁向一侧突起, 孢子呈不均质, 同时细胞核
分裂为二, 在孢子内形成横向壁。4天左右, 孢子分裂
为绿丝体和轴丝体原始细胞(图1B), 很少萌发出初生
假根。
培养5–6天, 绿丝体原始细胞横分裂(图1C), 产
生绿丝体基原细胞和绿丝体母细胞, 轴丝体原始细胞
则分裂(图1D)为轴丝体基原细胞和轴丝体母细胞。绿
丝体母细胞的顶端细胞不断进行横分裂, 形成单列细
胞不分枝的丝状体(图1E), 非顶端细胞的任一细胞,
向侧方斜向分裂, 产生出分枝细胞(图1F)。顶端细胞
也可发生斜向分裂产生出轴丝体和顶端假根(图1G)。
轴丝体母细胞经连续的横分裂(图1H)或斜分裂(图1I),
形成轴丝体系统(图1J, K)及假根系统(图1L)。
3.2 增殖培养
将材料放置在含有不同浓度葡萄糖的Beneke和MS
培养基上进行继代培养, 大约1周开始出现原丝体,
随着原丝体的增多, 约15天后发育成1株新的茎叶
吴小凤等: 仙鹤藓的孢子萌发及愈伤组织诱导 653
图1 仙鹤藓孢子萌发和原丝体发育
(A) 孢子; (B) 绿丝体原始细胞和轴丝体原始细胞; (C), (D) 绿丝体原始细胞和轴丝体原始细胞横分裂; (E) 绿丝体顶端细胞横分裂
为单列细胞不分枝丝状体; (F) 绿丝体非顶端细胞斜向分裂产生分枝细胞; (G) 绿丝体分化出顶端假根; (H) 轴丝体母细胞进行横分
裂; (I) 轴丝体母细胞进行斜分裂; (J) 绿丝体顶端细胞分化成轴丝体; (K) 轴丝体两细胞间细胞接触面呈“球面接触”; (L) 丛生的假
根。Bar=50 μm
Figure 1 Spore germination and protonema development of Atrichum undulatum
(A) Spore; (B) The original cell of the chloronemata and caulonema; (C), (D) The cross separatist for the original cell of chloro-
nemata and caulonema; (E) The apical cell of the chloronemata transversely divides into single-row cells unbranched filaments;
(F) The non-apical cell of the chloronemata obliquely divides into branched cells; (G) The chloronemata differentiates into the top
rhizoid; (H) The caulonema metrocyte undergoes transverse fission; (I) The caulonema metrocyte undergoes oblique fission; (J)
The apical cells of the chloronemata differentiate into the caulonema; (K) The contact surface for the intercellular cells of the
caulonema presents spherical contact; (L) Cluster rhizoids. Bar=50 μm
表1 葡萄糖浓度对仙鹤藓新生茎叶体数目的影响
Table 1 Number of new leafy gametophyte of Atrichum undulatum in different concentrations of glucose
Glucose concentration (%) 0 0.5 1.0 2.0 4.0
Beneke 4±1 6.33±1.53 7.67±1.53 11.67±0.57 0
MS 11.33±1.53 20.67±2.08 38±1 56±2 0
体。产生新茎叶体的个数以及长势因培养基种类和葡
萄糖浓度不同而异(表1; 图2)。实验结果表明, 在一
定浓度范围内, 葡萄糖可促进原丝体生长。随着葡萄
糖浓度的升高, 原丝体生长更旺盛, 产生的新茎尖数
目也越多; 且葡萄糖浓度越高, 茎叶体颜色越绿, 植
株更茁壮。
3.3 组织培养
3.3.1 愈伤组织诱导激素筛选
将材料放在含有不同激素的MS脱分化培养基上进行
继代培养, 大约7天左右, 所有处理组均长出新的原
丝体。21天后, 在含有6-BA的脱分化培养基上, 原丝
654 植物学报 48(6) 2013
图2 不同浓度葡萄糖对仙鹤藓生长状况的影响
(A)–(E) Beneke培养基, 葡萄糖浓度分别为0 (A)、0.5% (B)、1.0% (C)、2.0% (D)和4.0% (E); (F)–(J) MS培养基, 葡萄糖浓度分别
为0 (F)、0.5% (G)、1.0% (H)、2.0% (I)和4.0% (J)
Figure 2 Influence of glucose concentrations on Atrichum undulatum
(A)–(E) Beneke media, the glucose concentrations are 0 (A), 0.5% (B), 1.0% (C), 2.0% (D) and 4.0% (E); (F)–(J) MS media, the
glucose concentrations are 0 (F), 0.5% (G), 1.0% (H), 2.0% (I) and 4.0% (J)
图3 不同激素(浓度均为1 mg·L–1)对仙鹤藓愈伤组织诱导的影响
(A) 6-BA; (B) 2,4-D; (C) IAA; (D) IBA; (E) KT; (F) NAA
Figure 3 Influence of different phytohormones (concentration: 1 mg·L–1) on callus induction of Atrichum undulatum
(A) 6-BA; (B) 2,4-D; (C) IAA; (D) IBA; (E) KT; (F) NAA
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图4 不同浓度葡萄糖、6-BA和2,4-D组合对仙鹤藓愈伤组织数
量的影响
编号同表2。
Figure 4 Influence of glucose, 6-BA and 2,4-D in different
concentrations on callus number of Atrichum undulatum
The serial number is the same as Table 2.
体再生出绿色斑块, 初步鉴定为愈伤组织。30天后,
仅有含6-BA的脱分化培养基上形成了若干小块愈伤。
其它组合中均无愈伤组织形成(图3)。
吴小凤等: 仙鹤藓的孢子萌发及愈伤组织诱导 655
图5 不同浓度葡萄糖、6-BA和2,4-D组合对仙鹤藓愈伤组织诱导的影响
A–Y分别对应表2编号1–25。
Figure 5 Influence of glucose, 6-BA and 2,4-D in different concentrations on callus induction of Atrichum undulatum
A–Y corresponding to No. 1–25 in Table 2.
3.3.2 不同浓度葡萄糖、6-BA和2,4-D组合对愈伤组
织诱导的影响
25组75个对照实验显示, 60天后, 愈伤组织表面长出
白色绒毛。16号组合(2%葡萄糖、1 mg·L–16-BA和0
mg·L–1 2,4-D)愈伤斑块最多(图4), 堆积最高, 愈伤面
积最大 (图5P) ; 其次为11号组合 (1%葡萄糖、1
mg·L–16-BA和0 mg·L–1 2,4-D)(图5K)、6号组合(0.5%
葡萄糖、0.5 mg·L–16-BA和0 mg·L–12,4-D)(图5F)和21
号组合(4%葡萄糖、2 mg·L–16-BA和0 mg·L–1 2,4-D)
(图5U), 表现为愈伤组织颜色深绿, 表面的白色绒毛
656 植物学报 48(6) 2013
表2 不同浓度葡萄糖、6-BA和2,4-D的正交组合
Table 2 Different concentrations of glucose, 6-BA and 2,4-D
of orthogonal combination
Serial number Glucose (%) 2,4-D (mg·L–1) 6-BA (mg·L–1)
1 0 0 0
2 0 0.25 0.5
3 0 0.5 1.0
4 0 1.0 1.5
5 0 1.5 2.0
6 0.5 0 0.5
7 0.5 0.25 1.0
8 0.5 0.5 1.5
9 0.5 1.0 2.0
10 0.5 1.5 0
11 1.0 0 1.0
12 1.0 0.25 1.5
13 1.0 0.5 2.0
14 1.0 1.0 0
15 1.0 1.5 0.5
16 2.0 0 1.0
17 2.0 0.25 1.5
18 2.0 0.5 0
19 2.0 1.0 0.5
20 2.0 1.5 1.0
21 4.0 0 2.0
22 4.0 0.25 0
23 4.0 0.5 0.5
24 4.0 1.0 1.0
25 4.0 1.5 1.5
较少。1、10、14、18、22号组合(6-BA含量均为0)
无愈伤组织出现(图5A, J, N, R, V)。2、3、4、5号组
合(葡萄糖含量均为0)中有愈伤组织形成, 但数量较
少, 原丝体呈绿色且不发达(图5B–E); 其余组合均有
愈伤斑块产生, 且表面覆有白色丝状体(图5G, H, I,
L, M, O, Q, S, T, W, X, Y)。
三因素组合的正交实验结果是16号组合(2%葡
萄糖+0 mg·L–12,4-D+1.0 mg·L–16-BA)愈伤组织最大,
22号组合 (4%葡萄糖+0.25 mg·L–12,4-D+0 mg·L–1
6-BA)原丝体和茎叶体长势最好。实验结果进一步验证
了葡萄糖和6-BA能共同促进仙鹤藓愈伤组织的诱导和
生长, 而且最适浓度为2%葡萄糖+1.0 mg·L–1 6-BA。
与6-BA相比, 2,4-D不能诱导出仙鹤藓愈伤组织。
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吴小凤等: 仙鹤藓的孢子萌发及愈伤组织诱导 657
Spore Germination and Callus Induction of Atrichum undulatum
Xiaofeng Wu, Ruoyang Hu*, Xuedong Li
School of Life Sciences, Capital Normal University, Beijing 100048, China
Abstract We studied the spore germination and protonema development of Atrichum undulatum collected from Wuling
Mountain, Hebei Province (1 500 m a.s.l.). The dormancy stage is absent during spore development. Spores in incubation
culture take 3 days to germinate. Spores germinate exogenously by forming a protonema in 2 growth phases: chloronema
and caulonema. The best growth conditions were MS medium with 2% glucose at 25°C/20°C, 14 h light/10 h dark, 36
μmol·m–2·s–1. The optimal medium for callus induction is MS medium supplemented with 2% glucose and 1.0 mg∙L–1 6-BA
to obtain high-quality cormus for large-scale cultivation.
Key words Atrichum undulatum, callus, spore germination
Wu XF, Hu RY, Li XD (2013). Spore germination and callus induction of Atrichum undulatum. Chin Bull Bot 48, 651–657.
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* Author for correspondence. E-mail: huruoyang@aliyun.com
(责任编辑: 白羽红)
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