全 文 ：植酸酶产生菌的选育及固态产酶条件研究 3
汪世华　胡开辉　林文雄 3 3
(福建农林大学 ,福州 350002)
【摘要】　植酸酶催化植酸 ,并将其盐类水解成肌醇和磷酸 ,因此植酸酶的使用可以提高植酸磷的吸收利用
率 ,降低饲料成本 ,同时还可保护生态环境. 经分离和亚硝基胍诱变选育 ,得到一株植酸酶高产菌株绿色木
霉L H374 ,并对该菌株固态发酵产植酸酶的条件和扩大生产进行了研究. 结果表明 ,固态发酵的最佳条件 :
稻草和米糠的比例为 8∶2 ,培养基起始 p H 为 615 ,最适温度为 30 ℃,最适培养时间为 96 h ,含水量为 60 % ,
硫酸铵的流加量为 2 %. 绿色木霉 L H374 在上述最适条件下生产植酸酶平均可达 1 580 U·g - 1 .
关键词 　植酸酶 　菌种筛选 　固态发酵 　产酶条件
文章编号 　1001 - 9332 (2005) 11 - 2154 - 04 　中图分类号 　S154139 　文献标识码 　A
Screening of phytase2producing strain and its optimal solid state phytase2producing conditions. WAN G Shihua ,
HU Kaihui ,L IN Wenxiong ( Fujian A griculture and Forest ry U niversity , Fuz hou 350002 , China) . 2Chin. J .
A ppl . Ecol . ,2005 ,16 (11) :2154～2157.
Phytase can catalyze phytate hydrolyzed into inositol and phosphoric acid , and its application could make the
phytic acid in animal feeds become more available ,decrease feed cost ,and at the same time ,protect eco2environ2
ment. In this paper ,a phytase2producing strain Trichoderma Viride L H374 was obtained through isolation and
mutation ,and its optimal conditions for solid state fermentation and phytase production were investigated. The
results suggested that the optimal conditions of solid state fermentation were straw :rice bran ratio 8∶2 ,medium
initial p H 6. 5 ,temperature 30 ℃,culture duration 96 h ,and moisture content 60 %. Under the optimal condi2
tions ,L H374 could accumulate phytase up to 1 580 U·g - 1 .
Key words 　Phytase , Strain screening , Solid state fermentation , Optimal conditions of phytase2producing.
3 国家自然科学基金资助项目 (30200170) .3 3 通讯联系人.
2005 - 01 - 19 收稿 ,2005 - 05 - 03 接受.
1 　引 　　言
植酸 (肌醇六磷酸) 具有强大的络合力 ,通常与
Ca、Mg、Zn、K等矿物质元素结合 ,形成不溶性盐类.
因此植酸是一种抗营养因子 ,大大降低了微量矿物质
的营养有效性.饲料中天然磷含量约为 40 %～70 % ,
且以植酸磷的形式存在 ,而猪、禽的饲料中大量的植
酸磷不能被利用 ,从粪便中排除 ,造成 P 富集化环境
污染[2 ,5 ,9 ,17 ] . 植酸酶 ( Phytase , EC3111318) 是催化植
酸及其盐类水解成肌醇和磷酸的一类酶的总称. 植酸
酶添加到饲料中 ,将其中的植酸水解成肌醇和磷酸 ,
不但可以提高粮食和饲料中 P 的吸收利用率 ,还可
以降解植酸蛋白质络合物 ,减少植酸对微量元素的
螯合 ,提高动物对植物蛋白的利用率及其植物饲料
的营养价值[1 ,3 ,4 ,6 ,24 ] . 植酸酶的应用还可减少畜禽
粪便中 P 的排泄量 ,缓解 P 对环境特别是对水体的
污染 ,对我国农业可持续发展和生态环境保护具有
重大意义[10 ,13 ,14 ,29 ] .
目前人们已经成功地利用 DNA 重组技术获得
高产植酸酶的工程菌 ,但其生产的植酸酶价格昂贵 ,
作为添加剂进行商业化推广还有一定的难度 ,所以
有必要对植酸酶菌株进行进一步的选育 ,最终获得
具有实际应用价值的生产菌株[8 ,11 ,15 ,16 ] . 分离纯化
出 1 株酶活高且稳定的产植酸酶菌株后 ,在实验室
研究其固态发酵条件的基础上进行了中试研究. 结
果发现 ,该菌株产酶量高且性能稳定 ,能够大量生
产 ,能解决工业化生产难的问题.
2 　材料与方法
211 　供试材料
土壤样品取自武汉周边地区 . 植酸钙、植酸钠购于 Sig2
ma 公司. 颜色/ 终点混合液 : 250 ml 钼酸铵 (100 g·L - 1 ) +
250 ml 钒酸铵 (2135 g·L - 1) + 165 ml 65 %硝酸 + 335 ml 水.
主要测试仪器为 722 型分光光度计. 分离培养基 ( %) :植酸
钙 011 ,葡萄糖 310 , NH4NO3 015 , KCl 0105 , MgSO4 ·7H2O
0105 ,MnSO4 ·7H2O 01005 , FeSO4 ·7H2O 01005 ,琼脂 115 ,
p H6 ,用于筛选真菌. 牛肉膏蛋白胨培养基加 011 %的植酸钙
用于筛选细菌[18 ,25 ,26 ,30 ] . 液体种子培养基 ( %) :葡萄糖 410 ,
酵母膏 015 ,蛋白胨 110 , KH2 PO4 0115 ,MgSO4·7H2O 0105 ,
麸皮 015 ,p H6. 固体培养基及培养条件 :麸皮米糠按不同配
应 用 生 态 学 报 　2005 年 11 月 　第 16 卷 　第 11 期 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
CHIN ESE JOURNAL OF APPL IED ECOLO GY ,Nov. 2005 ,16 (11)∶2154～2157
比灭菌. 接种 30 ℃培养 3～6 d ,1 d 翻动 1 次.
212 　试验方法
21211 诱变方法 　亚硝基胍 (MNN G) 诱变方法参照文献[27 ]
进行.
21212 产植酸酶菌株的分离筛选 　分离样品稀释后涂平板 ,
30 ℃培养 2～5 d ,产植酸酶的菌株水解植酸钙形成透明圈 ,
以透明圈与菌落直径之比为粗筛的依据. 粗筛菌株发酵 ,测
定发酵产物植酸酶活性 ,保留活性高的菌株进一步研
究[20～22 ] .
21213 诱变后高产菌株的筛选 　将诱变后的菌落分别倒在
分离培养基平板上 ,观察透明圈情况 ,筛选出数株优良菌株 ,
进人摇瓶发酵复筛阶段 [20～22 ] .
213 　测定方法
粗酶液进行适当稀释后 ,取 012 ml 加入 016 ml p H515
0125 mol·L - 1乙酸缓冲液 ,在 37 ℃保温 5 min 后 ,加入 814 g
·L - 1植酸钠 116 ml ,继续保温 30 min ,加入颜色/ 终点混合
液 116 ml ,415 nm 测定无机磷含量. 对照 :在 012 ml 酶液加
入 016 ml 乙酸缓冲液后 ,再加入 116 ml 颜色/ 终点混合液 ,
最后加入底物[12 ,19 ,23 ] .
植酸酶活性单位定义为 :在 37 ℃p H 515 的条件下 ,1
min 从底物释放 1 nmol 无机磷所需要的植酸酶量 ,用 U 表
示.
3 　结果与分析
311 　产植酸酶菌株的筛选
根据透明圈的有无和大小 ,选 45 株进行发酵测
定酶活. 结果表明 ,有 8 株菌酶活超过 1 000 U ·
ml - 1 ,其中真菌 5 株 ,细菌 3 株. 绿色木霉 L H37 的
酶活最高 ,达到 1 200 U·g - 1 .
312 　菌种诱变
采用亚硝基胍对分离菌株 L H37 进行诱变 ,将
诱变后的菌体作适当稀释后涂布于平板上 ,培养 2
～3 d 后挑出单菌落接入活化钭面上 ,用摇瓶进行
初筛和复筛 ,选出 7 株植酸酶产量明显高于出发菌
株的变异株 (表 1) . 由表 1 可以看出 ,7 个菌株产酶
量都在 1 400 U·g - 1以上 ,明显高于分离株 L H57 的
产酶量. 将上述 7 个株菌株进行 3 次摇瓶复筛 ,选出
的 L H374 性能稳定且产量最高 ,平均酶活为 1 780
U·g - 1 .
表 1 　亚硝基胍诱变后筛选结果
Table 1 Screening result by MNNG mutation
菌号 Strain number (L H)
37 371 372 373 374 375 376 377
酶活 Activity(U·g - 1) 1200 1450 1580 1670 1780 1650 1720 1530
313 　固态产酶条件
31311 原料配比对产酶的影响 　麸皮和米糠为畜禽
常用的饲料 ,具有来源广泛、价廉等特点 ,同时还富
含植酸盐 ,对植酸酶的产生有一定的诱导作用. 用不
同比例麸皮和米糠混合物配制发酵培养基 ,接种后
培养 96 h ,测其酶活 (表 2) . 结果表明 ,稻草和米糠
的比例为 8∶2 时最好.
31312 起始 p H 值对产酶的影响 　选用 8 个不同初
始 p H 值 (415、510、515、610、615、710、715、810) 的
发酵培养基 ,接种后培养 96 h ,测其酶活. 结果表明
(图 1) ,培养基起始 p H 为 615 时最好.
表 2 　麸皮和米糠的比例对产酶的影响
Table 2 Effects of various ration of ra w materials on production of phy2
tase
原料比 (稻草∶米糠) Ration of raw materials
9∶1 8∶2 7∶3 6∶4 5∶5 4∶6 3∶7 2∶8 1∶9
酶活 Activity(U·g - 1) 1670 1790 1750 1730 1620 1430 1200 1120 850
图 1 　培养基起始 p H 值对产植酸酶的影响
Fig. 1 Effects of initial p H value on production of phytase.
31313 培养温度对产酶的影响 　在 25、30、35、40 和
45 ℃下接种培养 96 h ,测其酶活 (表 3) . 结果表明 ,
30 ℃最好 ,低于或高于 30 ℃产酶都较低.
表 3 　温度对产酶的影响
Table 3 Effects of temperature on production of phytase
温度 Temperture ( ℃)
25 30 35 40 45
酶活 Activity (U·g - 1) 1360 1880 1680 1310 420
31314 培养时间对产酶的影响 　接种后在 30 ℃下
培养 36、48、60、72、84、96、108 和 120 h 测其酶活
(表 4) . 结果表明 ,发酵 96 h 产酶量已达最大 ,96 h
以后开始下降 ,因此 96 h 为最佳产酶时间.
表 4 　培养时间对产植酸酶的影响
Table 4 Effects of culture time on production of xylanas
时间 Time(h)
36 48 60 72 84 96 108 120
酶活 Activity(U·g - 1) 340 750 1180 1340 1690 1920 1870 1780
31315 培养基含水量对产酶的影响 　培养基加水量
选用 40 %、45 %、50 %、55 %、60 %、65 %、75 %、
75 %、80 %、85 %共 10 个梯度 ,接种后在 30 ℃培养
96 h ,测其酶活 (表 5) . 结果表明 ,加水量 60 %最好 ,
低于或高于 60 %产酶都较低.
551211 期 　　　　　　　　　　　　　汪世华等 :植酸酶产生菌的选育及产酶条件研究 　　　　　　　　　　　
31316 硫酸铵的流加量对产酶的影响 　在发酵的过
程中采用流加硫酸铵的形式补充一定的 N 源 (表
6) . 结果表明 ,硫酸铵的流加量在 2 %时最好.
314 　扩大培养及发酵工艺的确定
将菌体在以上优化培养基及最佳发酵条件下采
用浅盘法进行规模为 1 t 的扩大培养 ,粗品酶活平
均达 1 580 U·g - 1 (表 7) ,可见该工艺工业化生产可
行. 其工艺如下 :斜面菌种 →1 级种子 →2 级液体扩
大培养 ;斜面菌种 →原料 →灭菌 →接种 →扩大培养
→粗酶制品 →测定酶活.
表 5 　培养含水量对产植酸酶的影响
Table 5 Effects of moisture content on production of xylanas
含水量 Moisture content ( %)
40 45 50 55 60 65 70 75 80 85
酶活 Activity(U·g - 1) 740 950 1220 1780 1940 1910 1760 1520 1120 650
表 6 　硫酸铵的流加量对产酶的影响
Table 6 Effects of ( NH4) 2SO4 on production of phytase
硫酸铵 (NH4) 2SO4 ( %)
0 1 115 2 215 3
酶活 Activity (U·g - 1) 780 1150 1890 2230 1920 1530
表 7 　放大培养试验
Table 7 Enlargement culture assay
实验号 No.
1 2 3 4
酶活 Activity (U·g - 1) 1570 1580 1580 1590
4 　结 　　语
本研究经分离筛选、采用亚硝基胍诱变获得 1
株产酶量高且性能稳定的高产菌株 L H374 ,比出发
菌株 L H37 酶活提高了 48 %. 在研究其固态发酵条
件的基础上进行了扩大生产试验 ,结果发现该菌株
产酶量高且性能稳定 ,能够大量生产. 从试验结果
看 ,诱变育种仍然是一种有效的育种方法 ,因此要实
现植酸酶的工业化生产 ,更有效地提高发酵酶活 ,有
必要从菌种方面作进一步研究[25 ,30 ] .
固体发酵工艺简单 ,原料易得 ,投资小 ,成本低 ,
用于绿色木霉生产是可行的[25 ,28 ,30 ] . 固体培养基中
水分含量对菌体的生长及酶的产生都有很大的影
响. 水分含量太少 ,不利于菌体生长 ,太高不利于代
谢产物积累. 结果表明 ,含水量为 60 %时产酶量最
高 ,低于 55 %或高于 70 %产酶量都不高. 这可能是
水分低于 55 %时 ,培养基水活度偏低 ,菌体延缓期
延长 ,菌体生长缓慢 ;水分高于 70 %时对数生长期
延长 ,不利于代谢产物积累. 这与其它文献报道的最
适含水量略低一点 ,可能是没有把原料的含水量计
算在内[12 ,25 ]的缘故.
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