全 文 ：生产乳豆混合开菲尔的酵母菌株的筛选
耿媛，汪建明 *，李立英，贾磊
（食品营养与安全省部共建教育部重点实验室，天津科技大学食品工程与生物技术学院，天津 300457）
摘 要： 用于传统开菲尔的发酵酵母不适合发酵乳豆混合开菲尔。 通过测定发酵过程中的酸度、 残糖等指标， 从 S.
cerevisiae Y1、S. cerevisiae Y2、S. ellipsoideus Y3 及 S. fragrans Y4 四种酵母中筛选乳豆混合开菲尔的适合发酵菌
株。结果表明，S.cerevisiae Y1生长较好，产酸较强，利用糖能力中等，产醇适宜。发酵 32h 时，S. cerevisiae Y1 发酵的开
菲尔中活菌数为 7.26log 10CFU/mL，pH 为 5.52，酸度值为 0.57%，残糖为 3.10g/L，乙醇含量为 1547.60μg/g。结合
S. cerevisiae Y1 的开菲尔感官品质较优，因此将其作为乳豆混合开菲尔的最佳发酵菌株。
关键词：乳豆开菲尔；酵母；筛选
中图分类号：TQ926 文献标识码：A 文章编号：1674-506X（2012）02-0023-0004
Selection of Yeast Strains for Kefir Fermentation from Milk
and Soymilk Mixture
GENG Yuan， WANG Jian-ming*， LI Li-ying， JIA Lei
（Key Laboratory of Food Nutrition and Safety，Ministry of Education，Tianjin University of Science & Technology，
Tianjin 300457，China）
Abstract： The yeast strains for traditional kefir fermentation were not suitable for milk and soybean milk. Some indi-
cators such as total acid， sugar in the fermented kefir were detected by intervals during the fermentation in order to
screen out the suitable yeast strain from S. cerevisiae Y1， S. cerevisiae Y2， S. ellipsoideus Y3 and S. fragrans Y4.
The result showed that S. cerevisiae Y1 grew well in mixed milk kefir， produced the high amount of total acid， had
the relatively strong ability of decomposition of sugar， and produced the suitable amount of ethanol. After 32h fer-
mentation， in the milk and soymilk kefir fermented by S. cerevisiae Y1， the viable count was 7.26log 10cells/mL；
pH was 5.52； total acid value was 0.57%； sugar value was 3.10g/L and ethanol content was 1547.60μg/g. And the
flavor profile of the fermented kefir was good. Therefore， S. cerevisiae Y1 was selected as the best yeast strain for
fermentation.
Key words： milk and soybean milk kefir； yeast； selection
doi：10.3969/j.issn.1674-506X.2012.02-007
传统开菲尔是以牛乳为主要原料， 经酵母和乳
酸菌发酵生产的具有酸性和起泡性的酒精性保健饮
料［1］。随着人们生活水平的提高，消费者在饮食方面
更加注重其功能性。豆乳富含蛋白质，不含胆固醇和
乳糖，仅含少量饱和脂肪酸，而且含有异黄酮等多种
生理活性物质，是牛乳的理想替代品 ［2-3］。以豆乳替
代部分牛乳制备与传统开菲尔相近的产品， 既可满
足我国人民的饮食习惯和现代人的饮食要求， 又能
降低成本。
在开菲尔发酵剂中， 酵母进行酒精发酵的同时
收稿日期：2011-12-31
基金项目：2011 天津科技支撑计划重点项目（11ZCKFNC01800）
作者简介：耿媛（1991-），女，硕士研究生，研究方向：食品与生物技术。
* 通讯作者：汪建明（1972-），女，博士，教授。
Food and Fermentation Technology
第 48卷（第 2期） Vol.48，No.2
2012 年第 2 期
产生促进细菌生长的生长素类物质， 它在促进微生
物之间的共生作用，CO2的形成，提高风味和香气方
面起着重要作用［4］。
当开菲尔原料乳成分发生改变时， 其发酵剂也
随之改变。本文以乳豆混合乳为原料，重点围绕“适
宜在混合乳中生长”、“产酸及产醇能力较强”、“发酵
混合乳产品品质良好” 等指标对实验酵母菌株进行
筛选， 最终确定出适宜乳豆混合开菲尔发酵的酵母
菌株，为进一步的工业化生产奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料与设备
S. cerevisiae Y1、S. cerevisiae Y2、S. ellip-
soideus Y3 及 S. fragrans Y4：天津科技大学微生物
实验室保藏菌种；乳豆混合乳（V/V=7∶3）［5］；蔗糖为
食品级，其它试剂均为分析纯。
SW-CJ-IBH 超净工作台、SPX-250B-Z 生化培
养箱、METTLER EL20数显 pH 计、GC9890A/F 气相
色谱仪等。
1.2 方法
1.2.1 酵母发酵剂的制备
斜面酵母→10mL 液体 YEPD 培养基，28℃静
置培养 20h→l00mL 液体 YEPD 培养基， 于 28℃、
100r/min 条件下恒温摇床培养， 制得发酵剂。4℃冷
藏备用。成熟酵母通过镜检，要求无污染，细胞健壮、
均匀整齐，细胞总数 0.7×108个/mL 以上，死亡率不
超过 1%，出芽率不低于 20%［6］。
1.2.2 酵母生长曲线的测定
据文献［7］：斜面酵母经 YEPD 活化后，按 2.0×106
个/mL 的酵母浓度接入液体 YEPD 中 ， 于 28℃，
100r/min 条件下， 在恒温摇床上培养， 定时取样计
数。以酵母细胞总数对数值为纵坐标，以培养时间为
横坐标，绘制酵母生长曲线。根据各酵母的对数生长
期，确定酵母接种时间。
1.2.3 酵母发酵混合乳特性研究
在混合乳中分别接种各酵母，于 25℃培养箱中
培养，每 4h 取样测定活菌数、pH、滴定酸度、残糖、
乙醇等指标。
对发酵成熟的混合乳开菲尔从质地、酸味、醇味
及气泡等方面进行感官特性评价。
1.2.4 分析测定
pH：METTLER pH 计测定；滴定酸度：以 0.1N
氢氧化钠标准溶液测定 ［8］；残糖：亚铁氰化钾滴定
法 ［9］；乙醇：气相色谱法测定［10］。
2 结果与讨论
2.1 酵母生长曲线的绘制
酵母的生长期包括延迟期、对数期、稳定期和衰
亡期。延迟期酵母处于准备繁殖的状态，不具备强的
繁殖能力；稳定期和衰亡期酵母繁殖能力已经减弱，
且对继续扩大培养和随后的酒精发酵不利。 而对数
期的酵母繁殖能力最强， 生命活动也处于最旺盛的
阶段，最有利于酵母的继续扩大培养。
本实验测定了各酵母在液体 YEPD 中的生长曲
线（图 1），可确定各酵母最佳的接种期。S. cerevisiae
Y1、S. cerevisiae Y2、S. ellipsoideus Y3与 S. fragrans
Y4 的初始菌数为 6.33-6.62 log10cells/mL。S. cere-
visiae Y1 的延迟期较长，在 0-8h 期间生长较缓，8h
后菌数显著增加 （P<0.05），32h时菌数最高（8.34log
10cells/mL），显著高于其它酵母（P<0.05）；S. cere-
visiae Y2 的菌数变化趋势与 S. cerevisiae Y1 较为
一致，6h 后菌数显著增加（P<0.05），18h 时菌数达到
最高 （8.15log 10cells/mL）；S. ellipsoideus Y3 无明
显的生长延迟期，在 0-26h 期间菌数几乎持续显著
增长 （P<0.05）；S. fragrans Y4 表现出良好的适应
性，2h后即进入对数生长期，24h后生长趋于平稳。
活菌镜检表明 4种酵母在稳定期之前的生长均
良好，延迟期需要一段时间的自身调整，诱导合成必
需的酶、辅酶或某些中间代谢产物，菌体个体逐渐长
大，即将进入对数期时出芽率明显提高。各菌对数末
期镜检时活菌数均在 99%以上， 菌体个体较大，出
芽率均高于 20%，在对数末期时菌数均达到 8.00log
10cells/mL 以上， 而常规要求酵母发酵剂在成熟时
的细胞总数应达到 7.85log 10cells/mL 以上［11］。
因此，S. cerevisiae Y1、S. cerevisiae Y2、S. el-
lipsoideus Y3 和 S.fragrans Y4 在 28℃下分别培养
菌
数
（
10
g1
0c
el
ls
/m
L）
8.50
8.00
7.50
7.00
6.50
6.00
0 4 8 12 16 20 24 28 32
时间/h
Y1
Y2
Y3
Y4
图1 酵母生长曲线
Fig.1 Growth curves of different yeast strains
24
第 48 卷（总第 168 期）
图4 酵母发酵混合乳过程中酸度变化
Fig.4 Changes of total acid during yeast fermentation
in mixed milk
TA
/%
0.60
0.50
0.40
0.30
0.20
0.10
Y1
Y2
Y3
Y4
0 4 8 12 16 20 24 28 32
时间/h
Y1
Y2
Y3
Y4
至约 20h、18h、26h、24h即可作为发酵剂使用。
2.2 酵母发酵混合乳特性研究
2.2.1 酵母发酵混合乳过程中活菌数变化
酵母菌数是含醇发酵乳制品中最重要的指标之
一，许多研究都认为 Kefir 质量欠佳、风味平淡的首
要原因即是酵母数过低。
图 2 显示了酵母发酵过程中活菌数的变化，
S. cerevisiae Y1、S. cerevisiae Y2 及 S. ellipsoideus
Y3均符合微生物生长的典型规律， 在 0-4h 期间无
明显变化，8h 后 S. cerevisiae Y1、S. cerevisiae Y2
及 S. ellipsoideus Y3 生长较快， 活菌数显著增加
（P>0.05），32h 时分别达 7.26log 10CFU/mL、7.15log
10CFU/mL、7.41log 10CFU/mL。而 S. fragrans Y4 不
能很好的适应混合乳基质， 至 20h后活菌数才迅速
增加，32h 时达 6.64log 10CFU/mL，显著低于其它三
株菌 （P<0.05）。IDF 曾规定含醇发酵乳制品中的酵
母数不得少于 5.0log 10cells/mL ［12］，以使 kefir 具备
良好的口感和风味， 但若酵母过量将导致产生大量
CO2、乙醇和酵母臭。本实验研究表明，发酵至 32h
时，酵母数均大于 5.0log 10cells/mL。
2.2.2 酵母发酵混合乳过程中 pH和滴定酸度变化
酸度是发酵乳的一个重要指标， 它与产品的口
味、质地和风味有着密切联系［13］。目前发酵乳发酵终
点的判断主要是由产品酸度决定。 本实验测定了酵
母发酵过程中的 pH 和酸度变化 （滴定酸度以乳酸
百分含量表示），如图 3、图 4。结合图 2可知，产酸主
要发生在对数生长期。
在发酵的前 8h，pH 变化不明显。8h 后 S. cere-
visiae Y1 与 S. cerevisiae Y2 发酵乳的 pH 下降较
快 ，发酵结束时 pH 降至最低值 （5.52 与 5.59）。
S. fragrans Y4 在发酵过程中产酸较慢，与其它三株
菌存在显著差异（P<0.05）。酸度在发酵过程中一直
呈上升趋势， 与 pH的变化相反， 发酵至 32h 时，S.
cerevisiae Y1 与 S. cerevisiae Y2 发酵乳的酸度较
高（分别达 0.57%和 0.49%），而 S. fragrans Y4 的酸
度最低，为 0.36%。综上所述，4 株酵母 S. cerevisiae
Y1与 S. cerevisiae Y2 的产酸能力比较好。
尹艳军等 ［6］研究表明，酿酒酵母在牛乳中生长
时，24h时 pH迅速下降至 4.64， 具有很强的产酸能
力，可能是由于补加大量蔗糖促进了发酵。
2.2.3 酵母发酵混合乳过程中残糖变化
黄翠姬等 ［14］指出可以通过三种方法测定发酵
力：（1）测定发酵度的变化；（2）测定释放 CO2 的重
量或体积；（3）测定已发酵糖的数量。本实验采用
第三种方法， 测定酵母发酵混合乳过程中残糖的
变化。
菌
数
（
10
g1
0c
fu
/m
L）
7.50
7.00
6.50
6.00
5.50
5.00
Y1
Y2
Y3
Y4
0 4 8 12 16 20 24 28 32
时间/h
图2 酵母发酵混合乳过程中活菌数变化
Fig.2 Changes of viable counts during yeast fermentation
in mixed milk
pH
7.00
6.50
6.00
5.50
0 4 8 12 16 20 24 28 32
时间/h
Y1
Y2
Y3
Y4
图3 酵母发酵混合乳过程中pH变化
Fig.3 Changes of pH during yeast
耿媛等：生产乳豆混合开菲尔的酵母菌株的筛选 25
2012 年第 2 期
如图 5 可知，4 种酵母发酵混合乳过程中总糖
含量均呈下降趋势 ，S. cerevisiae Y1、S. cerevisiae
Y2 及 S. ellipsoideus Y3 发酵乳的降糖速度较快，
12h 后总糖含量显著下降（P<0.05），32h 时 S. cere-
visiae Y2 发酵乳的总糖含量最低 （2.88g/L）， 而 S.
fragrans Y4 属于非酿酒酵母属，因此在整个发酵过
程中降糖都较缓 ，32h 时发酵乳总糖含量降为
3.81g/L， 与其它三株差异显著 （P<0.05）。 因此，S.
fragrans Y4的发酵力最低。
2.2.4 酵母发酵混合乳过程中乙醇变化
乙醇是 Kefir的特征性风味物质之一，主要由酵
母代谢产生［15］，在乙醇脱氢酶的作用下，将乙醛转化
为乙醇。 本实验测定了酵母发酵过程中的乙醇含量
变化，结果如图 6所示。
研究表明，混合乳中溶解氧在发酵前期较高，酵
母细胞进行有氧呼吸，产生 ATP 较多，细胞的结构
物质得以更新合成，细胞总数成倍增长，而乙醇主
要是酵母在无氧状态下，由乙醇脱氢酶还原乙醛生
成［16］。图 6为各酵母发酵混合乳过程中乙醇的变化，
在发酵前期（4h），乙醇含量增长都较缓慢，8h 后 S.
cerevisiae Y1、S. cerevisiae Y2 与 S. ellipsoideus Y3
乙醇产量显著增加（P<0.05），发酵结束时达最高值，
S. fragrans Y4 产醇能力较低，在 20h 以内乙醇产量
较低，增加速度缓慢，发酵 32h后缓增至 345.93μg/g，
显著低于其它三株菌（P<0.05）。
在本实验中，S. cerevisiae Y1 发酵乳各种香气
较为协调， 质地也较细腻， 气泡丰富；S. cerevisiae
Y2 醇香过浓，稍有酵母臭，泡沫过多，质地细腻；S.
ellipsoideus Y3 醇香较浓，乳香淡且凝乳颗粒较粗、
不细腻； 而 S. fragrans Y4 酯香味明显， 但醇香较
淡，几乎没有气泡。
3 结论
在四株酵母中 ，S. cerevisiae Y1、S. cerevisiae
Y2 及 S. ellipsoideus Y3 在生长适应性及发酵性能
方面差异较小， 而 S. fragrans Y4 表现出差异显著
性， 对乳豆混合乳发酵力最低。 其中 S. cerevisiae
Y1 生长较好、产酸较强、利用糖能力中等、产醇适
宜。 发酵 32h 时，S. cerevisiae Y1 发酵的开菲尔中
活菌数为 7.26log 10CFU/mL，pH为 5.52， 酸度值为
0.57%，残糖为 3.10g/L，乙醇含量为 1547.60μg/g。S.
cerevisiae Y1 发酵乳各种香气较为协调， 质地也较
细腻，气泡丰富，感官品质较优。因此确定 S. cere-
visiae Y1作为乳豆混合开菲尔最佳发酵菌株。
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总
糖
/g
/L
4.30
3.90
3.50
3.10
2.70
0 4 8 12 16 20 24 28 32
时间/h
Y1
Y2
Y3
Y4
图5 酵母发酵混合乳过程中残糖变化
Fig.5 Changes of sugar content during yeast fermentation
in mixed milk
乙
醇
/μ
g/
g
2000
1500
1000
500
0
0 4 8 12 16 20 24 28 32
时间/h
Y1
Y2
Y3
Y4
图6 酵母发酵混合乳过程中乙醇变化
Fig.6 Changes of ethanol content during yeast fermentation
in mixed milk
（下转第 31页）
26
第 48 卷（总第 168 期）
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（上接第 26页）
传代次数 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
黑色素产
量/g/L
5.92 5.92 5.92 5.92 5.92 5.92 5.92 5.92 5.92 5.92
生物量
/g/L
12.24 12.24 12.24 12.23 12.21 12.23 12.21 12.24 12.24 12.24
表 2 遗传稳定性
Tab.2 Genetic stability
gl
uc
os
e/
g/
L
50
40
30
20
10
0
0 20 40 60 80 100
time/h
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
m
el
an
in
pr
od
uc
tio
n/
g/
L
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
bi
om
as
s/
g/
L
biomass
glucose
melanin production
图6 发酵罐培养
Fig.6 Melanin production in fermenter
2.8 30L发酵罐中黑色素高产菌株的发酵
用 30L 发酵罐对选出的黑色素高产菌株 61 号
菌进行发酵培养。25℃，DO 20%，通风比 1∶1.2（vvm），
初始转速 400r/min，发酵时间 96h［8］。发酵过程曲线
如图 6 所示。随着菌体的生长，黑色素从 24h 产生，
随后进入一个快速生产期，几乎成直线增加。随着葡
萄糖的不断被消耗，黑色素合成速度降低，直到 96h
达到最高 7.67g/L，较摇瓶提高了 31.08%。
3 结论
通过 He-Ne 激光和紫外线复合诱变结合抗性
筛选方法，有效的提高了出芽短梗霉的正向突变，筛
选出一株高产黑色素产生菌突变株 M0324，产量为
5.92g/L。为出发菌出芽短梗霉（产量 1.276g/L）的产
量的 4.6倍。该突变菌株遗传性稳定。
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