全 文 ：降解性细菌对菲诱导的蛋白及酶活性应答反应 3
钟　鸣1 ,2 　周启星1 3 3 　许华夏1 　吴晓丹2 　李玉双2
(1 中国科学院沈阳应用生态研究所陆地生态过程重点实验室 ,沈阳 110016 ;2 沈阳农业大学 ,沈阳 110161)
【摘要】　测定了 3 株以菲为唯一碳源的芽孢杆菌属 ( B acillus) 菌株 (BA11、BA19 和 BA27) 的降解能力、多
酚氧化酶和过氧化氢酶的活性及蛋白变化. 结果表明 ,当菲浓度在 200 mg·L - 1以下时 ,3 株菌多酚氧化酶
和过氧化氢酶的活性随菲浓度的提高变化不大 ,其中 BA19 和 BA27 菌株表现出较高的稳定性. 当菲浓度
为 200 mg·L - 1时 ,BA27 诱导表达了一条分子量为 27 000 道尔顿的新蛋白条带 ,同时有些蛋白的合成受
到抑制. 因此可以认为 ,诱导产生的新蛋白与其污染条件下的细菌降解能力及稳定性有关.
关键词 　菲 　降解细菌 　酶活性 　生物修复
文章编号 　1001 - 9332 (2004) 05 - 0871 - 04 　中图分类号 　X17115 　文献标识码 　A
Revulsive response of protein and enzyme activity of degradative Bacilluss strains by phenanthrene. ZHON G
Ming1 ,2 ,ZHOU Qixing1 ,XU Huaxia1 ,WU Xiaodan2 ,L I Yushuang2 ( Key L aboratory of Terrest rial Ecological
Process , Institute of A pplied Ecology , Chinese Academy of Sciences , S henyang 110016 , China ;2 S henyang A gri2
cultural U niversity , S henyang 110161 , China) . 2Chin. J . A ppl . Ecol . ,2004 ,15 (5) :871～874.
Three strains of B acillus sp . BA11 ,BA19 and BA27 ,which can grow when phenanthrene is taken as the sole
source of carbon and energy ,were isolated from an oil2contaminated soil. Their crude extract was used to test the
activities of polyphenol oxidase and catalase. The results demonstrated that all the three strains did not show a
significant change in the activity of both enzymes when phenanthrene was lower than 200 mg·L - 1 . Under dif2
ferent phenanthrene concentration , the enzyme activities of strains BA19 ,BA27 showed a higher stabilization
than BA11. Using the SDS2PA GE contrasted the difference of proteins between the strains in normal medium
and the strains growing on phenanthrene ,the results showed that BA27 growing on phenanthrene synthesized a
new protein with 27 000 dal of molecular weight . At the same time ,the synthesis of some proteins was cancelled.
We conjecture that the new protein induced by phenanthrene may be related to the ability of phenanthrene degra2
dation and the stabilization of enzyme activity by the strain.
Key words 　Phenanthrene , Degradative bacterium , Enzyme activity , Bioremediation.3 国家杰出青年科学基金项目 (20225722)和中国科学院知识创新重
要方向资助项目 ( KZCX22SW2416) .3 3 通讯联系人.
2002 - 10 - 12 收稿 ,2003 - 02 - 28 接受.
1 　引 　　言
多环芳烃化合物 ( PAHs) 是指含有 2 个或 2 个
以上苯环的疏水性芳香族化合物. 在环境中 ,多数
PAHs因具有难降解性、致癌性、致畸性和致突变
性 ,所以受到严重关注 ,已成为污染生态学研究的重
点污染物[7 ,8 ,10 ,19～24 ] . 近年来 ,由于化石燃料燃烧、
废物焚烧、煤气/ 焦化污水、家庭洗涤污水以及原油
泄漏等污染源的膨胀[20 ] , PAHs 排入环境中的数量
迅速增加 ,造成广泛而长期的污染. 我国许多城郊地
区土壤中均报道存在较为严重的 PAHs 污染[9 ,16 ] .
20 世纪 90 年代以来 ,污染土壤的生物修复由
于具有效率高、速度快、成本低、反应条件温和以及
无二 次 污 染 等 显 著 优 点 而 得 到 了 迅 速 发
展[6 ,14 ,16～18 ] ,特别是利用环境微生物灵活的适应性
和遗传多样性 ,定向地富集培养和驯化专性环境微
生物 ,建立以微生物降解过程为核心的生物修复技
术 ,已成为国际上解决土壤环境污染问题的重要发
展方向[2 ,17 ,22 ] . 目前 ,含 PAHs 污水的治理以及污染
水体 PAHs 的修复研究相对领先[2 ] . 为此 ,我们开展
了石油污染土壤中具有降解功能细菌的分离、降解
特性和微观反应研究 ,为 PAHs 污染土壤生物修复
提供科学依据[23～25 ] .
2 　材料与方法
211 　菲降解菌的富集培养、分离筛选与测定
采集辽河油田曙光采油厂附近受石油污染的草甸棕壤 ,
在 30 ℃好氧条件下 ,用以菲为唯一碳源的 MS 液体培养基 ,
进行菲降解菌的驯化富集培养. 采用平板划线法 [13 ]初步分
离获得长势较好的纯菌株 (以 600 nm 处的浊度表示 3 株菌
BA11 号、BA19 号和 BA27 号的生长) . 根据细菌的形态特征
及其生理生化特征 ,按照各分科检索进行菌株鉴定 [13 ] .
应 用 生 态 学 报 　2004 年 5 月 　第 15 卷 　第 5 期 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
CHIN ESE JOURNAL OF APPL IED ECOLO GY ,May 2004 ,15 (5)∶871～874
212 　菲浓度的测定[12 ]
定时、定量取含 50 mg·L - 1菲的培养液 ,经环已烷萃取 ,
并用硅胶 G薄层层析法分离 ,石油醚溶解提取后 ,在 252 nm
下测紫外吸光度 ,以标准菲浓度梯度建立标准曲线 ,查出培
养液中菲的浓度.
213 　酶活性的测定
21311 粗酶液的制备 　将分离得到的 3 个菌株 BA11 号、
BA19 号和 BA27 号分别接入含有不同浓度 (0、50、100、150、
200 和 250 mg·kg - 1) 菲的 MS 培养基中 ,于 30 ℃振荡培养
12 h 后离心 ,收集菌体 ,以 011 mol·L - 1 p H810 硼酸缓冲液
冰浴中进行超声波破碎 ,5 600 g 冷冻离心 40 min 后 ,取上清
液 (粗酶液) .
21312 多酚氧化酶活性的测定 　用以邻苯二酚为底物的方
法测定. 以每分钟 OD398值变化 0101 为 1 个酶活单位 ,用
U1g - 1 ( FW)表示酶的比活性[3 ] .
21313 过氧化氢酶活性的测定 　用改进的 Beers 和 Sizers[3 ]
方法测定. 每分钟 OD240值降低 010436 为 1 个酶活单位 ,用
U·g - 1 ( FW)表示酶的比活性.
214 　蛋白表达测定
SDS - 聚丙烯酰胺凝胶电泳 ,考马斯亮兰 R250染色. 按
Bradford[15 ]的考马斯亮兰 G250法 ,测定其蛋白质含量.
3 　结果与分析
311 　降解菌的特征
得到的高效降解菲的纯菌株 BA11 号、BA19 号
和 BA27 号 ,革兰氏染色均为阳性 ,菌落直径均小于
1 mm ,呈乳白色 ,外形光滑 ,不透明 ,菌体为杆状. 经
生理生化试验初步鉴定 ,这 3 株菌均属于芽孢杆菌
属 ( B acill us) .
312 　降解反应
3 株芽孢杆菌降解菲的情况见图 1. 相对而言 ,
BA27 的降解能力最强 ,在对数生长期菲的浓度降
至 1317 mg·L - 1 ,而 BA11 的降解能力稍差. 3 株菌
的降解趋势基本一致 ,在反应初期 (12 h 以内) 降解
速度较快 ,降解率均达到 50 %以上.
图 1 　BA11、BA19、BA27 对菲的降解
Fig. 1 Degradation of phenathrene by BA11 ,BA19 and BA27 strains.
313 　酶活性的影响
酶活测定结果表明 ,在菲浓度为 250 mg·L - 1以
下时 ,菲对 BA19、BA27 两种菌株的过氧化氢酶活
性与多酚氧化酶活性的影响均不大 ,而 BA11 号菌
株的两种酶的活性水平高于 BA19、BA27 ,且对菲的
存在 ,酶活受到一定的影响. 随着菲浓度的增加 ,过
氧化氢酶活性有下降的趋势 ,而多酚氧化酶活性随
之略有升高 ,在 200 mg·L - 1处达到活性最高状态.
由此可见 ,BA11 对 200 mg·L - 1浓度的菲较为敏感
(图 2、3) .
图 2 　过氧化氢酶比活变化曲线
Fig. 2 Effects of phenathrene on catalase specific activity of BA11 ,BA19
and BA27 strains1
图 3 　多酚氧化酶的比活性变化曲线
Fig. 3 Effects of phenanthrene on polyphenol oxidase specific activity of
BA11 ,BA19 and BA27 strains1
314 　菲对菌株蛋白表达的影响
培养 20 h 后 ,比较 3 株菌在含 200 mg·L - 1菲
及不含菲的 MS 培养基中的可溶性蛋白质含量表
明 ,3 株菌在 200 mg·L - 1菲中的蛋白含量均高于正
常培养基中的可溶性蛋白质含量 ,尤其是 BA11 菌
株 ,可溶性蛋白含量明显增加 (表 1) .
同时 ,比较了在这两种培养基中菌株表达蛋白
的情况. 从凝胶上看出 (图 4) ,当菲浓度为 200 mg·
L - 1时 ,菌株产生的蛋白与无菲时的蛋白之间存在
278 应 　用 　生 　态 　学 　报 　　　　　　　　　　　　　　　　　　15 卷
着一些差别 ,特别是BA27 菌株 ,200 mg·L - 1菲诱导
其产生了一条 R f = 0165 的新蛋白谱带 (分子量约
为 27 000 Dal) .
表 1 　菲对芽孢杆菌可溶性蛋白质含量的影响
Table 1 Effects of phenanthrene on the content of soluble protein in
Bacillus
MS 培养基中菲浓度
Concentration in MS
菌种 Bacill us strain
BA11 BA19 BA27
菲1) (0 mg·L - 1) 3120 5109 6126
菲 (200 mg·L - 1) 4176 5122 7119
1) Phennthrene.
图 4 　BA11、BA19、BA27 在不同菲浓度下的蛋白电泳图谱
Fig. 4 Protein profiles of BA11 ,BA19 and BA27 by different concentra2
tion of phenanthrene1
1、3、5 分别为 BA27、BA19、BA11 在含 200 mg·L - 1菲的 MS 培养基
中生长的蛋白谱带 Lines 1 ,3 ,5 were protein profiles of BA11 ,BA19
and BA27 in MS medium containing 200 mg·L - 1 phenanthrene12、4、6
分别为 BA27、BA19、BA11 在不含菲的 MS 培养基中生长时的蛋白
谱带Lines 2 ,4 ,6 were protein profiles of BA11 ,BA19 and BA27 grow2
ing in MS medium without phenanthrene1M)标准蛋白分子量 Standard
molecular weight of proteins.
4 　讨 　　论
资料表明 ,用土壤中 PAHs 或其他烃类对表层
或亚表层微生物进行处理或驯化 ,可以提高降解
率[17 ] .这是目前开展生物修复的第一步 ,也是关键
的步骤 ,了解其降解能力及对污染的适应机理 ,是利
用降解性微生物进行原位生物修复技术的必要理论
基础. 一些研究表明 ,在被 PAHs 污染的土壤中 ,微
生物降解 PAHs 的能力远远高于未受污染的土
壤[4 ] .为了缩短筛选时间 ,本实验采用石油污染土
壤 ,进行分离、筛选、驯化土壤微生物 ,得到 3 株芽孢
杆菌 ,它们都可能以菲为唯一碳源 ,在培养条件下 ,
降解率均在 50 %以上 ,其中 BA27 的降解率可达
8112 %. 初步认为 ,3 株芽孢杆菌可作为降解菲的微
生物资源 ,进一步用于 PAHs 污染土壤的生物修复.
然而 ,微生物能够在一个地方生长 ,并在某个地
方建立种群 ,取决于影响其选择和扩散的多种生态
因素. 其中能够反映微生物不同代谢过程的生理适
应和遗传适应 ,是表征生态系统群落结构的重要参
数之一. 本研究测定了菲对多酚氧化酶、过氧化氢酶
的影响 ,结果显示降解能力较强的 BA27、BA19 菌
株表现出较好的稳定性和耐受性 ,而降解能力稍差
的BA11 菌株则对菲表现出一定的敏感性. 由此推
测 ,经驯化的菌株 BA27、BA19 能在以菲为唯一碳
源的条件下进行正常代谢 ,而对自身的生理没有强
烈的刺激 ;BA11 的降解能力及代谢过程有可能受
菲转化过程中一系列中间产物的影响 ,使其表现出
生理反应. 有报道指出 ,在 PAHs 污染的土壤中 ,
PAHs 的矿化存在共代谢方式[1 ,4 ,5 ,11 ] ,因此作为应
用于环境修复技术的预备菌株 ,可用于探索在复杂
条件下细菌的降解能力 ,使 BA11 在共代谢的途径
中充分发挥其生物降解功能.
通过对蛋白表达的研究 ,可以清楚地看到 ,
BA27 产生了一条新的蛋白条带 (27 000 Dal) . 由于
降解芳烃并不是生物体所必需的活动 ,在没有污染
存在时这部分功能不表达. 当生物体受到芳烃物质
诱导时 ,就可以表达这部分降解基因. BA27 很可能
在以菲为唯一碳源的基础上 , 诱导表达了参与
PAHs 降解的重要蛋白质 ,如进一步将此特异蛋白
进行分离纯化、活性测定 ,有可能揭示这种微生物对
环境遗传适应的进化机制 ,探索土壤微生物净化的
预警指标及方法.
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作者简介 　钟 　鸣 ,女 ,1971 年生 ,副教授 ,主要从事分子生
态学研究 ,发表论文 8 篇. E2mail : mingzh1 @sina. com
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