全 文 ：书山 东 农 业 科 学 2013，45(10):1 ～ 6，11 Shandong Agricultural Sciences
收稿日期:2013 －06 －07
基金项目:国家自然科学基金(30671177)、山东省优秀中青年科学家科研奖励基金(2006BS06001)、山东省农业科学院博士基金
(2006 － 2009)资助。
作者简介:丁 谦(1987 －) ，男，博士研究生，主要研究蔬菜育种。E － mail:dingqian87@ 126. com;叶 帅(1981 －) ，男，硕士研究生，
研究方向为植物分子遗传学。* 丁 谦、叶 帅同为第一作者。
＊＊通讯作者:高建伟(1967 －) ，男，研究员。E － mail:jianweigao3@ yahoo. com
小立碗藓细胞色素 P450 基因 PpCYP51G1
的分离及转化载体构建
丁 谦1，2* ，叶 帅1，3* ，李景娟1，朱正歌3，高建伟1＊＊
(1. 山东省农业科学院蔬菜研究所 /山东省设施蔬菜生物学重点实验室 /
国家蔬菜改良中心山东分中心，山东 济南 250100;
2. 甘肃农业大学，甘肃 兰州 730070;3. 河北师范大学生命科学学院，河北 石家庄 050016)
摘 要:从小立碗藓(Physcomitrella patens)中克隆了细胞色素 P450 CYP51 基因 PpCYP51G1 的全长编码
序列，编码区长 1 509 bp，预测编码 488 个氨基酸，蛋白二级结构含有自由卷曲、伸展片段和 α －螺旋，N 端含
有一个跨膜区域。构建了 PpCYP51G1 的功能缺失载体，并利用 PEG介导的原生质体转化技术获得该基因的
功能缺失转化体;同时，构建了 PpCYP51G1 － GFP融合蛋白载体，亚细胞定位结果表明，PpCYP51G1 定位在内
质网中。
关键词:小立碗藓;细胞色素 P450;CYP51;克隆;转化载体构建
中图分类号:Q781 文献标识号:A 文章编号:1001 －4942(2013)10 －0001 －07
Isolation of Cytochrome P450 Gene PpCYP51G1 from
Physcomitrella patens and Construction of Its Transformation Vectors
Ding Qian1，2* ，Ye Shuai1，3* ，Li Jingjuan1，Zhu Zhengge3，Gao Jianwei1＊＊
(1． Institute of Vegetables，Shandong Academy of Agricultural Sciences /Shandong Key Laboratory of
Greenhouse Vegetable Biology /Shandong Branch of National Vegetable Center，Jinan 250100，China;
2． Gansu Agricultural University，Lanzhou 730070，China;
3． College of Life Science，Hebei Normal University，Shijiazhuang 050016 ，China)
Abstract The full length cDNA sequence of cytochrome P450CYP51 gene named as PpCYP51G1 was
cloned from Physcomitrella patens． Its code region was 1 509 bp，and it encoded 488 amino acids． The PpC-
YP51G1 protein contained one transmembrane region at the N end，and its secondary structure contained ran-
dom coils，extended strands and alpha helixes． The knockout vector for PpCYP51G1 was constructed and the
loss － of － function transformants were obtained． The expression vector for PpCYP51G1 － GFP fusion was also
constructed to investigate the subcellular localization of PpCYP51G1，and the result showed that PpCYP51G1
expressed in endoplasmic reticulum．
Key words Physcomitrella patens;Cytochrome P450;CYP51;Clone;Construction of transformation
vector
CYP51 为甾醇 14α － 去甲基化酶(又称 P45014DM) ，被视为最古老的细胞色素 P450 家族
DOI:10.14083/j.issn.1001-4942.2013.10.001
成员［1］，是细胞色素 P450 家族中唯一一个在真
菌、植物和动物界都具有保守功能的成员［2］。真
菌 CYP51 是真菌麦角甾醇合成过程的关键酶，抑
制其活性将会阻碍麦角甾醇的合成，破坏细胞膜
的结构和功能，最终导致真菌死亡。目前农业上
CYP51 抑制剂(14α － demethylation inhibitors，
DMIs)类杀菌剂即是通过抑制真菌 CYP51 的活性
发挥杀菌抑菌作用［3］。植物 CYP51 不仅参与植
物体的基础代谢，还参与植物体的次生代谢，主要
表现在次生代谢物质的合成及降解化学药物毒性
两方面，其催化的代谢途径可产生一些重要次生
代谢物，提高植物抵抗病虫害及逆境胁迫的能
力［4］。因此，研究 CYP51 对于研究细胞色素
P450 的结构、功能和进化具有重要意义。
小立碗藓(Physcomitrella patens)是目前发现
的唯一具有高频率同源重组的植物［5］。同源重
组是基因打靶的技术核心。Kammerer［6］ 和
Cove［7］等首先在小立碗藓中实现了基因同源重
组。随后 Schaefer 等［8，9］进一步证实小立碗藓基
因打靶效率高达 90%，与酵母基因打靶频率
(95%)相当，这是高等植物中通过同源重组进行
精确基因打靶的先例。目前，基因打靶技术已成
为研究小立碗藓基因功能的有效工具［10 ～ 13］。由
于生活周期短、易于培养、转基因植株易于分析以
及核基因组易于和外源 DNA 发生同源重组等特
点，小立碗藓已成为重要的植物分子生物学研究
材料。本试验克隆了小立碗藓细胞色素 P450
CYP51 基因 PpCYP51G1，并试图利用其高频率同
源重组特性获得该基因的功能缺失突变体并通过
亚细胞定位研究其功能。
1 材料与方法
1. 1 材料与试剂
小立碗藓 Gransden 品系 Physcomitrella patens
(Hedw. )B. S. G由 Ｒalf Ｒeski 教授惠赠。
试验所用试剂:pCAMBIA － 1301 载体、连有
GFP的 PJIT163 质粒由本实验室保存;大肠杆菌
菌种(DH5α)、BioFlux 胶回收试剂盒(3S Spin
DNA Agarose Gel Purification Kit)购自山东济南朋
远公司;Taq 酶、Ex Taq 酶、T4 DNA 连接酶、限制
性内切酶、dNTP 购自 TaKaＲa 公司;pGEM － T
easy vector System购自美国 Promega公司;引物由
北京博尚生物技术有限公司合成;Trizol 购自 In-
vitrogen公司;反转录试剂盒(First － Strand cDNA
Synthesis Kit)购自上海申能博彩生物科技有限公
司;测序由山东省农业科学院高新技术研究中心
测序室完成。
1. 2 试验方法
1. 2. 1 PpCYP51G1 全长 cDNA 编码序列的克隆
采用 Trizol法提取小立碗藓原丝体总 ＲNA，利用
反转录试剂盒(First － Strand cDNA Synthesis Kit)
反转录合成 cDNA第一条链。以小立碗藓反转录
产物为模板，利用特异性引物 PCYP51G1F:5 －
GATACAATGGGGGATGCGGA － 3和 PCYP51G1Ｒ:
5 － ATCACATGTCAGTTGACGAC － 3进行 PCＲ，获
得 PpCYP51G1的全长编码序列。
1. 2. 2 PpCYP51G1 氨基酸序列特征分析和二级
结构预测 在 http:/ /blast. ncbi. nlm. nih. gov /
Blast. cgi网站利用 Blast 工具进行序列相似性分
析;利用 DNAMAN软件预测其编码蛋白并进行蛋
白序列比对、系统进化树构建;利用 GOＲ 软件
(http:/ /www. expasy. ch / tools /)对其蛋白二级结
构进 行 预 测;使 用 TMHMM 软 件 (http:/ /
www. cbs. dtu. dk /services /TMHMM/)对其蛋白跨
膜结构进行预测。
1. 2. 3 PpCYP51G1 功能缺失载体的构建、转化
及转化体的筛选和鉴定 以基因组 DNA为模板，
利用引物 PCYP51G1F 和 PCYP51G1Ｒ 进行 PCＲ
扩增，得到长度大于 1 kb 的 DNA 片段，克隆测
序，分析测序结果找出外显子区域及内含子区域，
并将基因打靶位点设计在外显子区域，取打靶位
点前后各约 500 bp 的片段，分别命名为Ⅰ片段、
Ⅱ片段。扩增 PpCYP51G1 的Ⅰ片段和Ⅱ片段所
用引物分别为:
CYP51G1F1:5 － GACGTCGATTCTCCCGACT-
GGGTGAG －3(划线处为 AatⅡ酶切位点)
CYP51G1Ｒ1:5 － GAATTCAGAACGAAGTGAC-
CCACAAT －3(划线处为 EcoＲⅠ酶切位点)
CYP51G1F2:5 － ACTAGTCGCGTGGAATCG-
GAAGCGAC －3 (划线处为 SpeⅠ酶切位点)
CYP51G1Ｒ2:5 －GAGCTCGCTGCAAAGCAAAAC-
CCCGA －3 (划线处为 SacⅠ酶切位点)
2 山 东 农 业 科 学 第 45 卷
pCAMBIA － 1301 载体(GenBank 登陆号为
AF234297. 1)中带有双 CaMV 35S启动子、潮霉素
磷酸转移酶基因(hpt Ⅱ)及 CaMV 3UTＲ 区的片
段命名为Ⅲ片段(即 pCAMBIA － 1301 载体上
8 720 ～ 10 795 bp之间的片段) ，片段大小为2 076
bp，扩增引物如下:
hpt － F:5 － AGCTTGCCAACATGGTGGAGCAC －
3
hpt － Ｒ:5 － AATTCGGGGGATCTGGATTTTAG-
TAC －3
分别将Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ片段克隆到 pGEM － T easy
载体上，转化大肠杆菌感受态细胞，经测序鉴定
后，提取质粒。首先用 Spe Ⅰ和 Sac Ⅰ分别双酶
切连有Ⅱ和Ⅲ片段的质粒(Ⅲ片段两端的酶切位
点为 pGEM － T easy 载体自带酶切位点) ，回收Ⅱ
片段和连有Ⅲ片段的线性化质粒，将二者连接后
转化大肠杆菌感受态细胞，挑取阳性克隆，经测序
鉴定后提取质粒。再用 Aat Ⅱ和 EcoＲ Ⅰ双酶切
质粒(pGEM － T easy 载体自带酶切位点) ，同时
用 Aat Ⅱ和 EcoＲⅠ双酶切连有Ⅰ片段的质粒，将
回收的Ⅰ片段与同时连有Ⅱ和Ⅲ片段的线性化质
粒连接，转化大肠杆菌感受态细胞，挑取阳性克隆
进行 PCＲ、酶切及测序鉴定，鉴定正确的即为我
们需要的 PpCYP51G1 功能缺失载体。
以 该 载 体 为 模 板，以 CYP51G1F1 和
CYP51G1Ｒ2 为引物进行 PCＲ 扩增，回收目的片
段，用 PEG介导的原生质体转化方法转化小立碗
藓原生质体。小立碗藓原生质体的制备、PEG 介
导的原生质体转化、再生和转基因植株的筛选参
考王凤德等［14］的方法。
取选择性培养基上生长的抗性植株及野生型
植株，分别提取其 DNA，以抗性植株 DNA、野生型
植株 DNA以及构建的质粒载体为模板，用引物
hpt － F和 hpt － Ｒ进行 PCＲ扩增，鉴定阳性植株。
1. 2. 4 PpCYP51G1 － GFP融合蛋白载体的构建、
转化及亚细胞定位 设计带有 BamH Ⅰ酶切位
点的引物扩增 PpCYP51G1 基因，所用引物为:
CYP51G1 － F:5 － GTGGATCCGATACAATGGGG-
GATGCGGA － 3 和 CYP51G1 － Ｒ:5 － GTG-
GATCCATCACATGTCAGTTGACGAC － 3(划线处
为 BamH Ⅰ酶切位点) ，将扩增得到的目的片段
通过 BamH Ⅰ酶切位点连接到 PJIT163 质粒载体
上，转化大肠杆菌感受态细胞，挑取阳性克隆，进
行酶切及测序鉴定，插入方向正确的质粒用 PEG
介导的转化方法转化小立碗藓原生质体［14］。
将转化后的原生质体 25℃黑暗过夜培养，荧
光显微镜下观察 GFP荧光的分布。
2 结果与分析
2. 1 PpCYP51G1 基因的克隆
以小立碗藓反转录产物为模板，利用特异性
引物 PCYP51G1F和 PCYP51G1Ｒ进行 PCＲ扩增，
得到一条约为 1. 5 kb 的带(图 1)。测序结果显
示，该基因的编码区长 1 509 bp，预测编码 488 个
氨基酸(图 2) ;序列比对发现，其氨基酸序列与拟
南芥 CYP51G1 基因 AtCYP51G1(GenBank 登录号
为 NM _101040)的编码蛋白序列的一致性为
65%，命名为 PpCYP51G1。Blast 检索发现基因组
测序已经完成的细菌、真菌和动物中都有 PpC-
YP51G1 基因的同源基因。
M:DNA Marker Ⅲ;1:PpCYP51G1 的 PCＲ扩增结果;2，3:
阴性对照
图 1 PCＲ扩增 PpCYP51G1 基因
2. 2 PpCYP51G1 氨基酸序列特征分析和二级结
构预测
2. 2. 1 PpCYP51G1 氨基酸序列同源性分析 对
小立碗藓、拟南芥、水稻、衣藻、酵母 CYP51G1 基
因编码的氨基酸序列进行比对(图 3)并构建系统
进化树(图 4) ，结果表明，PpCYP51G1 与拟南芥、
水稻、衣藻、酵母 CYP51G1 的氨基酸序列一致性
分别为 65%、64%、50%、28%。
3第 10 期 丁 谦等:小立碗藓细胞色素 P450 基因 PpCYP51G1 的分离及转化载体构建
图 2 PpCYP51G1 全长编码序列及预测的氨基酸序列
AtCYP51G1:拟 南 芥， NM _ 101040; OsCYP51G1:水 稻 (Japonica Group) ，NM _ 001074523; ChCYP51G1:衣 藻，(http:/ /
drnelson. uthsc. edu /chlamydomonas. htm) ;ScCYP51G1:酵母，NP_011871。下图同。
图 3 PpCYP51G1 与拟南芥、水稻、衣藻、酵母 CYP51G1 氨基酸序列比对
4 山 东 农 业 科 学 第 45 卷
图 4 PpCYP51G1 与拟南芥、水稻、衣藻、酵母
CYP51G1 蛋白进化树
2. 2. 2 PpCYP51G1 二级结构预测 利用 GOＲ
软件(http:/ /www. expasy. ch / tools /)预测了 PpC-
YP51G1 的二级结构，如图 5 所示，自由卷曲(ran-
dom coil)占 41. 04%，伸展片段(extended strand)
占 16. 46%，α －螺旋(alpha helix)占 42. 50%。对
PpCYP51G1 蛋白序列进行了跨膜结构预测，结
果发现其 N端具有一个跨膜区(图 6A)。为确定
跨膜区的长度，逐个截短 N 端序列，当截短了 22
个氨基酸时，N 端没有跨膜区(图 6B) ，说明跨膜
区至少包括 N端的 22 个氨基酸序列。
图 5 PpCYP51G1 的二级结构预测
图 6 PpCYP51G1 的跨膜结构预测
2. 3 PpCYP51G1 功能缺失载体鉴定
分别用Ⅰ片段两个引物、Ⅱ片段两个引物以
及Ⅰ片段 5端引物 /Ⅱ片段 3端引物进行扩增，
对重组质粒进行 PCＲ 验证，均获得了目的片段
5第 10 期 丁 谦等:小立碗藓细胞色素 P450 基因 PpCYP51G1 的分离及转化载体构建
(图 7)。分别用 Aat Ⅱ、EcoＲ Ⅰ双酶切Ⅰ片段，
用 Spe Ⅰ、Sac Ⅰ双酶切Ⅱ片段，对重组质粒进行
酶切验证，均得到了目的片段。将 PCＲ、酶切鉴
定正确的重组质粒进行测序，测序结果与目标序
列相符，表明 PpCYP51G1 功能缺失载体构建成
功，可用于下一步的转化。
M:DNA MarkerⅢ;1:CYP51G1Ⅰ片段;2． CYP51G1Ⅱ片段;
3． CYP51G1Ⅰ －Ⅲ －Ⅱ片段
图 7 功能缺失载体 PCＲ鉴定结果
2. 4 PpCYP51G1 功能缺失转化体的筛选和鉴定
随机选取 7 株选择性培养基上生长的抗性植
株，分别提取其 DNA 及野生型植株 DNA，以筛选
出的抗性植株 DNA、构建的功能缺失载体质粒、
野生型植株 DNA 为模板，用 hpt Ⅱ基因引物
(hpt － F和 hpt － Ｒ)进行 PCＲ 扩增。结果表明，
获得了 PpCYP51G1 功能缺失转化体。
2. 5 PpCYP51G1 － GFP 融合蛋白载体鉴定及亚
细胞定位
用 BamH Ⅰ对重组质粒进行酶切验证(图
8) ，得到了目的片段。将酶切正确的重组质粒进
行测序，测序结果与目标序列相符，表明 PpC-
YP51G1 － GFP 融合蛋白载体构建成功。亚细胞
定位结果表明，PpCYP51G1 定位在内质网上。
M:DNA MarkerⅢ;1:PpCYP51G1 － GFP融合载体
图 8 融合蛋白载体酶切鉴定结果
3 讨论
本试验从小立碗藓中克隆了 CYP51 基因 Pp-
CYP51G1 的全长 cDNA 编码序列，并对其氨基酸
序列进行了分析，结果表明，CYP51G1 在植物中
具有较高的保守性，PpCYP51G1 与拟南芥、水稻、
衣藻、酵母 CYP51G1 的氨基酸序列一致性分别为
65%、64%、50%、28%，与细胞色素 P450 家族其
它成员的研究结果类似［14］，因此，研究小立碗藓
细胞色素 P450 家族基因的功能对于揭示它们在
其它植物中的功能具有借鉴意义。
PpCYP51G1 跨膜区的预测结果表明，其 N 端
存在一个跨膜结构域，而 GenBank 中对小立碗藓
CYP51G1 基 因 (GenBank 登 录 号 为 XM _
001769361)的预测结果则显示其编码蛋白 N 端
无跨膜区，原因是 GenBank 中预测的氨基酸序列
不包括本试验得到的 PpCYP51G1 蛋白 N 端的前
22 个氨基酸(MGDAEMQGAPVGESAVFDＲSKV) ，
而这段序列刚好是预测的 N 端跨膜区。我们认
为 PpCYP51G1 的全长序列应该包括这个跨膜区，
GenBank中小立碗藓 EST数据库中的数据也证明
这段序列是确实存在的。
此外，我们构建了 PpCYP51G1 基因的功能缺
失载体及 GFP融合蛋白载体，获得了 PpCYP51G1
的功能缺失转化体，并对该基因进行了亚细胞定
位，为进一步研究其功能奠定了基础。
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