全 文 ：一株高效菲降解菌的筛选及降解条件研究 3
周　乐　盛下放 3 3 　张士晋　刘　静
(南京农业大学生命科学学院 农业部农业环境微生物工程重点开放实验室 ,南京 210095)
【摘要】　从南京某石化厂排污口附近采集土样 ,以菲为碳源的选择性培养基分离筛选到一株菲高效降解
菌 F10a ,根据形态和生理生化特性初步鉴定为芽孢杆菌属 ,并对其降解菲的特性及各种影响因素进行了
研究. 结果表明 ,F10a 在 50 mg·L - 1的条件下 ,28 ℃振荡培养 27 h ,菲的降解率达到 98. 12 % ;静置培养 84
h ,菲的降解率达到 98. 47 %. p H 值分别为 4、6、8 时 , F10a 对菲具有良好的降解效能 ;p H 值为 10 时 F10a
不生长. Zn2 + 与 Pb2 + 的存在不影响 F10a 的降解效能 ,Cu2 + 可以延缓菲的降解 ,Cr2 + 对 F10a 有毒性. F10a
在菲浓度为 200 mg·L - 1时 ,28 ℃振荡培养 84 h ,降解率为 99. 6 %. 菲的降解程度与细菌数量的增长呈正
相关关系.
关键词 　降解 　菲 　多环芳烃 　芽孢杆菌
文章编号 　1001 - 9332 (2005) 12 - 2399 - 04 　中图分类号 　Q93 ;X172 　文献标识码 　A
Screening of a phenanthrene2degrading bacterium and its degradation conditions. ZHOU Le ,SHEN G Xiafang ,
ZHAN G Shijin ,L IU Jing ( Key L aboratory of Microbiological Engineering of A gricultural Envi ronment , Min2
ist ry of A griculture , College of L if e Science , N anjing A gricultural U niversity , N anjing 210095 , China) .2Chin. J . A ppl . Ecol . ,2005 ,16 (12) :2399～2402.
Several PAHs2degrading bacteria were isolated from the soil near a petrochemicals factory ,and one strain F10a i2
dentified as B . sphaericus was chosen for use. The study on the phenanthrene2degradation potential of the strain
and its affecting factors showed that at 28 ℃,the degradation rate of phenanthrene (50 mg·L - 1) was 98112 %
after 27 hours rotary culture ,and 98. 47 % after 84 hours static culture. F10a had a good phenanthrene2degrada2
tion capability when the p H was 4 ,6 and 8 ,but its growth was inhibited when p H was 10. Cr2 + was toxic to the
strain ,Cu2 + could delay the degradation of phenanthrene ,while Zn2 + and Pb2 + had no significant effects. The
degradation rate of phenanthrene (200 mg·L - 1) was 99. 6 % after 84 hours rotary culture. A significant positive
relationship was found between bacterial growth and phenanthrene degradation.
Key words 　Degradation , Phenanthrene , Polycyclic aromatic hydrocarbons , B . sphaericus.
3 国家自然科学基金资助项目 (40371070) .3 3 通讯联系人.
2005 - 01 - 07 收稿 ,2005 - 04 - 12 接受.
1 　引 　　言
多环芳烃 ( PAHs) 是指 2 个或 2 个以上苯环的
疏水性芳香族化合物. 在环境中 ,多数 PAHs 因具有
难降解性、致癌性、致畸性和致突变性 ,所以受到严
重关注[8 ,11 ,19 ,20 ] . 多环芳烃 ( PAHs)随三废排入环境
中的量逐年增加 ,造成长期、广泛的污染. 我国许多
城郊地区土壤中均报道存在较为严重的 PAHs 污
染[4 ,13 ] .
菲为三环多环芳烃代表物 ,生物降解是污染环
境中菲去除的主要途径[5 ,7 ,15 ] . 菲的降解已有不少
报道[14 ,16 ,17 ] ,但目前已知的菌株对菲的降解速度及
其效能不甚理想. 本研究在长期被石油与重金属污
染的土壤中筛选高效、快速菲降解菌株 ,并研究其降
解条件 ,针对目前土壤中大多存在重金属与多环芳
烃复合污染的状况 ,研究菲与重金属共存条件下菌
株对菲的降解效能 ,以期为菲污染土壤的生物修复
提供科学依据与试验材料[20 ,21 ] .
2 　材料与方法
211 　主要培养基
21111 有氮培养基 　蔗糖 10 g , (NH4) 2 SO4 1 g , K2 HPO4 2 g ,
MgSO4·7H2O 015 g ,NaCl 011 g ,酵母膏 015 g ,CaCO3 015 g ,
琼脂 20 g ,蒸馏水1 000 ml ,p H 710. 011 MPa ,121 ℃,蒸汽灭
菌 30 min.
21112 菲降解培养基 　(NH4) 2 SO4 1 g , K2 HPO4 2 g ,MgSO4·
7H2O 015 g , NaCl 011 g ,酵母膏 015 g ,琼脂 20 g ,蒸馏水
1 000 ml ,p H 710. 011 MPa ,121 ℃,蒸汽灭菌 30 min.
21113 菲降解菌筛选固体培养基 　菲降解培养基倒平板 ,表
面喷涂菲丙酮溶液.
212 　菌种分离鉴定及菌液制备
称取 1 g 所采集土样加入到 50 ml 菲降解液体培养基
中 ,28 ℃振荡培养 ,采用定时定量逐步提高菲浓度的方法
(浓度为 50 mg·L - 1) ,3 d 一个周期 ,2 周后经反复平板划线
应 用 生 态 学 报 　2005 年 12 月 　第 16 卷 　第 12 期 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
CHIN ESE JOURNAL OF APPL IED ECOLO GY ,Dec. 2005 ,16 (12)∶2399～2402
得到单一菌落 ,将得到的菌株点接在菲降解菌筛选固体培养
基上 ,其中一株点接后 1 d 即产生明显降解圈且长势旺
盛[6 ] ,故选取此株菌进行降解效能的测定. 将其命名为
F10a.
菌悬液的制备 :菌株接种到有氮液体培养基上 ,振荡 28
℃培养 48 h ,离心 ,弃去上清液加入无菌去离子水振荡混匀 ,
再次离心 ,重复 2 次. 将细胞浓度调整到 1150 ×1010 个·
ml - 1 ,备用.
本研究采取一般分类方法 ,根据细菌的形态特征及其生
理生化特征将菌种鉴定到属 [2 ] .
213 　降解反应
21311 菌株对菲的降解 　1)振荡条件下降解 :加入菌悬液至
20 ml 菲降解液体培养基 ,使反应瓶中细胞浓度为 715 ×108
个·ml - 1 (下同) . 加入菲丙酮溶液 ,使瓶中菲浓度达 50 mg·
L - 1 (下同) ,28 ℃振荡培养 ,从接种后 15 h 开始 ,每隔 3 h 整
瓶提取培养液 ,按文献 [9 ]方法测定培养液中菲浓度 ,稀释平
板涂布法测定细菌数量. 2) 静置条件下降解 :100 ml 摇瓶装
入 50 ml 菲降解液体培养基 ,放入 28 ℃恒温箱静置培养 ,从
接种后 24 h 开始 ,每隔 12 h 整瓶提取培养液 ,测定菲浓度和
细胞数量.
21312 不同影响因素对 F10a 降解菲效能的影响 　1) 不同
p H值的降解 :将菲降解液体培养基的 p H 值分别调至 4、6、
8、10 ,28 ℃振荡培养 24 h 后测定菲浓度和细菌数量. 2)不同
重金属离子的作用 :菲降解液体培养基中加入重金属离子 ,
Cu2 + 浓度为 50 mg·L - 1 、Zn2 + 浓度为 100 mg·L - 1 、Pb2 + 浓度
为 200 mg·L - 1 、Cr2 + 浓度为 50 mg·L - 1 ,28 ℃振荡培养 27 h
后测定菲浓度和细菌数量. 3) 不同浓度菲的降解 :向加入菌
悬液 (最终细胞浓度为 715 ×108 个·ml - 1) 的菲降解液体培
养基中加入菲丙酮溶液 ,使瓶中菲浓度分别为 100 mg·L - 1 、
200 mg·L - 1 ,28 ℃振荡培养 ,从接种后第 18 h 开始 ,每隔 12
h 整瓶提取培养液 ,测定菲浓度和细菌数量.
214 　分析方法
21411 细菌数量测定 　采用平板稀释涂布法测定培养液中
的活菌数量[12 ] .
21412 菲含量测定 　定时整瓶提取培养液 ,经环己烷萃取 ,
并用硅胶 G薄层层析法分离 ,石油醚溶解提取后 ,在 252 nm
测定紫外吸光度 ,以菲标准溶液梯度建立标准曲线 ,得出培
养液中的菲浓度.
3 　结果与分析
311 　菌株 F10a 对菲的降解效能
31111 振荡培养条件下对菲的降解 　试验结果表明
(图 1a) ,菌株 F10a 在培养 15 h 后开始降解菲 ,27 h
的降解率达 98112 % ,细菌数量从 715 ×108 个·
ml - 1增至 1126 ×1010个·ml - 1 ,说明 F10a 可以利用
菲作为主要碳源进行生长繁殖.
31112 静置培养条件下对菲的降解 　24 h 的降解情
　
图 1 　振荡 (a)和静置 (b)培养条件下 F10a 对菲的降解
Fig. 1 Degradation of phenanthrene by F10a in rotary (a) and static (b)
conditions.
Ⅰ1 菲浓度 Phenanthrene concentration ; Ⅱ1 细菌数量 Bacteria num2
ber. 下同 The same below.
况与对照相比没有差别 ,48 h 的降解率为 6011 % ,
72 h 的降解率为 89146 % , 84 h 的降解率达到
98147 %. 细菌数量增加到 1149 ×1010个·ml - 1 . 说明
菌株 F10a 在低氧情况下对菲仍具有很高的降解效
能 (图 1b) .
312 　环境条件对 F10a 降解菲效能的影响
31211 不同 p H 值条件下菲的降解 　测定结果表明 ,
在弱酸性或中性环境中 ,F10a 对菲具有良好的降解
效能 ,细菌数量亦明显增加. 而在碱性条件下 , F10a
的生长受到强烈抑制 ,菲几乎没有降解 ,测得细菌数
量为 8153 ×106 个·ml - 1 ,说明细菌在 p H 为 10 时
已开始死亡.
表 1 　不同 pH值对菲降解的影响
Table 1 Effect of different pH on degradation of phenanthrene
p H 降解率
Degradation rate
( %)
细菌数量
Bacteria number
( ×109 CFU·ml - 1)
4 63146 ±10109 8154
6 88181 ±9160 10130
8 82179 ±8178 9104
10 2190 ±0104 0100853
CK(p H = 7) 83138 ±7146 9127
31212 重金属离子对菌株 F10a 降解菲的影响 　
Zn2 + (100 mg·L - 1) 与 Pb2 + (200 mg·L - 1) 对 F10a
的降解效能几乎没有影响. 含有 Cr2 + (50 mg·L - 1)
的培养基中 ,细菌不生长 ,说明对 F10a 有毒性. 在含
有 Cu2 + (50 mg·L - 1)的培养基中细菌生长缓慢 ,菲
的降解效能较低 ,继续培养至 96 h ,细菌数量大量增
加 ,菲降解基本完全 ,说明 Cu2 + ( 50 mg·L - 1 ) 对
F10a 降解菲的效能有延缓作用.
0042 应 　用 　生 　态 　学 　报 　　　　　　　　　　　　　　　　　　16 卷
表 2 　重金属离子对菲降解的影响
Table 2 Effect of different heavy metal ions on degradation of phenan2
threne
重金属离子
Heavy matal
ions
降解率
Degradation rate
( %)
细菌数量
Bacteria number
( ×109 CFU·ml - 1)
Pb2 + 98162 ±0157 13170
Zn2 + 92196 ±4101 12120
Cu2 + 3100 ±1130 1121
Cr2 + 1130 ±0197 01000691
CK 98112 ±0105 12162
31213 不同浓度菲的降解试验 　F10a 在 24 h 时对
100 mg ·L - 1 菲的降解率为 5017 % ; 48 h 时为
98115 % ,细菌数量增加到 2114 ×1010个·ml - 1 . 振荡
培养 84 h , 200 mg·L - 1菲的降解率为 9916 % ,细菌
数量增加到 4106 ×1010个·ml - 1 ,说明 F10a 也可以
利用高浓度的菲 (图 2) .
图 2 　F10a 对不同浓度菲的降解
Fig. 2 Degradation of different concentrations phenanthrene by F10a.
a) 100 mg·L - 1 ; b) 200 mg·L - 1.
313 　菌株鉴定
菲降解菌株 F10a ,革兰氏染色为阳性 ,芽孢染
色可观察到明显的绿色芽孢 ,菌落直径 2～3 mm ,
呈黄色 ,外形光滑 ,隆起 ,边缘不整齐 ,菌体为短杆
状 ,根据形态和生理生化反应特性 ,初步鉴定为芽孢
杆菌属.
4 　讨 　　论
　　研究表明 ,在被 PAHs 污染的土壤中 ,微生物降
解 PAHs 的能力远远高于未受污染的土壤[18 ] . 从这
些土壤中分离筛选高效 PAHs 降解菌 ,是开展 PAHs
污染土壤生物修复的基础. 在相同条件下 ,本研究分
离得到的菌株对菲的降解效能高于目前已报道的高
效降解菌株对菲的降解效能[9 ,14 ,16 ] ,而具有重金属
抗性的 PAHs 降解菌未见报道. 目前土壤中大多存
在有机与无机复合污染 ,而无机污染又以重金属污
染为主 ,本研究分离得到的一株芽孢杆菌 F10a ,由
于长期处于石油与重金属复合污染环境下 ,具有高
效降解菲与抗重金属胁迫的特性. 该菌株在摇瓶培
养条件下 ,30 h 内对菲 (50 mg·L - 1) 的降解率可达
98 %以上并可降解较高浓度的菲. 研究发现培养液
p H 值随细菌数量增长而下降 ,说明菲降解过程中产
生了酸性官能团 ,与文献[1 ,3 ]报道的菲降解机理相
一致. 在弱酸性、中性及弱碱性环境中 ,降解效能不
受影响 ,在碱性环境中 ,菌株的生长受到抑制. 在低
氧条件下 ,F10a 对菲仍具有很高的降解效能. 本研
究表明在一定浓度下 ,Zn2 + 、Pb2 + 等重金属对 F10a
降解菲的效能没有影响 ,Cu2 + 可以延缓菌株对菲的
降解 ,但降解率不受影响. 本研究说明菌株 F10a 不
仅具有很强的菲降解效能而且具有较强的环境适应
性.菌株 F10a 在 PAHs 污染土壤中的存活状况、菲
的降解效能及其影响因素、抗重金属胁迫机理值得
进一步研究.
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作者简介 　周 　乐 ,男 ,1981 年生 ,硕士生. 研究方向为土壤
有机污染微生物修复技术. 025284395125 ; E2mail : linktozl @
yahoo. com. cn
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