全 文 ：安徽农学通报，Anhui Agri.Sci.Bull.2015，21（23）
黄牛毛藓水提液对冬枣轮纹病致病菌抑制效应的初步研究
刘俊华 1 张孝霖 2*
（1 滨州学院山东省黄河三角洲野生植物资源开发利用工程技术研究中心，山东滨州 256603；2 滨州学院生命科学系，山东滨州 256603）
摘 要：为了初步阐明苔藓植物的抑菌效应，以我国传统药用苔藓植物黄牛毛藓（Ditrichum pallidum）为试验
材料，以冬枣轮纹病致病菌大茎点霉为受试菌株，采用菌丝生长速率法对黄牛毛藓配子体水粗提液进行了抑
菌作用的初步研究。结果表明：黄牛毛藓水浸提液对大茎点霉有一定程度的抑制作用，且随着黄牛毛藓水浸
提液浓度的增加，其抑菌效果愈加明显，在较高浓度（＞40mg/mL）条件下，抑菌率达 50%以上。因此，黄牛毛
藓提取物在冬枣轮纹病的生物防治方面具有一定的开发应用潜力。
关键词：黄牛毛藓；抑菌作用；大茎点霉；苔藓植物；冬枣
中图分类号 Q948.12 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2015）23-23-03
Antifungal Effect of Water Extracts from Ditrichum pallidum on Macrophoma kuwatsukai
Liu Junhua 1 et al.
（1Shandong Provincial Engineering and Technology Research Center for Wild Plant Resources Development and Ap⁃
plication of Yellow River Delta，Binzhou 256603，China）
Abstract：The antibacterial effect of bryophyte Ditrichum pallidum with its water extraction were studied，which dis⁃
tributed widely in Shandong province. The results indicated that Ditrichum pallidumhad restrain effects on Macropho⁃
ma kuwatsukai to a certain extent. And the bacteriostatic effect is more obvious along with the increasing of extrac⁃
tion concentration. At the concentration of 160mg/mL，its inhibition rate on Macrophoma kuwatsukai was more than
70% . As an import medicinal moss species，Ditrichum pallidumhad has certain development value in controlling
harmful organism of‘Dongzao’jujube.
Key words：Ditrichum pallidum；Antifungal effect；Macrophoma kuwatsukai；Bryophytes；‘Dongzao’jujube
苔藓植物种类多样，对环境具有广泛的适应性［1-4］，能
够产生如萜类、黄酮类、脂肪酸等次生代谢产物以及一些
生物活性物质，是潜在的天然活性产物宝库［3-5］。目前，已
有多种苔藓植物被证明有抑制微生物活性的作用［1，4，9-10］。
目前，在苔藓植物的应用基础性研究中，抑菌性作用研究
仅占了其中的极小一部分，而我国拥有丰富的苔藓植物资
源，但有关其抑菌作用的研究仍处于起步阶段。前期研究
表明，黄牛毛藓对金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aure⁃
us）、大肠杆菌（Escherichia coli）、变形杆菌（Proteus vulgris）
生长具有一定的抑制作用［9］，但尚未见以植物病原菌为受
试菌株的抑菌研究。为此，本试验以黄牛毛藓作为植物
材料，以冬枣轮纹病致病菌为受试菌株，利用其黄牛毛藓
配子体水提液进行抑菌试验，初步阐明了黄牛毛藓对冬
枣轮纹病致病菌的抑制作用及表现出的浓度效应，旨在
为以黄牛毛藓为代表的药用苔藓植物资源的开发利用提
供参考。
1 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 供试样品 黄牛毛藓（Ditrichum pallid um（Hedw）
Hamp.），于 2009 年春采自山东蒙山（海拔 850m 处）。
1.1.2 供试菌株 本研究所用供试菌株为大茎点霉，由
滨州学院生物学试验教学中心提供。大茎点霉是冬枣轮
纹病的病原菌［11-12］，该菌属于半知菌亚门 Deuteromycoti⁃
na、腔孢纲 Coelomycetes、球壳孢目 Sphaeropsidales、球壳
孢科 Sphaeropsidaceae、大茎点菌属 Macrophoma、轮纹大
茎点菌 Macrophoma kuwatsukaiihara。
1.1.3 培养基及成分 本研究采用 PDA 培养基：马铃薯
200g、蔗糖 20g、琼脂 20g、蒸馏水 1 000mL，pH 为自
然值。
1.2 研究方法
1.2.1 黄牛毛藓水浸提液母液的制备 将黄牛毛藓植物
体洗净，以无菌水浸泡至吸水饱和，然后用灭菌滤纸吸去
体表多余水分，但不能过重挤压。用电子天平称取 8.0g
藓体，加少许无菌水，研磨成浆状，再加水至 50mL，然后
放入 50℃恒温水浴锅内浸提 24h。以 4 000r/min 离心
10min，收集上清，得上清液即为水提液，然后补水至
基金项目：滨州市科技发展计划项目（2014ZC0309）。
作者简介：刘俊华（1980-），男，山东高唐人，硕士，讲师，从事植物生物学教学与研究工作。*通讯作者 收稿日期：2015-11-25
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DOI:10.16377/j.cnki.issn1007-7731.2015.23.009
安徽农学通报，Anhui Agri.Sci.Bull.2015，21（23）
50mL，即得浓度为 160mg/mL 的黄牛毛藓配子体水浸提
母液。
1.2.2 黄牛毛藓水浸提液的稀释 用 5mL 的无菌移液
管吸取 160mg/mL 的黄牛毛藓水浸提液 5mL，沿管壁慢
慢注于装含有 15mL 灭菌蒸馏水的三角瓶中，重复 3 次，
共吸取 160mg/mL 的黄牛毛藓水浸提液 15mL，充分震荡
使混合均匀，即得 30mL 浓度为 80.0mg/mL 的水浸提
液。另取一支无菌移液管，按上述操作方法，作 2 倍递增
稀释，如此每递增稀释 1 次，即更换 1 次无菌移液管，依
次稀释得到浓度为 40.0mg/mL，20.0mg/mL，10.0mg/mL，
5.0mg/mL，2.5mg/mL 的黄牛毛藓配子体水浸提液。将配
制好的藓体水提液置于 4℃冰箱保存备用。
1.2.3 大茎点霉活化 取大茎点霉的备用菌株，在已杀
菌的超将工作台中用接种环各取少许菌苔，接种至 PDA
固体培养基平板的中央，将已接种大茎点霉的平板置于
恒温培养箱中暗培养，即可得到活化的菌株。待其菌落
将要长满平板时，即进入下一步操作。
1.2.4 抑菌效果测定 采用菌丝生长速率法［1］测定黄牛
毛藓水浸提液对大茎点霉生长的影响。将 PDA 固体培
养基在电炉上加热溶化，待冷却后，倒平板。待平板彻底
冷却凝固后，在无菌室内用无菌移液枪吸取黄牛毛藓水
浸提液 200μL，加入已冷却的 PDA 固体培养基的平板
上，火焰灼烧已灭菌的涂布棒，待涂布棒冷却后涂布平
板。用无菌打孔器在已活化的大茎点霉的同一生长圈上
打孔，得到直径为 1cm 的菌落块，并移入上述已制备好
的平皿中央，每皿一块，用相应的提取溶剂无菌水作对
照，每个浓度 5 次重复。置于 28℃恒温培养箱中暗培
养。培养 3d 后，观察大茎点霉的的生长情况，以十字交
叉法测量菌落直径。依下式计算抑菌率：
抑菌率（%）=［（对照菌落直径-菌饼直径）-（处理菌
落直径-菌饼直径）］/（对照菌落直径-菌饼直径）×100。
1.3 数据的处理与分析 试验结果中数据为 5 个平行
样的平均值。均采用 Excel 2003 进行数据整理，并运用
SPSS 18.0 统计软件包进行单因素方差分析（LSD 多重比
较及 Duncans 检验）及 Pearson 相关性分析。
2 结果与分析
2.1 黄牛毛藓水提液的抑菌效果分析 本试验采用菌丝
生长速率法进行。由表 1 可知，在较低浓度（2.5mg/mL
及 5.0mg/mL）下，黄牛毛藓水浸提液对大茎点霉菌丝的生
长表现出一定的抑制作用，但抑菌效果不明显；随着黄牛毛
藓水浸提液浓度的升高，大茎点霉菌丝生长受到越来越强
的抑制，菌落直径迅速减小；当水提液浓度达到 20mg/mL
时，抑菌率接近 50%；而在较高浓度（大于 40mg/mL）条件
下，大茎点霉菌所受抑制作用明显增强，抑菌率达到 60%
以上；本试验最高处理浓度（160mg/mL）水提液对大茎点
霉菌的抑制率达到 70%以上（72.55%）。并且，单因素方
差分析表明，黄牛毛藓水浸提液各浓度处理条件下的大
茎点霉菌落大小均显著小于对照组。另据观察发现，中
高浓度处理下的大茎点霉菌，其菌丝密度小、生长量减
少，且菌丝较易老化。
表 1 黄牛毛藓水浸液对大茎点霉菌的抑制作用
水浸提液浓度（mg/mL）
0
2.5
5.0
10.0
20.0
40.0
80.0
160.0
菌落直径（mm）
77.5±5.86a
71.6±6.10ab
65.2±6.08b
56.2±5.54c
43.7±4.97d
35.31±5.47e
31.3±5.57ef
25.6±6.50f
抑菌率（%）
0
8.17
17.24
29.74
47.26
59.04
64.61
72.55
注：表中“菌落直径”数据为平均值±标准差；小写字母不同表
示差异显著（p＜0.05）。
2.2 黄牛毛藓水提液抑菌的浓度效应 为进一步阐明黄
牛毛藓配子体水提液对大茎点霉的抑制水平与浓度间的
相关关系，对提取液浓度与抑菌率进行了相关性分析。
如图 1 所示，随着水提液浓度的增加，抑菌率逐渐增强，
且表现出明显对数式变化的趋势（p＜0.05），这与褐黄水
灰藓醇提液抑菌作用表现出的浓度效应相一致［13］。
图1 黄牛毛藓水提液浓度与抑菌率间的相关性分析
3 讨论与结论
黄牛毛藓俗称金牛毛、刀口药，系牛毛藓科（Ditricha⁃
ceae）牛毛藓属（Ditrichumhampe）植物，是我国药用藓类
植物中常见的一种［9-10］。该藓全草入药，味淡、性凉，有镇
惊、清热凉血及化瘀生肌的功效，多用于治疗小儿惊风、
咳血、吐血及跌打损伤等症［9］，在我国民间多有使用。本
研究以冬枣轮纹病致病菌为受试菌株，结果表明：黄牛毛
藓水粗提液对沾化冬枣轮纹病致病菌大茎点霉的生长具
有较强的抑制作用，抑菌强度与浸提液浓度呈显著正相
关关系（p＜0.05）。但本试验仅是就黄牛毛藓对植物源致
病菌抑制作用的初步测定，今后仍需开展深入研究，阐明
黄牛毛藓体内次生活性物质的组成成分与含量水平，并
进一步优化和筛选提取条件，才有可能制备出抗冬枣轮
纹病的植物源杀菌剂，应用到植物病害生物防治的实
24
21卷23期
践中。
参考文献
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［J］.落叶果树，2014，46（5）：13-15. （责编：张宏民）
（上接 22 页）1mL2.5mol/L 盐酸溶液，加热煮沸约 5min 后
再加入 2.5mL 铬酸钡悬浊液，再煮沸约 5min。取下冷
却，向锥形瓶中逐滴加入（1+1）氨水至呈柠檬黄色，再多
加 2 滴。用慢速定量滤纸过滤，收集滤液于 50mL 比色
管内，用去离子水稀释至标线。在 420nm 波长下，用
10mm 比色皿测定吸光度，绘制校准曲线。在 8 个
150mL 锥形瓶中，分别加入 0.00、0.50、1.00、2.00、4.00、
6.00、8.00、10.00mL 硫酸盐标准使用液，加蒸馏水至
50mL，进行校准曲线的测定。计算公式如下：
C（SO42-，mg/L）=m×1000×浓缩倍数/V
式中：m：根据校准曲线算出的水样中硫酸盐含量
（mg）；V：锥形瓶中取样体积（mL）。
4 结果与分析
4.1 校准曲线 以硫酸盐含量（mg）为横坐标，减空白后
吸光度为纵坐标，绘制校准曲线，得到线性回归方程为
Y=0.1208X-0.0258，线性相关系数 r=0.999 5。
4.2 精密度检验 配制 2.00mg/L 和 10.00mg/L2 个不同
浓度水样，准确量取 500mL 于大烧杯中，加热浓缩至
50.00mL，按试验方法测定吸光度，计算浓缩前水样中硫酸
盐含量。连续测定 7 次，计算相对标准偏差，结果见表 1。
表 1 精密度测定结果
浓度
（mg/L）
2
10
均值 Xˉ
（μg）
2.12
10.0
标准
偏差 S
0.088
0.139
相对标准
偏差 V（%）
4.2
1.4
回归方程
Y=0.1208X-0.0258
4.3 准确度检验 将低浓度明码质控样进行浓缩后，按
照实验方法测定吸光度，计算水中硫酸盐浓度值，结果见
表 2。由表 2 可以看出，测定结果均在质控样保证值浓
度范围内，测定结果合格。
表 2 样品准确度测定结果
样品
名称
201928
201925
取样体积
（mL）
250.00
250.00
浓缩后体
积（mL）
50.00
50.00
浓缩液浓度
（mg/L）
128
125
195
193
样品浓度
（mg/L）
12.8
12.5
19.5
19.3
质控样保证
值（mg/L）
13.0±0.7
20.1±1.2
4.4 检出限和测定下限的确定 根据 HJ168-2010 环境
监测分析方法标准制修订技术导则，当空白试验中未检
测出目标物质，应对浓度值为估计方法检出限值 2～5 倍
的样品进行 n（n≥7）次平行测定。将硫酸盐标准使用溶
液加到空白中配制成浓度为 0.5mg/L 的混合样品，按照
样品分析的同样步骤连续分析 7 次，计算方法检出限，结
果见表 3。由表 3 可知，直接加热浓缩测定硫酸盐方法
检出限为 0.3mg/L。测定下限一般以 4 倍检出限值作为
测定下限［5］，所以该方法的测定下限为 1.2mg/L。
表 3 检出限计算结果
序号
1
2
3
4
5
6
7
水样体积
（mL）
500.00
浓缩后体积
（mL）
50.00
水样浓度
（mg/L）
0.7
0.6
0.5
0.7
0.8
0.6
0.7
检出限
（mg/L）
0.3
5 结论
本文对现有铬酸钡分光光度法测定水中硫酸盐的前
处理方法进行了改进，选择直接加热的方法对水样进行
浓缩后再行测定。该方法检出限为 0.3mg/L，测定下限为
1.2mg/L，大大降低了原方法的检出限和测定下限，能够满
足更低浓度样品测定的需要，提高低浓度样品的分析准
确性，且方法操作简单，结果稳定，对硬件要求不高，分析
成本低。
参考文献
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［4］中国环境监测总站.环境水质监测质量保证手册［M］.北京：化学
工业出版社，2010.
［5］HJ168-2010，环境监测分析方法标准制修订技术导则［S］.
（责编：张宏民）
刘俊华等 黄牛毛藓水提液对冬枣轮纹病致病菌抑制效应的初步研究 25