全 文 ：红树林细菌 Rhodococcus ruber 1 K降解邻苯
二甲酸二丁酯的研究 3
李魁晓1 　顾继东1 ,2
(1 中国科学院南海海洋研究所 , 广州 510301 ;2 香港大学 ,香港)
Biodegradation of di2n2butyl phthalate by mangrove microorganism Rhodococcus ruber 1 K. L I Kuixiao1 , GU Ji2
dong1 ,2 (1 South China Sea Institute of Oceanography , Chinese Academy of Sciences , Guangz hou 510301 , Chi2
na ; 2 U niversity of Hongkong , Hongkong , China) . 2Chin. J . A ppl . Ecol . ,2005 ,16 (8) :1566～1568.
A di2n2butyl phthalate (DBP) degrading bacterium Rhodococcus ruber was isolated from mangrove soil ,and its
degrading characteristics were studied. The results showed that the bacterium could grow well on the substrate
with DBP as the sole source of carbon and energy ,and the DBP of 50 mg·L - 1 could be completely degraded after
48 h. Under aerobic condition ,the tentative pathway proposed for DBP degradation was through monoester ini2
tially ,then phthalic acid ,and finally CO2 and H2O.
Key words 　Di2 n2butyl phthalate , Biodegradation , Mangrove.
文章编号 　1001 - 9332 (2005) 08 - 1566 - 03 　中图分类号 　S512 　文献标识码 　A
3 中国科学院“百人计划”项目 (5270122)和国家“863”计划资助项目
(2002AA601160) .3 3 通讯联系人. E2mail :jdgu @hkucc. hku. hk
2004 - 10 - 22 收稿 ,2005 - 03 - 03 接受.
1 　引 　言
邻苯二甲酸酯类化合物 ( PAEs) 是世界上生产量大、应
用面广的人工合成化合物. 1933 年 Waldo Semon 首先将邻
苯二甲酸二丁酯用于 PVC 生产 ,得到了大幅度改性后的商
品化树脂. 从此 ,邻苯二甲酸酯作为增塑剂得到广泛应用. 由
于作为增塑剂的邻苯二甲酸酯与 PVC 聚合物及其他材料并
非通过共价键结合 ,在产品的使用过程中及处置后很容易被
释放到环境中[2 ,16 ] . 塑料制品的全球性大量应用导致邻苯二
甲酸酯在环境中普遍存在 [6 ,7 ] . 城市污泥中可以普遍检测到
PAEs[6 ,9 ,13～15 ,17 ,20 ] ,由于城市污泥的农用导致在农作物或
者农产品中也可以检测到 PAEs 的存在 [3～5 ] . 邻苯二甲酸酯
具有一般毒性和致畸、致突变性 ,且某些化合物还具有致癌
活性[10 ,21 ] . 同时邻苯二甲酸酯类某些化合物如 DBP、DEHP
还是环境激素类物质 ,作为内分泌干扰素可能干扰动物及人
类的生殖系统和发育 [1 ,8 ,12 ] . 中国环境检测总站和美国 EPA
均将 DBP、DEHP 等列为优先控制污染物 [11 ,19 ] . DBP 在自然
环境中非常稳定 ,水解半衰期约为 20 年. 微生物降解是自然
环境中邻苯二甲酸酯完全矿化的主要途径 [18 ] .
红树林土壤微生物是红树林生态系统的重要组成部分 ,
在营养循环中起着重要作用. 红树林生态系统的多样性使得
红树林土壤微生物对环境存在多方面影响 [22 ] . 有关红树林
土壤微生物对 DBP 的生物降解方面的研究未见报道. 本实
验从红树林底泥中分离得到一株邻苯二甲酸酯降解菌
Rhodococcus ruber 1 K ,并对该菌株对邻苯二甲酸二丁基酯的
生物降解特性以及降解途径进行了研究.
2 　材料与方法
211 　供试材料
所用底物邻苯二甲酸二丁酯 (di2 n2butyl phthalate ,DBP)
由香港大学生态学及生物多样性系提供 ,所用红树林土壤取
自香港米浦自然生态保护区 ,冰箱中保存备用.
212 　微生物培养与纯化分离
在 250 ml 锥形烧瓶中加入土壤样品 10 g ,150 ml 无机
盐培养基以及邻苯二甲酸二丁酯作为唯一碳源和能量来源.
培养基主要含有下列矿物质 ( mg·L - 1 ) : K2 HPO4 ·3H2O
1 050 , KH2 PO4 200 , CaCl2 50 , MgCl2 ·6H2O 1 070 , FeCl2 ·
4H2O 16 , (NH4) 2 SO4 1 000 ,NaCl 5 000. 培养基的初始 p H 值
调到 710 ±011. 固体培养基为上述液体培养基中加入 20 g·
L - 1的琼脂.
将烧瓶放置于摇床 (30 ±015 ℃) 上培养 ,转速为 150
rpm.降解邻苯二甲酸二丁酯的菌种约每周转接一次 ,每次将
10 ml 培养液转移到一个盛有 140 ml 的新制矿物盐培养基的
烧瓶中 ,其邻苯二甲酸二丁酯浓度递增. 驯化后 ,将菌液转接
到含有相应底物的平板培养基上进行平板划线分离 ,30 ±015
℃培养箱培养 ,如此重复 ,直到得到纯菌株. 验证菌株降解性
能获得一株邻苯二甲酸二丁基酯的降解菌.经过 16S rDNA 分
子生物学鉴定 ,该菌株为赤红球菌 ( Rhodococcus ruber) .
213 　生物降解试验
取在平板上生长的菌株接种于含有 50 mg·L - 1 DBP 的
应 用 生 态 学 报 　2005 年 8 月 　第 16 卷 　第 8 期 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
CHIN ESE JOURNAL OF APPL IED ECOLO GY ,Aug. 2005 ,16 (8)∶1566～1568
培养基中振荡培养. 每 6 h 取样一次 ,冷冻 ( - 20 ℃) 储藏备
用.
214 　分析方法
由于邻苯二甲酸二丁基酯具有较高的正辛醇2水分配系
数 ( Kow = 316 ×105) ,吸附能力很强. 为防止过滤过程中吸
附到滤膜上 ,在邻苯二甲酸二丁酯降解实验样品中加入同体
积甲醇 ,经孔径为 012μm 注射器滤膜过滤后 ,进行高效液相
色谱分析. 为避免吸附在滤膜上的邻苯二甲酸酯或其代谢物
的干扰 ,滤液的前 5 滴废弃不用. 样品用 HP1100 型高效液
相色谱仪系统分离并量化. 色谱柱为 Hypersil ODS C8 (410 ×
125 mm) . 母体化合物以及降解中间产物的分离在反相液相
色谱柱上完成. 分离样品中邻苯二甲酸二丁酯及其降解中间
产物的流动相为甲醇和水 (水中含 012 mol·L - 1 p H 310 的磷
酸) ,梯度洗脱. 具体如下 :0～5 min V (甲醇) ∶V ( H2O) = 20∶
80 ;5～20 min V (甲醇) ∶V ( H2O) = 90∶10 ,总运行时间 25
min. 柱温 30 ℃,流速 015 ml·min - 1 .
微生物生物量采用 UV22100 型分光光度计在 600 nm
下测量 OD 值定量. 因培养液中存在可沉淀絮体 ,只测量上
层样品.
3 　结果与分析
311 　细菌降解过程分析
从图 1 可以看出 ,细菌降解邻苯二甲酸二丁基酯 (DBP)
时 ,红树林细菌 ( Rhodococcus ruber 1 K)的生长起始延滞期很
短 ,很快进入对数期迅速生长 ,邻苯二甲酸二丁基酯被快速
降解. 随着邻苯二甲酸二丁基酯的降解 ,样品在 600 nm 的
OD 值不断升高即细菌生物量不断增加. 接种细菌 18 h (对
数后期)邻苯二甲酸二丁酯已被完全降解. 邻苯二甲酸二丁
酯在降解过程中产生邻苯二甲酸一丁基酯 ( MBP) ,到 12 h
时邻苯二甲酸一丁基酯的含量达到最大值 ,随后也被降解 ,
48 h 后邻苯二甲酸一丁基酯也完全被降解.
图 1 　Rhodococcus ruber 1k 对邻苯二甲酸二丁基酯的生物降解及其
生长量变化
Fig. 1 Biodegradation of di2 n2butyl phthalate ( DBP) by Rhodococcus
ruber 1k and its biomass change.
　　图 2 为接种细菌后不同时间样品的高效液相色谱图 ,从
图中可以看出 ,反应起始时 (图 2a) ,只有 201599 min 的唯一
峰 ,它代表了 DBP 的起始浓度值 ;反应至 6 h (图 2b) ,在
151362 min 出现了 1 种主要中间代谢产物峰值 ,反应至 12 h
(图 2c) ,DBP(201599 min) 的峰值明显降低 ,在 151362 min
的主要中间代谢产物的峰值则明显增大 ;反应至 18 h (图
2d) ,DBP 几乎完全被降解转化 ,同时 151362 min 的峰值也
开始减少.
图 2 　邻苯二甲酸二丁基酯 (DBP)的生物降解过程高效液相色谱图
Fig. 2 Representative HPLC chromatograms of di2 n2butyl phthalate
degradation.
a)起始 The beginning ;b) 6 h ;c) 12 h ;d) 18 h.
312 　降解途径分析
根据高效液相中的保留时间以及全波长紫外吸收光谱
结合邻苯二甲酸 ( PA) 标准样品分析 ,邻苯二甲酸二丁酯降
解时生成了邻苯二甲酸一丁酯和邻苯二甲酸两种主要中间
产物 ,可以推断邻苯二甲酸二丁酯的降解过程为邻苯二甲酸
二丁基酯首先断裂一个酯键生成邻苯二甲酸一丁酯 ,然后邻
苯二甲酸一丁基酯再断裂另外一个酯键生成邻苯二甲酸最
终完全矿化生成 CO2 和 H2O. 红树林底泥中分离出的细菌
Rhodococcus ruber 1 K对邻苯二甲酸二丁基酯 (DBP) 的生物
降解途径可以表示为 :
4 　讨 　　论
试验证明 ,红树林土著微生物 Rhodococcus ruber 1 K 对
邻苯二甲酸二丁基酯具有较强的降解能力 ,能以 DBP 为唯
一碳源和能源生长 ,可在 48 h 内将 50 mg·L - 1的邻苯二甲
酸二丁酯及其中间产物完全降解 ;其对邻苯二甲酸二丁酯的
降解途径是首先在酶的催化下水解一个酯键生成邻苯二甲
酸一丁基酯 ,然后再水解另一个酯键生成邻苯二甲酸 ,最终
开环完全降解生成 CO2 和 H2O. 邻苯二甲酸一丁基酯的降
解效率明显低于邻苯二甲酸二丁酯. 这可能是由于细菌降解
邻苯二甲酸一丁基酯生成了邻苯二甲酸 ,而细菌生长过程可
以同时利用邻苯二甲酸一丁基酯和邻苯二甲酸 ,所以邻苯二
甲酸一丁基酯的降解速度变慢.
76518 期 　　　　　　　　李魁晓等 :红树林细菌 Rhodococcus rubber 1 K降解邻苯二甲酸二丁酯的研究 　　　　　　　　　　　
参考文献
1 　Allsopp M ,Santillo D ,Johnston P. 1997. Poisoning the Future : Im2
pacts of Endocrine2Disrupting Chemicals on Wildlife and Human
Health. The Netherlands : Greenpeace International.
2 　Bauer MJ , Herrmann R. 1997. Estimation of the environmental
contamination by phthalic acid ester leaching from household
wastes. Sci Total Envi ron ,208 :49～57
3 　Cai Q2Y(蔡全英) ,Mo C2H (莫测辉) , Zhu X2Z(朱夕珍) , et al .
2003. PAEs in composts of municipal sludge and rice straw. Chin J
A ppl Ecol (应用生态学报) ,14 (11) :1993～1996 (in Chinese)
4 　Cai Q2Y(蔡全英) ,Mo C2H (莫测辉) , Zhu X2Z(朱夕珍) , et al .
2003. Effect of municipal sludge and chemical fertilizers on phthalic
acid esters ( PAEs) contents in Ipomoea aquatica grown on paddy
soils. Chin J A ppl Ecol (应用生态学报) ,14 (11) :2001～2005 (in
Chinese)
5 　Chen Y2Z (陈英旭) , He Y2F (何云峰) ,Lin Q (林 　琦) , et al .
1998. Translocation and distribution of organic toxic chemicals in
soil plant system. J Zhejiang A gric U niv (浙江农业大学学报) ,24
(1) :1～4 (in Chinese)
6 　Gaim CS , Atlas E ,J r. Powers MA. 1984. Phthalate Esters. In :
Hutzinger O ,ed. Anthropogenic Compounds. Vol 3 ,Part C. Berlin :
Springer2Verlag. 67～142
7 　Giam CS ,Chah HS ,Neff GS. 1978. Phthalate ester plasticizers : A
new class of marine pollutants. Science ,199 :419～421
8 　Gray L E ,Wolf C ,Lambright C , et al . 1999. Administration of po2
tentially antiandrogenic pesticides (procymidone ,linuron ,iprodione ,
chlozolinate , p , p ’2DDE , and ketonazole ) and toxic substances
( dibutyl2 and diethylhexyl phthalate , PCB 169 , and ethane
dimethane sulphonate) during sexual differentiation produces di2
verse profiles of reproductive malformations in the male rat . Toxicol
Ind Health ,15 :94～118
9 　Jacobs L W ,O’Connor GA ,Overcash MA , et al . 1987. Effects of
trace organics in sewage sludge on soil plant systems and assessing
their risk to humans. Page AL , eds. Land Application of Sludge
Food Chain Implications. Chelsea ,Michigan :Lewis Publishers Inc.
101～143
10 　Jin Z2H (金朝晖) ,Li H2L (李红亮) ,Chai Y2T (柴英涛) . 1997.
Harmful effect of phthalic acid ester on human and environment .
Chin J S hanghai Envi ron Sci (上海环境科学) ,16 (12) :39～42
(in Chinese)
11 　Jin X2C(金相灿) . 1990. Chemistry of Organic Pollutants. Beijing :
Qinghua University Press. 266～267 (in Chinese)
12 　Jobling S ,Reynolds T ,White R , et al . 1995. A variety of environ2
mentally persistent chemicals ,including some phthalate plasticizers ,
are weakly estrogenic. Envi ron Health Persp ,103 ( suppl. 7) : 582
～587
13 　Mo C2H(莫测辉) , Wu Q2T (吴启堂) ,Cai Q2Y(蔡全英) , et al .
2000. Utilization of municipal sludge in agriculture and sustainable
development. Chin J A ppl Ecol (应用生态学报) , 11 ( 1) : 157～
160 (in Chinese)
14 　Mo C2H(莫测辉) ,Cai Q2Y(蔡全英) , Wu Q2T (吴启堂) , et al .
2001. A study of phthalic acid esters in the selected municipal
sludges of China. China Envi ron Sci (中国环境科学) ,21 (4) :362
～366 (in Chinese)
15 　Muller J , Kordel W. 1993. Occurrence and fate of phthalates in soil
and plants. Sci Total Envi ron ,93 :431～437
16 　Nilsson C. 1994. Phthalate Acid Esters Used as Plastic Additive2
Comparisons of Toxicological Effects. Brussels : Swedish National
Chemicals Inspectorate.
17 　Smith SR. 1996. Agricultural Recycling of Sewage Sludge and the
Environment . Wallingford :CAB International. 207～236
18 　Staples CA ,Peterson DR ,Parkerton TF , et al . 1997. The environ2
mental fate of phthalate esters : A literature review. Chemosphere ,
35 :667～749
19 　US EPA. 1992. Code of Federal Regulations. 40 CFR ,Part 136.
20 　Wang MJ ,Jones KC. 1994. Behavior and fate of chlorobenzenes
(CBs) introduced into soil2plant systems by sewage sludge applica2
tion :A review. Chemosphere ,28 (7) :1325～1360
21 　Zhao Z2H (赵振华) . 1991. Review of environmental and human
health hazards of phthalate esters. Chin J Envi ron Chem (环境化
学) ,10 (3) :41～43 (in Chinese)
22 　Zhuang TC ,Lin P. 1995. Soil microbial function of Kandelia can2
del mangrove forest . An Asia2pacific Symposium on Mangrove E2
cosystems( Programme and Abstracts) . Hong Kong : Hong Kong U2
niversity of Science and Technology Press. 41～42
作者简介 　李魁晓 ,男 ,1978 年生 ,硕士研究生. 主要从事环
境与分子微生物学研究. Tel : 020289023345 ; E2mail : kuixi2
ao2008 @yahoo. com. cn
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