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延边地区长柱金丝桃中4种酮类成分的含量测定



全 文 :第40卷 第2期
2014年6月
延边大学学报(自然科学版)
Journal of Yanbian University(Natural Science)
Vol.40No.2
June 2014
收稿日期:2014-03-20    *通信作者:安仁波(1965—),男,博士,教授,研究方向为天然药物活性成分.
基金项目:教育部留学回国人员科研启动基金资助项目(2008890);吉林省科技发展计划项目(200705427)
文章编号:1004-4353(2014)02-0182-04
延边地区长柱金丝桃中4种酮类成分的
含量测定
姜英子1, 王科斯1, 金慧颖2, 安仁波1,3*
(1.延边大学药学院,吉林 延吉133002;2.延边第二人民医院,吉林 延吉133001;
3.延边大学长白山生物资源与功能分子教育部重点实验室,吉林 延吉133002)
摘要:为长柱金丝桃(Hypericum ascyron L.)质量标准的研究提供参考,在色谱柱为Diamonsil C18(250mm×
4.6mm,5m)、流动相为甲醇 乙腈 0.6%磷酸水溶液、线性度(R2)高于0.999 0、回收率为92.15%~
108.37%、相对标准偏差为1.57%~1.91%的条件下,使用高效液相色谱法同时测定了延边地区长柱金丝桃
中芦丁、金丝桃苷、槲皮素和山奈酚4种成分的含量.实验结果表明:长柱金丝桃中芦丁、金丝桃苷、槲皮素和
山奈酚的含量随区域有较大差异;本文方法准确、灵敏、可靠.
关键词:延边地区;长柱金丝桃;芦丁;金丝桃苷;槲皮素;山奈酚;高效液相色谱法
中图分类号:R927.2     文献标识码:A
Determination of Four flavonoids in Hypericum ascyron L.of
Yanbian area
JIANG Yingzi 1, WANG Kesi 1, JIN Huiying2, AN Renbo1,3*
(1.College of Pharmacy,Yanbian University,Yanji 133002,China;
2.Yanbian Second People’s Hospital,Yanji 133001,China;
3.Key Laboratory of Natural Resources of Changbai Mountain &Functional Molecules
(Yanbian University),Ministry of Education,Yanji 133002,China)
Abstract:To provide references for quality standard of Hypericum ascyron L.,HPLC method was established
for simultaneous determination of rutin,hyperoside,quercetin and kaempferol in Hypericum ascyron L.of
Yanbian area.Chromatographic separation was employed on Diamonsil C18column(250mm×4.6mm,5m)
with gradient elution of methanol-acetonitrile-0.6% phosphoric acid as mobile phase.Calibration curves of
standard components show excelent linearity with R2>0.999 0and the recovery tests are found to range from
92.15%to 108.37% with relative standard deviation values 1.57% 1.91%.The contents of flavonoids were
diferent obviously in samples from diferent regions.This method is accurate,sensitive and reliable.
Key words:Yanbian area;Hypericum ascyron L.;rutin;hyperin;quercetin;kaempferol;HPLC
0 引言
  中草药随产地的不同其化学成分的含量也有
不同,同时制药企业应用不同的制药工艺,也会导
致同种中草药产生不同的疗效;因此,研究中草药
中的生物活性成分和测定标志性成分的含量具有
非常重要的意义.
长柱金丝桃(Hypericum ascyron L.)为藤黄
 第2期 姜英子,等:延边地区长柱金丝桃中4种酮类成分的含量测定
科(Guttiferae)金丝桃属植物,广泛分布于我国
东北、内蒙古和黄河、长江流域以及朝鲜、日本、俄
罗斯(西伯利亚)等地.研究[1-2]表明,长柱金丝桃
味苦、性寒,具有平肝、凉血、止血、败毒、消肿、泻
火解毒等功效,民间常用于外伤止血、去除黄疸、
治疗肝炎及疮疖肿毒等症.文献[3]研究表明:长柱
金丝桃中所含金丝桃苷具有镇静解痉、抗炎、止咳
等作用,虽能够减少肺通气量但并不抑制呼吸中
枢节律活动;槲皮素可治支气管炎、解痉降压;山
奈酚可抗菌、抗炎、止咳祛痰.文献[4-12]显示,长柱
金丝桃还含有二蒽酮类衍生物、黄酮类化合物、五
环三萜类化合物、口山酮类和间苯三酚衍生物及
甾醇混合物和甾醇苷类化合物.本文利用高效液
相色谱(HPLC)法对延边地区长柱金丝桃中的芦
丁、金丝桃苷、槲皮素、山奈酚进行了含量测定,为
合理开发利用长柱金丝桃资源和长柱金丝桃质量
标准的研究提供参考.
1 仪器和材料
仪器有 L-2400型高效液相色谱仪(含 L-
2400型紫外检测器)(日本Hitach公司),FA2004
型万分之一电子天平(上海良平仪器仪表有限公
司),SK1200H型超声波清洗脱气器(上海科岛超
声仪器有限公司),RRH-100型万能高速粉碎机
(香港欧凯莱芙实业公司),Diamonsil C18色谱柱
(北京迪马科技有限公司).芦丁、金丝桃苷、槲皮
素、山奈酚购买于上海融禾医药科技发展有限公
司,甲醇和乙腈均为色谱纯,超纯水和其他试剂均
为分析纯.长柱金丝桃于2011年5—8月间采自
延边朝鲜族自治州内10个县市,由延边大学药学
院吕慧子副教授鉴定为藤黄科金丝桃属植物长柱
金丝桃的全草,凭证标本存放于延边大学药学院.
2 方法与结果
2.1 溶液的制备
2.1.1 供试样品溶液 精密称取长柱金丝桃粉
末0.5g(过40目筛)置于圆底烧瓶中,加入甲醇
50mL后超声提取40min;提取液置50mL容量
瓶中定容,用0.45m微孔滤膜过滤后作为供试
品试样.
2.1.2 对照品溶液 分别精密称取芦丁、金丝桃
苷、槲皮素、山奈酚对照品,置50mL容量瓶中后
加甲醇稀释至刻度,摇匀,定容.制成浓度分别为
6.0,30.0,12.0,18.0g/mL的溶液,经0.45m
微孔滤膜滤过,备用.
2.2 色谱条件[13-15]
色谱柱为Diamonsil C18(250mm×4.6mm,
5m),流速为1.0mL/min,柱温为35℃,检测波
长为360nm,进样量为20L,流动相为甲醇 乙
腈 0.6%磷酸水溶液.梯度洗脱条件见表1.
表1 色谱分离中流动相的洗脱条件
时间/min 甲醇/% 乙腈/% 0.6%磷酸水溶液/%
 0  0  5  95
 5  0  10  90
 30  5  15  80
 70  10  30  60
 80  20  40  40
 82  0  10  90
对照品及供试样品色谱图见图1,按保留时间,
出峰顺序分别为芦丁、金丝桃苷、槲皮素、山奈酚.
1.芦丁;2.金丝桃苷;3.槲皮素;4.山奈酚
图1 对照品(A)和供试品(B)溶液的HPLC色谱图
2.3 线性
混合对照品溶液,稀释制备成系列浓度的混
合标准品溶液,以峰面积值为纵坐标(Y),浓度
381
延边大学学报(自然科学版) 第40卷 
(μg/mL)为横坐标(X),通过绘制标准曲线求出
4种成分的线性回归方程及线性范围(见表2).
表2 4种酮类成分的回归方程及线性范围
成分 回归方程
线性范围/
(g/mL) R

芦丁 Y=46 632 X+408.81  0.4~ 6.0  0.999 5
金丝桃苷 Y=51 252 X-27 209  2.0~30.0  0.999 2
槲皮素 Y=89 271 X-40 830  0.8~12.0  0.999 1
山奈酚 Y=64 227 X-26 370  1.2~18.0  0.999 0
2.4 精密度
将对照品溶液按2.2的色谱条件重复进样6
次,分别测定芦丁、金丝桃苷、槲皮素、山奈酚的峰
面积,结果显示RSD值分别为1.79%、1.63%、
1.85%、1.71%,这表明精密度良好.
2.5 重复性
将同一份供试样品溶液按选定的色谱条件注入
色谱仪,分别测定芦丁、金丝桃苷、槲皮素、山奈酚的
含量,结果显示 RSD值分别为1.43%、1.66%、
1.97%、1.78%(n=5),这表明本方法具有良好的
重复性.
2.6 稳定性
在不同时间(0,2,4,8,12,24h)分别测定供
试样品溶液中芦丁、金丝桃苷、槲皮素、山奈酚的
峰面积,结果显示RSD值分别为1.80%、1.77%、
0.91%、1.93%(n=6),说明供试样品溶液在24h
内稳定.
2.7 加标回收率
在已知含量的延边地区长柱金丝桃药材(芦
丁0.149mg/g、金丝桃苷1.054mg/g、槲皮素
0.449mg/g、山奈酚0.487mg/g)中分别定量加
入芦丁、金丝桃苷、槲皮素、山奈酚,按2.1.1制备
成供试样品溶液,并按2.2的色谱条件分别测定
芦丁、金丝桃苷、槲皮素、山奈酚的含量,其回收率
和RSD值见表3.
2.8 不同区域样品的含量测定
将延边地区不同区域的长柱金丝桃样品按
2.1.1制备成供试样品溶液,在2.2的色谱条件
下进样20L,并同时测定芦丁、金丝桃苷、槲皮
素、山奈酚的含量,结果见表4.
表3 加标回收率试验结果(n=9)


供试样品中
含量/g
标样加入
量/g
实测值/

回收率/

RSD/



供试样品中
含量/g
标样加入
量/g
实测值/

回收率/

RSD/

芦丁  
75.40  60.32  136.32  100.99
75.28  60.22  135.89  100.65
75.32  60.26  135.82  100.39
75.47  75.48  150.93  99.98
75.43  75.39  149.64  98.39
75.35  75.32  147.32  95.51
75.05  90.06  165.09  99.96
75.16  90.19  165.80  100.49
75.25  90.90  167.53  102.19
1.91 金丝桃苷
533.44  426.75  936.48  94.44
532.60  426.08  918.06  90.46
532.92  426.33  934.78  94.25
533.97  533.69 1 023.21  91.66
533.66  533.77 1 028.24  92.65
533.13  533.23 1 033.61  93.85
531.02  637.22 1 132.39  94.37
531.76  638.11 1 139.25  95.20
532.39  638.87 1 125.99  92.91
1.63
槲皮素 
227.56  182.04  399.90  94.67
227.20  181.76  395.33  92.50
227.33  181.86  391.99  90.54
227.78  227.78  438.05  92.31
227.65  227.71  438.78  92.71
227.42  227.36  440.50  93.71
226.52  271.83  472.31  90.42
226.84  272.21  473.99  90.79
227.11  272.53  477.09  91.72
1.57 山奈酚 
246.30  197.04  455.25  106.04
245.91  196.73  466.23  111.99
246.06  196.84  457.21  107.26
246.54  246.58  513.57  108.29
246.40  246.41  517.84  110.15
246.15  246.23  512.04  107.98
245.18  294.22  558.63  106.53
245.52  294.62  568.38  109.58
245.81  294.98  563.02  107.53
1.74
481
 第2期 姜英子,等:延边地区长柱金丝桃中4种酮类成分的含量测定
表4 延边地区长柱金丝桃中4种酮类成分的含量
mg/g
采集

芦丁
RSD/%
金丝桃苷
RSD/%
槲皮素
RSD/%
山奈酚
RSD/%
图们
磨盘山
0.149±0.001
0.76
1.055±0.013
1.13
0.450±0.009
1.85
0.487±0.009
1.67
和龙长
红林场
0.120±0.001
0.72
1.418±0.017
1.21
0.356±0.004
0.86
0.467±0.007
1.26
延吉三



0.489±0.005
0.95
0.179±0.002
0.87
0.294±0.007
2.0
珲春哈
达门
0.089±0.002
1.80
1.054±0.011
0.88
0.313±0.001
0.52
0.491±0.004
0.76
和龙青
山里


0.677±0.013
1.71
0.823±0.010
1.03
1.968±0.013
0.67
汪清春

0.111±0.002
1.24
0.806±0.007
0.82
0.231±0.001
1.81
0.315±0.003
0.77
延吉朝
阳川
0.265±0.003
1.04
1.004±0.003
0.33
0.241±0.003
1.26
0.169±0.002
1.01
龙井开
山屯
0.109±0.001
0.67
1.270±0.022
1.48
0.258±0.005
1.66
0.302±0.003
0.85
图们月

0.105±0.002
1.71
0.675±0.001
0.13
0.295±0.005
1.41
0.469±0.006
1.15
安图万



0.863±0.004
0.44
0.190±0.001
0.47
0.299±0.004
1.21
  注:—表示在此条件下提取,不能满足本含量测定要求.
3 讨论
芦丁、金丝桃苷、槲皮素和山奈酚在360nm
与270nm波长处有较强吸收,但在360nm波长
处杂质峰较少,故选定360nm为检测波长.本色
谱条件可满足同时测定长柱金丝桃中4种酮类成
分含量的 HPLC分析方法要求.
根据文献[14-15]选择不同的流动相进行了
试验,结果显示:以甲醇 水为流动相时,洗脱能力
和分离度均较差;以甲醇 0.6%磷酸水溶液为流
动相时,峰型较好,但分离度差;以甲醇 乙腈
0.6%磷酸水溶液为流动相进行梯度洗脱时,芦
丁、金丝桃苷、槲皮素、山奈酚4种成分都能得到
很好的分离,并且峰形较好,所以本文选用了甲醇
乙腈 0.6%磷酸水溶液为流动相进行了梯度洗
脱.我们还考查了不同流速(0.8,1.0mL/min)的
甲醇 乙腈 0.6%磷酸水溶液对分离结果的影
响,结果表明当流速为1.0mL/min时其效果最佳.
本文测定结果表明,延边各地区的长柱金丝
桃中芦丁的平均含量在0.089~0.265mg/g,金
丝桃苷的平均含量在0.489~1.418mg/g,槲皮
素的平均含量在0.179~0.450mg/g,山奈酚的
平均含量在0.169~1.968mg/g.这表明区域不
同,芦丁、金丝桃苷、槲皮素、山奈酚的含量也不
同,而且具有显著性差异.
本文研究表明,利用 HPLC对长柱金丝桃药
材中的4种酮类(芦丁、金丝桃苷、槲皮素、山奈酚)
成分的含量同时进行测定,方法灵敏、可靠、快捷,
可为今后长柱金丝桃质量标准的研究提供参考.
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