全 文 ：乙酸对土壤胶体矿物吸附酸性磷酸酶的影响*
赵振华1 黄巧云2 蒋 新1* * 余贵芬1 王 芳1 李学垣2
( 1 中国科学院南京土壤研究所,南京 210008; 2华中农业大学资源与环境学院,武汉 430070)
摘要 研究了不同 pH 值、不同浓度乙酸对酸性磷酸酶在土壤胶体和矿物表面吸附的影响. 结果表明,
在 pH 2~ 8的乙酸体系中,酶在胶体矿物表面的最大吸附 pH 一般出现在蛋白的等电点和矿物的零电荷
点( PZC)之间.各土壤胶体和粘粒矿物对酶的吸附量大小顺序为针铁矿 黄棕壤> 砖红壤> 高岭石> 二
氧化锰. 乙酸浓度对酶在胶体矿物表面的吸附量和吸附结合能具有较显著影响, 在 0~ 200 mmol!L- 1范围
内,随着乙酸浓度的增加,酶吸附量呈现先升高、后降低、再稳定的趋势,而吸附结合能的变化与此相反 .并
就乙酸对酶在胶体矿物表面吸附影响的可能机理进行了初步探讨.
关键词 胶体矿物 吸附 乙酸 酸性磷酸酶
文章编号 1001- 9332( 2004) 03- 0482- 05 中图分类号 S154 2 文献标识码 A
Effect of acetic acid on adsorption of acid phosphatase by some soil colloids and clay minerals. ZHAO Zhen
hua1, HUANG Qiaoyun2, JIANG Xin1 , YU Guifen1, WANG Fang1, L I Xueyuan2 ( 1I nstitute of Soil Science,
Chinese A cademy of Sciences , Nanj ing 210008, China; 2 H uazhong Agr icultural University , Wuhan 430070,
China) . Chin. J . A ppl . Ecol. , 2004, 15( 3) : 482~ 486.
This paper studied the effect of acetic acid with different concentrations and pH values on the adsorption of acid
phosphatase by some soil co lloids and clay miner als ( SCCM) . T he r esults showed that the pH values for the max
imum adsorption o f the enzyme w ere betw een the IEP of the enzyme and the PZC of SCCM . In the acetic acid
systems, the amount of the enzyme adsorbed by SCCM was in the order of goet hite yellow brow n soil> latosol
> kaolinite> MnO2 . A r emarkable influence of acetic acid concentration on the adsorpt ion amount and the
binding energy of the enzyme was observed. With the incr ease of the concentration from 0 to 200 mmol!L- 1 in
the system, acetic acid exhibited an enhanced effect, followed by an inhibition action on the adsorption of the en
zyme on SCCM . T he changes of the binding ener gy ( K value) for the enzyme on SCCM w ere on the contrary to
those of the max imum adsorption. The possible mechanisms for the influence of acet ic acid on the adsorption of
enzyme by SCCM were also discussed.
Key words Colloid miner als, Adsorpt ion, Acetic acid, Acid phosphatase.
* 国家重点基础研究发展规划项目( 2002CB410805)、国家自然科学
基金项目( 40271064)和中国科学院王宽诚博士后工作奖励基金资助
项目.
* * 通讯联系人.
2002- 11- 12收稿, 2003- 03- 31接受.
1 引 言
土壤酶是推动土壤新陈代谢的重要有机物质,
其中磷酸酶在土壤磷的转化、循环中起着重要作用.
酶在土壤中的存在状态如游离,被土壤胶体、矿物固
定等直接影响到其活性[ 12] .酶在土壤固相表面的吸
附固定既决定于酶本身的性质[ 10, 13]和胶体表面特
性[ 8] ,还受到一系列环境条件及体系中共存的各种
无机、有机离子的影响.土壤体系中特别是根际土壤
中,各种低分子量有机酸数量丰富,种类较多[ 4, 14] ,
其存在对蛋白质、酶分子的存在状况及其与胶体的
相互作用势必产生影响. 该研究对于深入探讨土壤
成分相互作用机理,阐明影响土壤酶活性的有关因
素,提高土壤肥力水平和环境质量等具有重要的理
论和实际意义. 到目前为止,有关这方面的报道还很
少见. 本文以可变电荷土壤中常见的几种矿物和两
种土壤胶体为对象,研究根系分泌物中常见的乙酸
对酸性磷酸酶在矿物、胶体表面吸附的影响.
2 材料与方法
2 1 酸性磷酸酶
( EC3 132, T ype II , 0 8 units!mg- 1 , from potato,分子
量约 100 kDa[ 11] )购于美国 Sigma 公司.
2 2 土壤胶体和粘粒矿物制备
黄棕壤采自湖北孝感 Q 3 母质发育的水稻土 ( 0 ~ 20
cm) ; 砖红壤采于海南东山峙花岗岩母质发育的荒地( 17 ~
35 cm) ;高岭土为化学试剂 (上海三浦化工有限公司) . 以上
土壤和矿物制成悬浊液后以 01 mol!L - 1的 NaOH 调 pH 至
中性, 超声波分散,沉降法分离小于 2m 的粘粒,用 05 mol
!L - 1的 CaCl2絮凝, 去离子水和酒精洗至无 Cl- , 45 ∀ 烘干,
研磨, 过 100目筛备用. 针铁矿和 MnO 2, 分别按 Atkinson
应 用 生 态 学 报 2004 年 3 月 第 15 卷 第 3 期
CHINESE JOURNAL OF APPLIED ECOLOGY, Mar. 2004, 15( 3)#482~ 486
等[ 1]和 Naidja 等[ 8]的方法合成, 电渗析除去游离的离子, 过
滤, 45 ∀ 烘干,研磨后过 100 目筛备用. 制备的土壤胶体和
矿物的主要性状列于表 1.
表 1 土壤胶体和粘土矿物某些基本性质*
Table 1 Some properties of the soil colloid and clay minerals studied
粘粒矿物
Clay
m inerals
有机质
Organic
ma tter
( g!kg- 1)
比表面
Special
surface
( m2!g - 1)
电荷
零点
PZC
矿物组成
M ineral composit ion
( % )
高岭土 Kaolinite 20 361 高岭石 Kaolinite
针铁矿 Goethite 83 827 针铁矿 Goethite
MnO2 277 2 5 MnO2 manganese diox ide
黄棕壤
Yellow brown
soil
109 245 2 9 伊利石 Illit e( 63) , 14 nm 矿物
14 nm minerals ( 19) , 高岭石
K ao linit e( 14) ,游离氧化铁 Free
iron oxide( 4)
砖红壤
L atosol
586 84 385 高岭石 Kaolinite( 86) ,伊利石 Il
lite和三水铝石 Gibbsit e(微量) ,
游离氧化铁 Free iron oxide( 9)
* 括号中数字为各矿物成分所占的百分含量 T he number in brachet is percent
age of m inerals.
23 土壤胶体和粘土矿物悬浊液制备
称取 2 5 g 土壤胶体于锥形瓶中, 加适量去离子水, 以
01 mol!L - 1盐酸或氢氧化钠每隔 2 h 调悬浊液的 pH, 直至
稳定在 5 5(约需一周) , 定容至 250 ml [ 7] .
24 酶含量测定( F olin 酚试剂法) [ 6]
吸取 0 2 ml含 0~ 600 g!ml- 1的酶溶液于玻璃试管
中,加入 1 ml的福林试剂甲, 摇匀,室温下放置 10 min, 加入
01 ml的福林试剂乙, 立即混匀, 于 40 ∀ 水浴中恒温 30
min, 以不含酶的试剂空白作对照, 在 VIS 7220 型分光光度
计上比色测定,测定波长为 650 nm.
25 土壤胶体矿物对酸性磷酸酶的吸附测定
在磁力搅拌下吸取土壤悬浊液 1 ml于 10 ml的离心管
中,加入浓度为 0~ 2 000g!ml- 1、pH 5 5 的酶溶液1 ml,然
后加入 1 ml pH 5 5 的乙酸钠溶液 ( 0~ 200 mmol! L- 1 , 以
015 mol!L- 1 NaCl作支持电解质) . 25 ∀ 下振荡 3 h, 静置 1
h, 于贝克曼离心机上以 12 000 r!min- 1离心, 用 Folin 酚试
剂法测定上清液中酶的含量.各体系中加入酶的总量扣除上
清液中的酶量,即为土壤胶体和粘粒矿物对酶的吸附量.
26 不同 pH 值下土壤胶体和粘粒矿物对磷酸酶吸附测定
设置pH 2 0~ 80 的系列乙酸钠溶液( 100 mmol!L - 1) ,
测定不同 pH 乙酸体系中黄棕壤、砖红壤、高岭石、 MnO 2
(水#土= 100)和针铁矿(水#矿物= 125)对磷酸酶( 1 500 g!
ml
- 1
)的吸附.测定步骤如 24 和 25 所述.
以上实验均设置 3 次重复,文中数据均为 3 次重复的平
均值.
3 结果与分析
31 乙酸体系中土壤胶体和矿物对酸性磷酸酶的
等温吸附曲线
由图 1可见, 根据 Giles[ 3]的等温吸附曲线分
类,供试的土壤胶体和矿物对酸性磷酸酶的等温吸
附曲线均属于 L 型, 即随着体系中酶浓度的增加,
土壤胶体、矿物对酶的吸附量缓慢上升,最后达到平
衡.乙酸浓度的变化对酶的吸附等温线形状无显著
影响.
图 1 乙酸体系中土壤胶体矿物对磷酸酶的吸附等温线
Fig. 1 Adsorpt ion isotherms of phosphatase by some soil colloid and clay
minerals.
a:针铁矿 Goethite; b:黄棕壤Yellow brown soil, c:高岭石Kaolinite; d:
砖红壤Latosol; e MnO2.下同 The same below .乙酸浓度 Concentra
tion of acet ic acid: 1) 0 mmol!L- 1; 2) 10 mmol! L- 1; 3) 50 mmol!L- 1;
4) 200 mmol!L- 1.
在供试的乙酸浓度范围,土壤胶体和矿物对酸
性磷酸酶的等温吸附曲线均符合 Langmuir 方程
( R 2> 095,表 2) : X = B maxKC / (1+ KC ) . 其中, X
表示单位吸附载体对溶质的吸附量, B max是溶质的
最大吸附量, K 是与吸附结合能有关的常数, C 是
溶液中溶质的平衡浓度.在所有体系中,随着乙酸浓
度的升高, K 值均经历先下降(乙酸浓度小于 10
mmol!L- 1 ) 后升高(乙酸浓度为 10 ~ 200 mmol!
L
- 1
)的过程, 而最大吸附量 Bmax的变化则相反. 例
如高岭石对酸性磷酸酶的吸附, 当乙酸的浓度分别
为 0、10、50和 200 mmol!L- 1时, 对应的 K 值分别
表 2 土壤胶体、矿物等温吸附磷酸酶拟合 Langmuir 方程相关参数
Table 2 Langmuir parameters for adsorption of phosphatase on some
soil col loid and clay minerals
土壤胶体和矿物
Soil and minerals
collo id
参 数
Parameter
乙酸浓度( mmol!L- 1)
Concentration of acetic acid
0 10 50 200
针铁矿 Bmax 230 284 363 322
Goethite K 925 865 161 2 2129
R2 0995 0998 0 998 0998
黄棕壤 Bmax 134 173 155 132
Yellow brown soil K 243 232 237 306
R2 0982 0956 0 951 0974
高岭石 Bmax 822 959 863 788
Kaolinite K 148 985 134 391
R2 0988 0954 0 931 0908
砖红壤 Bmax 965 111 976 838
Lat osol K 356 111 176 605
R2 0990 0961 0 971 0957
4833 期 赵振华等:乙酸对土壤胶体矿物吸附酸性磷酸酶的影响
为 15、10、13和 39,相应的 Bmax值则为 82、95、86和
79.说明体系中乙酸浓度的变化会明显影响蛋白分
子在粘土矿物表面的吸附量和吸附结合能.
32 乙酸浓度对土壤胶体、矿物吸附酸性磷酸酶的
影响
由图 2可见,当加入的酶浓度为 1 000 g!ml- 1
时,乙酸浓度的变化对针铁矿吸附酶的影响比较小.
这与针铁矿对酶的吸附量较高有关.但对其它粘粒
矿物和土壤胶体而言, 当乙酸浓度从 0 增至 10
mmol!L - 1时, 磷酸酶的吸附量呈逐渐上升的趋势,
乙酸浓度增加到 10~ 50 mmol!L - 1时, 吸附量逐渐
下降但仍高于对照. 在 50~ 200 mmol!L- 1乙酸体系
中,酶的吸附量逐渐稳定在与对照相当或略低的水
平.乙酸浓度变化对酶吸附影响的趋势因土壤胶体、
矿物的不同而有所差异, 在砖红壤、高岭石和黄棕壤
体系中,这种趋势比较明显.
图 2 乙酸系列浓度对酸性磷酸酶吸附的影响
Fig. 2 Ef fect of acetic acid concent rat ion on the adsorpt ion of acid phos
phatase.
图 2的结果还表明, 在 0~ 200 mmol!L- 1的乙
酸浓度范围,供试土壤胶体和矿物对酸性磷酸酶的
吸附量大小顺序为针铁矿 黄棕壤> 砖红壤> 高岭
石> 二氧化锰( P < 001) . 可见针铁矿对酶的吸附
量均远远大于其它胶体矿物. 由表 1可知,供试的黄
棕壤胶体主要由伊利石、14 nm 矿物和高岭石组
成;而砖红壤胶体成分以高岭石为主.结合吸附试验
的结果可见,这些土壤胶体中,虽然铁氧化物的含量
较低,但其对酶的吸附贡献却不容忽视.值得注意的
是,供试的二氧化锰虽同属氧化物且具有较高的比
表面,但其酶吸附量却很低,这可能与其组成中含有
一定比例的非晶形物质有关. 非晶形物质虽然比表
面比较大,但其表面主要由微孔组成,可能并不是吸
附酶的有效表面. Huang 等[ 5]的结果也证实,非晶形
铁、铝氧化物对脲酶和蔗糖酶的吸附低于相应的晶
形氧化物.
33 体系 pH 值对土壤胶体、矿物吸附酸性磷酸酶
的影响
由图 3可见,酸性磷酸酶在供试的土壤胶体和
矿物上的吸附百分率是 pH 依变的. 当加入酶浓度
为 1 500 g!ml- 1时,针铁矿、黄棕壤、高岭石、砖红
壤和二氧化锰对酶的吸附分别在 pH 68( 86%)、
334( 92% )、39( 84% )、388( 71% )和 50( 66%)
时达到最大.
图 3 不同 pH 下土壤胶体矿物对酶的吸附曲线
Fig. 3 Adsorpt ion curves of phosphatase by some soil colloid and clay
minerals under dif ferent pH.
由表 1可知, 除针铁矿的 PZC为 827外,其它
矿物和土壤胶体的 PZC 均处于 25~ 40 之间, 而
酸性磷酸酶的等电点为 50[ 4] , 结合图 3 的结果可
以发现, 供试各胶体矿物对酶的最大吸附 pH 均处
于胶体矿物的 PZC和酶的等电点之间.可见最大吸
附 pH 出现的位置既与酶的等电点有关, 也与吸附
载体的种类有关. 对于两种土壤胶体、高岭石和氧化
锰矿物而言, 在不同 pH 的乙酸体系中,酶与粘粒矿
物的相互作用可用图 4来描述: ∃区位于胶体矿物
的 PZC和酶的等电点之间, 酶与粘粒矿物带异号电
荷,且由于靠近蛋白质的等电点,吸附在粘粒矿物表
面的酶分子间的静电排斥力也较小. 这样,在静电吸
引力和非静电力的共同作用下酶达到最大吸附; 在
%( pH= 胶体矿物的 PZC)和&( pH= 酶的等电点)
处,酶和粘粒矿物间的静电作用较小,虽有非静电力
的作用, 但其酶吸附量仍低于 ∃区; ∋区( pH< 粘粒
矿物的 PZC)与(区( pH> 酶分子的等电点)中酶和
胶体矿物带同号电荷, 且吸附在粘粒矿物表面的酶
分子间的静电排斥力也较大,酶主要依靠非静电力
如疏水力、氢键等吸附在胶体矿物表面,因此这两个
区的酶吸附量比较低. 针铁矿同样也符合以上的作
用机理.但由于它的高 PZC,在本试验条件下均带正
电荷,因此其最大吸附 pH 出现在 60以上.
乙酸浓度的变化对 pH 吸附率曲线的形状并没
有显著影响,但使吸附曲线产生一定的位移.以黄棕
壤对磷酸酶吸附( 1 000 g!ml- 1)为例(图 5) ,当乙
酸的浓度为 100、20 和 5 mmol!L - 1时, 对应的最大
吸附量 pH 分别为 35、36和 42,可见乙酸浓度的
484 应 用 生 态 学 报 15卷
降低使磷酸酶吸附曲线整体向高 pH 值移动约一个
单位.在 pH 40~ 65之间,乙酸浓度变化对蛋白吸
附量的影响与等温吸附和乙酸系列浓度的结果相一
致.
图 5 乙酸浓度对磷酸酶在黄棕壤上 pH 吸附曲线影响
Fig. 5 Ef fect of acetic acid concentration on the pH adsorpt ion prof iles of
phosphatase on a yellow brow n soil colloid.
1) 100 mmol!L- 1; 2) 20 mmol!L- 1; 3) 5 mmol!L- 1.
4 讨 论
在不同浓度乙酸体系中, 土壤胶体、矿物对酸性
磷酸酶吸附等温线及吸附量的结果表明, 针铁矿对
磷酸酶的吸附受乙酸浓度变化的影响较小, 其它矿
物及两种土壤胶体基本上符合以下趋势: 低浓度乙
酸促进酶的吸附,中等浓度乙酸使酶的吸附出现轻
微抑制但仍高于对照, 高浓度乙酸则使酶的吸附稳
定在与对照相当或略低的水平. 而吸附结合能的变
化则与上述趋势相反.
乙酸对供试胶体矿物吸附酶的影响规律主要原
因可能为: 1)乙酸和酶蛋白形成复合物使酶蛋白的
动电性质发生变化. St rter[ 15]用 X 射线衍射研究菜
豆紫色酸性磷酸酶的晶体结构时发现在离活性中心
Zn原子 09 nm 处有一个小的、极性的空穴可能被
SO2-4 或乙酸根占据, 说明乙酸能和酸性磷酸酶形成
复合物.在无缓冲液情况下,呼吸道肠道三型病毒的
最佳团聚pH 在 3~ 4之间, 但Floyd等[ 2]发现, 病毒
在 pH 5~ 6的乙酸缓冲液中比其它缓冲液(如磷酸)
更容易团聚. T aylor与 Bosmann[ 16]则用电泳的方法
确证了乙酸可使该病毒的等电点由 38 升高到
48,并能减少病毒表面的负电荷, 说明乙酸与病毒
的蛋白质外壳发生了相互作用. 因此, 在乙酸体系
中,磷酸酶分子与乙酸形成的复合物可能由于其等
电点等动电性质与游离酶的差异, 而对其在胶体矿
物表面的吸附行为产生影响. 当体系 pH 为 55时,
低浓度乙酸时蛋白的吸附量明显高于高浓度乙酸时
的蛋白吸附量(图 5) .
2)乙酸的桥接和竞争作用. 在乙酸、酶蛋白和胶
体矿物体系中,乙酸和蛋白可能占据不同的粘粒矿
物表面吸附点位. 酶蛋白在矿物表面的吸附可能存
在两种情况, 一种是酶蛋白直接和胶体矿物表面发
生作用,另一种是以酶蛋白 乙酸复合物的形式固定
在矿物的表面,即乙酸在酶蛋白分子与矿物之间起
着桥接作用. 当乙酸浓度较低( < 10 mmol!L- 1)时,
大部分乙酸可能与磷酸酶形成复合物, 溶液中与酶
蛋白 乙酸复合物竞争胶体矿物表面吸附点位的游
离乙酸比较少,酶蛋白分子除了占据它正常的吸附
点位之外,还可借助乙酸的桥接作用以酶蛋白 乙酸
复合物的形式被胶体矿物吸附, 此时乙酸表现为一
种促进酶蛋白分子吸附的作用. 当乙酸浓度进一步
增加时( 10~ 50 mmol!L - 1) , 乙酸除了和酶蛋白分
子形成复合物外, 溶液中还会有一定的游离乙酸与
酶蛋白 乙酸复合物竞争粘粒矿物表面的吸附点位,
这时乙酸开始在一定程度上对酶的吸附表现出抑制
作用.当乙酸浓度升高到 200 mmol!L- 1时, 大量游
离乙酸与酶蛋白或酶蛋白 乙酸复合物竞争粘粒矿
物的表面点位,结果导致酶的吸附量进一步降低.
5 结 论
51 乙酸使酶在土壤胶体和矿物表面的吸附量和
吸附结合能发生了显著变化,乙酸浓度由低到高,酶
蛋白的最大吸附量相应经历先增后减再稳定的过
程,而吸附结合能的变化与此相反.
52 在乙酸体系中,各粘粒矿物对酶的吸附量均符
合以下顺序:针铁矿黄棕壤> 砖红壤> 高岭石>
二氧化锰.酶在胶体矿物表面的最大吸附 pH 一般
出现在酶蛋白分子的等电点和矿物的 PZC之间.
4853 期 赵振华等:乙酸对土壤胶体矿物吸附酸性磷酸酶的影响
53 鉴于乙酸对供试土壤胶体、矿物吸附酶的影
响,在进行酶、蛋白质等有机物与土壤组分相互作用
以及有关的土壤酶学研究工作中,应注意乙酸本身
对试验结果的影响.
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作者简介 赵振华, 男, 1973 年生,博士后, 主要从事土壤环
境生物化学及污染控制研究, 发表论文 6 篇. T el: 025
86881193, E mail: zhzhao@ issas. ac. cn
486 应 用 生 态 学 报 15卷