全 文 ：最大或然数法在光合细菌计数中的应用及效果研究*
崔战利1* *
王萍萍2
王秋菊1
( 1 黑龙江八一农垦大学生命科技学院, 大庆 163319; 2沈阳农业大学基础部,沈阳 110161)
Application effect of most probable number( MPN) method in photosynthetic bacteria counting. CUI Zhanli1 ,
WANG P ingping2, WANG Qiuju1 ( 1College of Biology Science and Technology , H eilongj iang A ugus t Fir st L and
Reclamation Univer sity , Daqing 163319, China ; 2Depar tment of Basic Science, Shenyang Agr icultural Uni

versity , Shenyang 110161, China) .
Chin . J . A pp l . Ecol . , 2005, 16( 8) : 1577~ 1580.
The applicat ion of most probable number ( MPN ) method in counting the numbers of photosynthetic bacteria
( PSB) showed t hat this method was suitable for PSB counting under illumination and anaerobic condition, which
remedied the shortages of other methods. W ith this method, the sensitivity and accuracy o f the counting could be
enhanced w hen more replicated tubes and lower dilution times for fewer bacter ia samples were applied. When
PSB w ere not dominant in soil and w ater, MPN method could be used instead o f other methods. PSB agent could
only survive 6~ 9 days, and not be dominant in the env ironment in a long term. Its applicat ion time and oxygen
level affect the numbers of PSB significantly , w hich were the lar gest in a short application time and under anaero

bic condition.
Key words
Photosynthetic bacteria( PSB) , Most probable number( MPN ) , Bacter ia count ing , Application ef

fect.
文章编号
1001- 9332( 2005) 08- 1577- 04
中图分类号
Q939. 96
文献标识码
A
* 国家 十五 重大科技攻关项目( 2001BA804A43)、黑龙江省教育厅
项目( 10511190 ) 和黑龙江省教育厅骨干教师创新能力资助项目
( 10539048) .
* * 通讯联系人.
2004- 12- 23收稿, 2005- 04- 11接受.
1
引

言
光合细菌( photosynthet ic bacteria, PSB)是能进行不放氧
光合作用的一大类细菌的总称, 属水圈微生物,广泛分布于
地球生物圈,无论江、河、湖、海,水田、旱地都有存在[ 3] . 光合
细菌在水体自净、调节微生态平衡、促进动植物生长、增加产
量和提高产品质量、防病、固氮等方面具有重要作用[ 3, 22] . 近
年来,光合细菌菌剂在水产养殖、家畜养殖、污水处理及植物
生产上的应用日益广泛[ 3, 13, 19, 27, 28, 31] , 相继推出多种产品,
包括单菌菌剂、复合菌剂, 剂型上有液体菌剂、浓缩菌剂和固
体菌剂(粉剂)等[ 20] . 为保证产品质量和应用效果,有必要对
光合细菌菌剂和其在环境中的活菌数进行测定.目前生产上
主要采用比浊法对菌剂中光合细菌数量进行测定,但它仅能
测定光合细菌纯培养物的数量,对复合菌剂和处于自然环境
中的光合细菌无法计数, 其它计数方法也有类似不足. 本研
究以沼泽红假单胞菌为菌种,根据菌种特点采用最大或然数
法( MPN 法, 又称稀释培养计数法)对光合细菌进行计数, 对
几种计数方法进行比较,并应用 MPN 法对光合细菌在环境
中的分布及菌剂在环境中的动态变化规律进行研究, 以期为
光合细菌菌剂生产及应用提供必要的方法和依据.
2
材料与方法
21
菌种和培养基
光合细菌菌株 NDYC1 采自黑龙江八一农垦大学旧址
(黑龙江省密山市)鱼塘,经富集、分离纯化获得,初步鉴定为
沼泽红假单胞菌 ( Phodopseudomonas palustr is ) . 培养基为改
良的 71# 培养基[ 6, 25, 26] .
2 2
测定方法( MPN 法)
采用 10 倍稀释法或 2 倍稀释法[ 18]稀释菌液至适当稀
释倍数, 取适当稀释倍数的菌液各 1 ml加入装有 25 ml液体
培养基的试管中, 每个稀释度设 3~ 5 个重复. 盖上无菌胶
塞、混匀,置于 30~ 32 ! 、光强约 1 000 lx 培养箱培养 15~
20 d,至菌管出现红色、绿色或棕色[ 27 , 30] . 其它测定步骤参
考文献[ 10, 16] .
2 3
显微计数法
菌液适当稀释, 用血球计数板计数[ 10] .
2 4
平板菌落计数法
取不同稀释倍数 ( 10- 6、10- 7、10- 8、10- 9 )的菌液倾注
平板法接种[ 10]后将培养皿放入干燥器, 点燃干燥器中蜡烛,
盖上干燥器盖, 制成简易厌氧罐,培养 15~ 25 d,计数平板上
的红色单菌落[ 10] .
2 5
MPN 法测定自然环境中光合细菌数量
2 5 1 土壤中光合细菌数量测定
分别从 854 农场未灌水
稻田 3~ 8 cm 处土壤、原农大水稻灌水试验田水层下表土、
林甸和 854 农场大豆田 3~ 8 cm 处土壤取样,用 MPN 法测
定其光合细菌数量.
应 用 生 态 学 报
2005 年 8 月
第 16 卷
第 8 期






























CHINESE JOURNAL OF APPLIED ECOLOGY, Aug . 2005, 16( 8)∀1577~ 1580
252 污水处理实验
采用正交试验[ 8, 23, 31] , 应用光合细菌
处理黎明桥下污水,实验室条件下考察 MPN 法测定光合细
菌数量的影响因素.
3
结果与讨论
31
MPN 法计数光合细菌的可行性
从表 1 和 2可见 ,平板菌落计数法所测得的菌数比另两
种方法多将近 1倍, 且重复间和不同稀释度间差距较大, 重
复性差, 这是因为平板菌落计数法长时间光照和密闭培养,
培养基渗出的水分不能及时散发, 易造成光合细菌菌落扩
散,导致所测定的菌落数增加, 甚至菌落成片而无法计
数[ 20] . 同时, 有些光合细菌的菌落在平板上难以变红. 平板
菌落计数法的优点是较灵敏. 显微镜直接计数法与 MPN 法
所得结果相接近,重复间误差较小, 重复性好,但容易漏计及
重复计数,不能区分死菌、活菌和杂质, 灵敏度差, 只能测定
含菌较多的样品.
平板菌落计数法、显微镜直接计数法和本试验未涉及的
比浊法均可测定光合细菌菌剂中光合细菌的数量,但各有优
缺点.这 3 种测定方法在测定混合菌剂和光合细菌不占优势
环境中的光合细菌数量以及测定光合细菌菌剂在环境中的
数量变化时均无效.
表 1
平板菌落计数法和显微镜直接计数法测得光合细菌的数量
Table 1 Photosynthetic bacteria counts obtained with plate count and
direct microscopic count
平板菌落计数法 Plate count
10
- 6
10
- 7
10
- 8
10
- 9
显微镜直接计数法
Direct microscopic count
菌数Numbers
( 108 CFU#ml- 1) 508 ∃ 323 174∃ 060 148∃ 985 1670∃ 216 556∃ 534


MPN法适用于测定微生物群落中不占优势、但具有特
殊生理功能的微生物类群的数量. 广泛用于测定土壤、水体
等环境中氨化、硝化、反硝化、纤维素分解、固氮、硫化和反硫
化等特殊微生物生理类群和藻类的数量[ 1, 2, 5, 8, 14] , 以及牛奶
等食品中的特殊微生物类群(如大肠杆菌)的数量[ 6] ; 还可用
于检测环境中某些基因工程菌株的数量[ 18] . 光合细菌中的
红螺菌科细菌具有独特的生理功能,含有细菌叶绿素 a、b 和
多种类胡萝卜素,因色素种类和数量不同, 在厌氧、光照条件
下培养, 菌液会呈现粉、红、紫、绿、棕等不同颜色[ 3, 26] . 由于
培养液出现明显的颜色变化, 用 MPN 法既可测定菌剂含菌
量,也可测定混合菌剂中和光合细菌不占优势的环境中的光
合细菌数量及菌剂在环境中的数量变化.
MPN 法有 3、4、5管重复 3种测定法,从表 2 可以看出,
随着重复管数的增加, 测定结果的灵敏度和准确度提高, 误
差缩小.采用不同稀释方法, MPN 法测定结果的准确度和灵
敏度也不同,在含菌量较高情况下, 先采用 10 倍稀释法、到
含菌量较少的稀释液时采用 2 倍稀释法、最后采用 3 管
M PN 法测定光合细菌的数量,与相同重复管数的 10 倍稀释
法相比,可提高结果的准确度和灵敏度, 降低误差, 而与 5 管
M PN 法测定结果相近.除采用 2 倍、10 倍稀释法外,测定中
也可根据样品含菌量采用 3、4、5 和 100 倍等稀释法对样品
进行稀释后测定.
表 2
不同重复管数和不同稀释法的 MPN法测得的光合细菌数量
Table 2 Photosynthetic bacteria numbers obtained with MPN of differ

ent replication tubes and different dilution method
重复管数Replicated tubes
3
%
4
%
5
%
稀释倍数Dilution times
10
&
2
∋
菌数Numbers
( 109CFU#ml- 1) 12 0 ∃ 2 8 10 2 ∃ 1 2 77 ∃ 06 12 0 ∃ 2 8 7 1 ∃ 0 9
% 10 倍稀释法 Dilution of 10 times; & 三管重复MPN 法 MPN method of three
tubes replication; ∋ 在含菌量较高时,先采用 10倍稀释法, 到含菌量较少的稀
释液时继而采用2 倍稀释法稀释Dilution of 10 times was used when the content
of bacteria was higher and dilut ion o f 2 t imes was adopted to dilute when t he den

sity of bacteria became lower
3 2
MPN 法测定自然环境中的光合细菌数量
3 2 1 土壤
光合细菌在土壤中不占优势,但由于其的特殊
生理功能, 可用 MPN 法进行计数.从表 3 可以看出, 水田中
光合细菌要明显多于旱田.
表 3
采用 MPN 法测得的土壤光合细菌数量
Table 3 Photosynthetic bacteria numbers in soil obtained with MPN
method
854农场稻田土
So il of 854
rice f ield
原农大稻田土%
Soil of ND
rice f ield
林甸豆田土&
Soil o f
soybean f ield
854农场豆田土∋
Soil of
so ybean field
菌数 Numbers
( CFU#g- 1dried so il) 112 ( 10
4 )
329
∗ 0 128 )
% 稻田刚施过除草剂 T he paddy field was just applied the herbicide; & 黑钙土
Salinized chernozem soil; ∋ 白浆土 Albic bleached so il; )105 ! 烘干土样 Dried
soil sample under 105 ! ; ∗风干土样Air
dried so il sample.
3 2 2 MPN 法测定污水中光合细菌数量的影响因素
用
MPN 法对黎明桥下污水进行光合细菌计数, 在 10~ 104 稀
释倍数的多个试管出现棕色, 镜检发现细胞很大,不是光合
细菌; 个别试管有红色出现,污水中含光合细菌量约 14 CFU
#ml- 1.
光合细菌可降低水体 COD、BOD、氨氮和亚硝氮含量,
增加溶解氧,从而降低有害因子对养殖生物的毒害作用, 形
成对养殖生物有利的生物群落,改善和稳定水质.黎明桥下
污水性质与养殖水体相似, 自然条件下, 其光合细菌数量很
少,不占优势, 施用光合细菌菌剂可增加水体中的光合细菌
数量. 光合细菌在水体中的数量变化受溶解氧、光照、水温、
有机物种类和浓度、施入光合细菌的浓度、菌剂的活性、水体
中生物因素等方面的影响[ 7, 14, 24, 29, 31] . 从表 4 可以看出, 各
因素对施入水环境的光合细菌菌数的影响顺序为: 时间( D)
> 氧气( C) > 污水浓度 ( A ) > 菌液施用量( B) . 方差分析表
明, 时间( D)和氧气( C)含量对光合细菌数量影响显著,而污
水浓度和光合菌液施用量在试验范围内对光合细菌数量影
响不显著. 比较因素极差可知,光合细菌在厌氧、作用时间短
时存活菌数最多, 随着时间的延长,光合细菌数量逐渐下降,
后期数量又有所回升, 但与施入菌数相比均降低近 10 倍、几
十倍甚至上百倍, 这与其它报道的光合细菌净化鱼池水质效
果维持在 7~ 10 d 的结论基本相符[ 15, 17] .一些研究表明, 生
物因素对光合细菌数量的影响尤其明显, 浮游动物和鱼类对
光合 细菌 的 捕 食很 大 程 度上 影 响 光合 细 菌 的 数
量[ 11, 12, 14, 21, 29] .本研究表明, 好氧条件下光合细菌的数量很
低,这可能与好氧条件下浮游动物的活动和捕食活跃有关.
1578 应
用
生
态
学
报

















16卷
如果施用光合细菌以净化水质, 应注意 1)采用高活性菌剂;
2)采用合适的施用方式, 最好采用深施和定期补施等方式;
3)选择适当的剂型和施用剂量, 既要使光合细菌发挥作用,
又要防止施入过多菌剂影响水质; 4)根据水质决定施用与否
和施用时间.
表 4
光合细菌数量影响因素的正交试验结果及方差分析
Table 4 Orthogonal experimental result and its variance analysis about
the effect factors on PSB numbers
试验号
N o
因 素 Factors
A B C D
菌数Numbers
( CFU#ml- 1)
1 1
%
1
)
1
+
1
, 1 10
2 1 2 ∗ 2− 2
 1 50
3 1 3
.
3
/
3


14 00
4 2
&
1 2 3 15 00
5 2 2 3 1 11 00
6 2 3 1 2 3 50
7 3
∋
1 3 2 65
8 3 2 1 3 9 50
9 3 3 2 1 14 00
1 0 1 1 2 2 4 50
1 1 1 2 3 3 1 10
1 2 1 3 1 1 7
1 3 2 1 1 3 11 50
1 4 2 2 2 1 20 00
1 5 2 3 3 2 7 50
1 6 3 1 3 1 11
1 7 3 2 1 2 2 00
1 8 3 3 2 3 25 00
k1 371167 547667 461167 771333
k2 1141 667 751667 1333 333 327500
k3 854333 1067 833 572667 1268333
R 770500 520166 872166 940833
均方Mean square 1819361444 824301444 27034414442658328778
误差Error 11331144
自由度Degree of freedom 2 2 2 2
F 值F value 16 056 7275 23859* 23460*
F 临界值Critical value 1900 1900 1900 1900
A: 污水浓度 Sewage concentration; B: 菌液施用量 Dosage o f PSB addition; C: 氧
气 Oxygen; D: 时间 T ime. % 污水 3 倍稀释液 Three
fo ld dilut ion solution of
sewage; & 污水原液 Original sewage solut ion; ∋ 污水 6 倍稀释液 Six
fold dilu

t ion solution of sewage; )12 ( 109CFU #m- 3; ∗ 30 ( 109CFU# m- 3; .60 (
109CFU#m- 3; + 好氧处理 Aerobic treatment; −厌氧处理 Anaerobic treat

ment; /静置处理Stationary treatment; ,9 d;
 6 d;
3 dki:同一列中同一水
平的因子所对应的 3个菌数平均值 Average values of three values corresponding
to t he same level factor in the same column R: k1、k2、k3 的极差 Range o f k1, k2
and k3 * P< 005
4
结

论
用 MPN 法在厌氧、光照条件下对光合细菌进行计数是
可行的, 它既可测定光合细菌菌剂的含菌量, 也可以测定混
合菌剂中和光合细菌不占优势环境中的光合细菌数量及测
定光合细菌菌剂在环境中的数量变化.其测定结果在用较多
重复管数和样品含菌量较少时用低倍稀释法稀释灵敏度和
准确度更高 .用 MPN 法检测施用的光合细菌菌剂在环境中
数量的变化表明,光合细菌菌剂在水体中不能长期占优势,
存活时间较短( 6~ 9 d) .
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Zheng Y
T(郑耀通) , Wu X
P(吴小平) , Gao S
F(高树芳) . 2002.
A study on th e t reatment of bean products w astew ater w ith photo

synthet ic bacteria. A cta Agri c Univ Jiangxi ( 江西农业大学学
报) , 24( 3) : 393~ 397( in Chinese)
作者简介
崔战利, 女, 1964 年生, 硕士, 副教授. 主要从事
土壤和环境微生物研究, 发表论文 12 篇。E
mail: zhanlic@
yahoo. com. cn
欢迎订阅 2006年0应用生态学报1
0应用生态学报1( 1990年创刊)是经国家科委批准、科学出版社出版的国内外发行的综合性学术刊物.
本刊宗旨是坚持理论联系实际的办刊方向,结合科研、教学、生产实际,报道生态科学诸领域在应用基础研究
方面具有创新性的研究成果, 交流基础研究和应用研究的最新信息, 促进生态学研究为国民经济建设服务.
本刊专门登载有关应用生态学(主要包括森林生态学、农业生态学、草地牧业生态学、渔业生态学、自然
资源生态学、全球生态学、城市生态学、污染生态学、化学生态学、生态工程学和恢复生态学等)的综合性论
文、创造性研究报告和研究简报等.
本刊读者对象主要是从事生态学、地学、林学、农学和环境科学研究、教学、生产的科技工作者,有关专业
的大学生及经济管理和决策部门的工作者.
本刊与数十家相关学报级期刊建立了长期交换关系, 0中国科学引文索引1、0中国生物学文摘1、美国0生
物学文摘1( BA)、美国0化学文摘1( CA)、英国0生态学文摘1( EA)、日本0科学技术文献速报1( CBST)和俄罗
斯0文摘杂志1(
 )等十几种权威检索刊物均收录本刊的论文摘要(中英文) , 并被认定为0中国核心期刊
(遴选)数据库1和0中国科学引文数据库1来源期刊.本刊的整体质量与水平已达到新的高度, 1992年荣获全
国优秀科技期刊三等奖和中国科学院优秀期刊二等奖, 1996年荣获中国科学院优秀期刊三等奖. 2000年荣
获中国科学院优秀期刊二等奖. 2001年入选中国期刊方阵双效期刊.
本刊为月刊, A4开本, 192页, 每月 18日出版,期定价 45. 00元, 全国各地邮政局(所)均可订阅, 邮发代
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16卷