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收稿日期：2010-04-10
基金项目：国家自然科学基金(20862020)；海南省普通高等学校研究生创新科研课题(HXWBY2009-01)
作者简介：曾艳波，男，生于1977年，在读博士研究生，助理研究员，E-mail: zengyanbo@163.com。
*通迅作者：E-mail: meiwenli@yahoo.com.cn。
文章编号：1001-8689(2011)04-0276-04
瓶花木内生真菌C22发酵液中生物活性成分的分离、纯化与鉴定
曾艳波1, 2 戴好富2 黄玖利2 梅文莉2, *
(1 海南大学园艺园林学院，海口 570228；2 中国热带农业科学院热带生物技术研究所，
农业部热带作物生物技术重点开放实验室，海口 571101)
摘要：目的 分离、鉴定红树林植物瓶花木内生真菌C22的活性次生代谢产物。方法 利用硅胶柱层析等方法进行分离纯
化；利用光谱分析进行结构解析。结果 内生真菌C22的活性次生代谢产物为一大环内酯类抗生素布雷菲尔德菌素A 和一倍半
萜类抗生素木霉菌醇。结论 以上两种抗生素对肺癌细胞SMMC-7721、胃癌细胞SGC-7901具有较强的肿瘤细胞毒活性，并且
在内生真菌C22中含量较大，因此，红树林植物瓶花木内生真菌菌株C22具有广阔的应用价值和开发前景。
关键词：瓶花木；内生真菌；布雷菲尔德菌素A；木霉菌醇
中图分类号：R978 文献标识码：A
Separation, purifi cation and structural elucidation of the bio-active components from
fermentation broth of endophytic fungus C22 from Scyphiphora hydrophyllacea
Zeng Yan-bo1, 2, Dai Hao-fu2, Huang Jiu-li2 and Mei Wen-li2
(1 College of Horticulture and Landscaping, Hainan University, Haikou 570228;
2 Key Laboratory of Tropical Crop Biotechnology, Ministry of Agriculture, Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology, Chinese
Academy of Tropical Agricultural Sciences, Haikou 571101)
Abstract Objective To elucidate the structures of the bio-active component isolated from the fermentation
broth of endophytic fungus strain C22 from mangrove plant Scyphiphora hydrophyllacea Gaertn. F. Methods Silica
gel column chromatography was used to separate the bio-active components. Their structures were elucidated by
spectroscopic analyses. Results The active components were purifi ed and their structures were elucidated as two
antibiotics: brefeldin A and trichodermol. Conclusions Endophytic fungus strain C22 with a large content of these
two antibiotics, which showed inhibitory activities towards human hepatoma cell line SMMC-7721 and human gastric
cancer cell line SGC-7901, has broad prospects for commercial application.
Key words Scyphiphora hydrophyllacea Gaertn. F.; Endophytic fungus; Brefeldin A; Trichodermol
布雷菲尔德菌素A(Brefeldin A，1)是一种天然存
在的大环内酯类抗生素。它能抑制蛋白质由内质网
向高尔基体复合物的转运，具有抗细菌、抗真菌、
抗病毒和抗肿瘤等活性[1-2]。木霉菌醇(Trichodermol，
2)是一种倍半萜类抗生素。它能抑制真核生物细胞
内核糖体中肽键的形成，属于一种蛋白质合成抑制
剂，具有抗真菌、抗肿瘤等活性[3-5]。另外，在神经
细胞中它能通过影响乳糖酶基神经鞘氨醇合成酶的
中国抗生素杂志2011年4月第36卷第4期
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活性来抑制葡萄糖苷酰鞘氨醇的积累[6]。
本实验室从海南省文昌市红树林保护站采取红
树林植物瓶花木，对其内生真菌进行了分离，从中
分离到内生真菌77株。其中，从瓶花木根中分离出
内生真菌25株，茎中分离出内生真菌42株，叶中分
离出内生真菌10株。在对所分离到的内生真菌菌株
进行活性筛选的过程中发现分离自瓶花木茎中的内
生真菌菌株C22的发酵液对肺癌细胞SMMC-7721、
胃癌细胞SGC-7901显示出较强的细胞毒活性。进而
对内生真菌C22进行了次生代谢产物的研究，从其发
酵液中分离鉴定两种抗生素，分别为布雷菲尔德菌
素A和木霉菌醇(图1)。细胞毒活性测试显示，布雷
菲尔德菌素A对肿瘤细胞SMMC-7721、SGC-7901的
IC50分别为0.4μg/mL、0.3μg/mL，木霉菌醇对肿瘤细
胞SMMC-7721、SGC-7901的IC50分别为8.0μg/mL、
2.0μg/mL。
O
HO
H
OH
H
CH3
O OH3C
H
OH
O
H
CH3 CH3
1
2345
6
7
8
9
10
11
12 13 14
15
16
2 3
45
6
7
8
9 10
11
12
13
1415
16
1 2
图1 布雷菲尔德菌素A(1)和木霉菌醇(2)的结构图
Fig. 1 Structures of brefeldin A(1) and trichodermol(2)
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 植物材料
红树林植物瓶花木于2008年12月5日采于海南
省文昌市红树林保护站。由中国热带农业科学院热
带生物技术研究所代正福副研究员鉴定为瓶花木
(Scyphiphora hydrophyllacea Gaertn. F.)，凭证标本
(No. SH20081205) 保存在中国热带农业科学院热带
生物技术研究所。
1.1.2 菌种
丝状真菌C22(分离自瓶花木茎中，不产孢子，
未鉴定)，中国热带农业科学院热带生物技术研究所
梅文莉研究组筛选、保藏菌种。
1.1.3 主要药品与试剂
葡萄糖(分析纯)，广州化学试剂厂；琼脂，广东
环凯微生物科技有限公司；分离过程用的溶剂均为
工业纯重蒸。
1.1.4 培养基
PDA固体培养基：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼
脂20g，定容至1L，pH自然。PDB液体培养基：马铃
薯200g，葡萄糖20g，定容至1L，pH自然，121℃灭
菌20min。
1.2 主要仪器及设备
旋转蒸发仪为Heidolph Laborota-20L，核磁共振
波谱仪为Bruker AV-400 (TMS内标)，BSA-100A自动
部份收集器(上海青浦沪西仪器厂)，CO2培养箱(英国
RSBIOTECH Galaxy R)，CA-1111冷却水循环装置(上
海爱朗仪器有限公司)，高压湿热灭菌锅(Sanyo)。
1.3 菌种的发酵与产物的分离
1.3.1 发酵
内生真菌C22经PDA培养基斜面活化，切成黄豆
粒大小的菌丝块，接种于装有300mL PDB培养基(容
量为1L)的三角瓶中(共4瓶)，室温，静置培养45d。
1.3.2 发酵产物的分离
将菌株C22的培养物从三角瓶中取出，用滤纸
过滤得到发酵液(1.2L)。发酵液于50℃减压浓缩至
0.4L，用乙酸乙酯萃取，减压浓缩得到乙酸乙酯浸
膏(386.8mg)，将乙酸乙酯浸膏经硅胶柱色谱，以石
油醚-丙酮 (体积比6: 4) 洗脱得到化合物1(125.2mg)和
化合物2(34.8mg)。
1.4 体外细胞毒活性筛选
以肿瘤细胞株SMMC-7721、SGC-7901细胞为指
示瘤株，采用MTT法[7]测定化合物的体外细胞毒活
性。分别设DMSO溶剂阴性对照组、阳性对照组(丝
裂霉素C，mitomycin C)和待测样品组，每个待测样
品设5个浓度梯度。选取对数生长期的肿瘤细胞，用
RPMI-1640完全培养液培养制成单细胞悬浮液，血
球计数板计数；按50000个/毫升接种90μL于96孔平
底细胞培养板中，K562细胞中直接加入10μL样品，
SMMC-7721和SGC-7901细胞经培养(培养条件：体积
分数5%的CO2，湿度90%以上，温度为37℃)24h后，
再加入10μL样品，加入样品后继续培养72h，置于
显微镜下观察每孔细胞形态。然后加入15μL 的MTT
溶液(5mg/mL)，37℃反应4h，吸弃上清，向各孔中
加入100μL DMSO，充分溶解，用ELX-800酶标仪测
量各孔的A值(测量波长为490nm)，按公式：抑制率=
(A对照组-A实验组)/A实验组×100%求得各化合物的抑制率，
再以样品浓度为横坐标，以抑制率为纵坐标作图，求
出抑制率为50%时样品的浓度(IC50)。
2 结果与分析
2.1 结构鉴定
化合物1 无色晶体(丙酮)，ESI-MS m/z: 279。
结合1H-NMR和13C-NMR(DEPT)谱数据推断其分子
瓶花木内生真菌C22发酵液中生物活性成分的分离、纯化与鉴定 曾艳波等
. 278 .
式为C16H24O4，有5个不饱和度。13C-NMR和DEPT谱
显示该化合物含有1个羰基碳(δ 168.4)，4个双键碳
(δ 117.8，δ 155.1，δ 138.1，δ 131.4)，1个甲基碳(δ
21.1)，5个亚甲基碳(δ 41.9，δ 44.1，δ 33.0，δ 28.0，
δ 35.0)，5个次甲基碳(δ 76.7，δ 53.2，δ 73.0，δ
45.5，δ 73.3)。1H-NMR谱显示2对反式双键氢信号δ
5.83 (1H，dd，J=15.6Hz，2.0Hz)，δ 7.46 (1H，dd，
J=15.6Hz，3.0Hz)和δ 5.32 (1H，dd，J=15.1Hz，
9.6Hz)，δ 5 .80 (1H，ddd，J=15.1Hz，10.1，
4.7Hz)。另外，还有1个与次甲基相连的甲基氢信号
δ 5.83 (3H，d，J=6.2Hz)。进而对整个1H-NMR谱和
13C-NMR谱数据进行了全归属(表1)。以上数据与文
献[8]报道的数据一致，故化合物1鉴定为布雷菲尔德
菌素A。
化合物2 无色晶体(丙酮)，ESI-MS (negative)
m/z: 249。结合1H-NMR和13C-NMR(DEPT)谱数据推
断其分子式为C15H22O3，有5个不饱和度。13C-NMR
和DEPT谱显示该化合物含有2个双键碳(δ 119.9，δ
141.3)，3个甲基碳(δ 6.5，δ 16.2，δ 23.4)，4个亚甲
基碳(δ 25.5，δ 29.0，δ 39.9，δ 48.0)，3个次甲基碳
(δ 71.9，δ 73.9，δ 80.7)，3个季碳(δ 41.2，δ 50.1，δ
66.7)。1H-NMR谱显示1个双键氢信号δ 5.33 (1H，br.
d，J=4.7Hz)， 3个甲基氢信号δ 0.79 (3H，s)，δ 0.84
(3H，s)，δ 1.67 (3H，s)。进而对整个1H-NMR谱和
13C-NMR谱数据进行了全归属分析(表1)。以上数据
与文献[5]报道的数据一致，故可鉴定化合物2为木霉
菌醇。
2.2 细胞毒活性测定
采用M T T法 [ 7 ]测试化合物 1、 2对肺癌细胞
SMMC-7721、胃癌细胞SGC-7901的抑制活性。结
果显示化合物1和2对以上两株肿瘤细胞均表现出
较强的细胞毒活性。化合物1对肿瘤细胞SMMC-
7721、SGC-7901的IC50分别为0.4和0.3μg/mL，化合
物2对肿瘤细胞SMMC-7721、SGC-7901的IC50分别
为8.0和2.0μg/mL。
3 讨论
从菌株C22发酵液的薄层层析情况可以看出，菌
株C22发酵液中的主要成分为这两个化合物，并且含
表1 化合物1和2的13C-NMR(100 MHz, CD3OD)和1H-NMR(400 MHz, CD3OD)数据
Tab. 1 13C-NMR(100MHz, CD3OD) and 1H-NMR(400MHz, CD3OD) data of Compounds 1 and 2
No.
1 2
δC δH δC δH
1 168.4 (s)
2 117.8 (d) 5.83 (1H, dd, J=15.6Hz, 2.0Hz) 80.7 (d) 3.64 (1H, d, J=5.2Hz)
3 155.1 (d) 7.46 (1H, dd, J=15.6Hz, 3.0Hz) 39.9 (t) 1.85 (1H, m)
2.45 (1H, q, J=7.7Hz)
4 76.7 (d) 4.04 (1H, dt, J=9.6Hz, 2.0Hz) 73.9 (d) 4.38 (1H, dd, J=7.7Hz, 3.5Hz)
5 53.2 (d) 1.93 (1H, m) 50.1 (s)
6 41.9 (t) 1.78 (1H, overlapped)
2.03 (1H, overlapped)
41.2 (s)
7 73.0 (d) 4.22 (1H, m) 25.5 (t) 1.43 (1H, m); 1.89 (1H, m)
8 44.1 (t) 2.13 (1H, ddd, J=13.1Hz, 8.8Hz, 5.4Hz)
1.45 (1H, dddd, J=13.3Hz, 7.9Hz, 5.5Hz, 1.2Hz)
29.0 (t) 1.97 (2H, m)
9 45.5 (d) 2.39 (1H, m) 141.3 (s)
10 138.1 (d) 5.32 (1H, dd, J=15.1Hz, 9.6Hz) 119.9 (d) 5.33 (1H, br d, J=4.7Hz)
11 131.4 (d) 5.80 (1H, ddd, J=15.1Hz, 10.1Hz, 4.7Hz) 71.9 (d) 3.56 (1H, d, J=5.6Hz)
12 33.0 (t) 1.82 (1H, overlapped)
2.00 (1H, overlapped)
66.7 (s)
13 28.0 (t) 0.91 (1H, overlapped)
1.56 (1H, overlapped)
48.0 (t) 2.77 (1H, dd, J=0.5Hz, 4.0Hz)
2.97 (1H, d, J=4.1Hz)
14 35.0 (t) 1.58 (1H, overlapped)
1.77 (1H, overlapped)
6.5 (q) 0.79 (3H, s)
15 73.3 (d) 4.79 (1H, m) 16.2 (q) 0.84 (3H, s)
16 21.1 (q) 1.24 (3H, d, J=6.3Hz) 23.4 (q) 1.67 (3H, s)
中国抗生素杂志2011年4月第36卷第4期
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量比较高。HPLC初步的分析结果表明布雷菲尔德菌
素A在发酵液中的含量达114.3mg/L，木霉菌醇在发
酵液中的含量达30.7mg/L。所以这两个化合物非常
容易从菌株C22发酵液中分离提纯出来。其中，布雷
菲尔德菌素A具有多种生物活性，是目前国际上抗肿
瘤药物研究的热点，具有很大的潜在的药用价值。
木霉菌醇同样具有多种生物活性，其4位上的羟基乙
酰化后为木霉素，后者是农业产业中常用的农药。
因此，红树林植物瓶花木内生真菌菌株C22具有广阔
的应用价值和开发前景。
参 考 文 献
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