全 文 ：杉木连栽土壤微生物多样性的比较研究 3
李延茂1 ,2 　胡江春1 3 3 　张　晶1 ,2 　汪思龙1 　王书锦1
(1 中国科学院沈阳应用生态研究所 ,沈阳 110016 ;2 中国科学院研究生院 ,北京 100039)
【摘要】　分析了位于湖南会同广坪镇 1～4 代人工杉木林根际土壤微生物数量变化情况 ,结果表明 ,随杉
木连栽代数的增加 ,根际土壤中三大类群微生物数量发生显著变化 ,细菌和放线菌数量明显减少 ,真菌数
量显著增加. 利用 PCR 和 D GGE技术分析了 1～4 代杉木林根际土壤细菌区系和真菌区系. 结果表明 ,细
菌生物多样性在不同连栽代数杉木根际土壤中变化不明显 ,各代杉木土壤之间细菌的遗传相似性为
87 %.而真菌随连栽代数的增加 ,D GGE图谱带逐渐减少 ,真菌生物多样性降低 ,各代杉木土壤之间真菌的
遗传相似性也较低 ,仅为 45 %. 对各代杉木土壤主要真菌类群的分析表明 ,随连栽代数的增加 ,病原真菌
及产毒真菌增加显著.
关键词 　杉木 　连栽障碍 　土壤微生物 　PCR2D GGE 　生物多样性
文章编号 　1001 - 9332 (2005) 07 - 1275 - 04 　中图分类号 　S154. 37 　文献标识码 　A
Microbial diversity in continuously planted Chinese f ir soil. L I Yanmao1 ,2 , HU Jiangchun1 , ZHAN G Jing1 ,2 ,
WAN G Silong1 , WAN G Shujin1 ( 1 Institute of A pplied Ecology , Chinese Academy of Sciences , S henyang
110016 , China ; 2 Graduate School of Chinese Academy Sciences , Beijing 100039 , China) . 2Chin. J . A ppl .
Ecol . ,2005 ,16 (7) :1275～1278.
The study on the microbial diversity of 1st ,2nd ,3rd and 4th generation Chinese fir soil at Huitong Forest Experi2
mental Station showed that with the increase of generation ,the numbers of bacteria and actinomyces decreased
markedly ,while that of fungi increased evidently. It was found by PCR and D GGE that the bacterial diversity
changed slightly and its genetic similarity among different generations reached 87 % ,but the fungal diversity re2
duced and its genetic similarity was only 45 %. The numbers of pathogenic and deleterious fungi increased
markedly with increasing Chinese fir generations.
Key words 　Chinese fir , Continuous planting , Soil microbes , PCR2D GGE , Biodiversity.
3中国科学院沈阳应用生态研究所知识创新工程前沿领域项目
(SL YQ Y0413)和中国科学院陆地生态过程重点实验室基金资助项
目 (LDSTSJJ0406) .3 3 通讯联系人.
2004 - 12 - 10 收稿 ,2005 - 03 - 18 接受.
1 　引 　　言
杉木 ( Cunni ngham ia lanceolata) 是我国南方重
要速生造林树种 ,栽培面积达 41498 ×106 hm2 ,占全
国人工林总面积的 24 %[11 ] . 但是 ,在杉木人工林栽
培过程中 ,出现杉木连栽生长量普遍下降 ,甚至死亡
的现象. 据报道 ,杉木林二耕土其树高生长分别比头
耕土下降 10 %～15 % ,第 2 代杉木材积生长量比第
1 代下降 41 %. 连栽障碍现象已严重影响了杉木人
工林的持续经验 ,因此掌握不同栽植代数杉木人工
林生产力变化规律、揭示杉木人工林林地退化机制
已成为当前林业科学研究中急需解决的问
题[2 ,7 ,15 ,19 ,22 ] . 不少学者[6 ,10 ,18 ]研究指出 ,森林土壤
中毒现象与微生物有关 ,且森林土壤比耕作土壤有
更强的毒性. 杉木连栽导致土壤中病原微生物及
DRMO (非病原致害菌)的积累可能是造成杉木连栽
土壤中毒的原因之一[13 ] . 本文通过对不同连栽代数
杉木人工林土壤微生物区系变化情况的调查 ,探讨
了杉木连栽土壤微生物生态过程 ,为解决杉木连栽
障碍问题提供科学依据.
2 　研究地区与研究方法
211 　自然概况
实验区在中国科学院会同森林生态实验站 ,该站位于云
贵高原东缘斜坡和雪峰山西南地段 ,地处湖南省会同县广坪
镇内 ,103°39′E ,26°48′N ,属于亚热带湿润季风气候区. 年平
均气温 16. 5 ℃,年降雨量 1 200～1 400 mm ,湿润度大于 1.
土壤为板、页岩风化形成的红黄壤 ,海拔 300～600 m[23 ] .
212 　材料
21211 土样 　2003 年 10 月在湖南省会同县广坪镇境内选取
1 代、2 代、3 代、4 代杉木林 4 块样地 ,选择相同立地条件采
集根际土壤样品 ,每个样地选择 3 个采样点 ,采样深度为 0
～20 cm.
21212 培养基 　培养真菌用 Martin 氏培养基 ;细菌用牛肉膏
蛋白胨培养基 ;放线菌用高氏 1 号培养基 ;真菌发酵培养基 :
葡萄糖 (1 %) 、蔗糖 (3 %) 、蛋白胨 (1 %) 、NaCl (012 %) 、麦麸
应 用 生 态 学 报 　2005 年 7 月 　第 16 卷 　第 7 期 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
CHIN ESE JOURNAL OF APPL IED ECOLO GY ,J ul. 2005 ,16 (7)∶1275～1278
(0. 3 %) 、小米 (0. 3 %) .
213 　方法
21311 可培养微生物计数 　采用稀释平板分析法 [12 ] :细菌
接种时采用 100μg·ml - 1的土壤稀释液 0. 1 ml ;真菌接种时
头耕土、二耕土采用 10 mg·ml - 1的土壤稀释液 0. 05 ml ,三
耕土、四耕土采用 1 mg·ml - 1的土壤稀释液 0. 1 ml ;放线菌
接种时采用 1 mg·ml - 1的土壤稀释液 0. 1 ml. 各类群分析均
采用表面涂布法 ,每一样品 3 个重复 ,接种后置于 25～28 ℃
培养箱中培养. 细菌、真菌、放线菌分别在第 2 天、5 天、7 天
观察结果.
21312 土壤微生物多样性分析 　1) 土壤 DNA 的提取与纯
化 :参照罗海峰[14 ] 的方法进行. 2) 引物 :细菌引物 : GM5F2
GC : 5’2CGCCC GCCGC GCGCG GGCGG GGCGG GGGCA
CGGGG GGCCT ACGGG A GGCA GCA G23’; R518 : 5’2A T2
TAC CGCGG CTGCT GG23’; GM5F : 5’2CCTAC GGGA G
GCA GC A G23’. 真菌引物 : U1 (20bp) : 5’2GTGAA A TTGT
TGAAA GGGAA23’,U2 (18bp) :5’2GACTC CTTGG TCCGT
GTT23’,U22GC(58bp) :5’2CGCCC GCCGC GCGCG GCGGG
CGGGG CGGGG GCACG GGGGG GACTC CTTGG TCCGT
GTT23’. 以上引物均由大连宝生物公司合成. 3) PCR 反应条
件 :预变性条件为 94 ℃3 min ,并在 94 ℃30 s ,50 ℃30 s ,72
℃1 min 条件下进行 35 个循环. 然后在 72 ℃条件下延伸 10
min. 4) PCR 反应产物的变性梯度凝胶电泳 (D GGE) 分析 使
用 30 %～70 %的变性梯度凝胶 ,其中变性剂的浓度从胶的
上方向下方依次递增. 在 200V 电压下 ,60 ℃条件下电泳 5
h. 电泳完毕后 ,用银染法染色 (Bio2rad 系统) .
21313 土壤主要真菌类群的初步鉴定 　参见文献 [4 ] .
3 　结果与分析
311 　连栽对杉木土壤微生物数量的影响
分析结果 (图 1) 表明 ,不同代数杉木林土壤细
菌、真菌、放线菌的数量有明显差异 ,土壤真菌随连
栽代数的增加明显增加 ,不同代数杉木土壤真菌数
量变化均达差异极显著水平 ( P < 0. 01) . 第 1～4 代
的代次比为 1∶1. 41∶2. 54∶4. 23. 第 4 代人工杉木林
土壤真菌的数量是第一代的 4. 23 倍. 土壤细菌、放
线菌随连栽代数的增加则明显减少 ,除第一代与第
二代杉木林土壤细菌变化不明显外 ,不同代数杉木
土壤细菌、放线菌数量变化均达差异极显著水平 ( P
< 0. 01) . 细菌 1～4 代的代次比为 1∶0197∶0171∶
0156 ,放线菌的代次比为 1∶0192∶0164∶0157. 这与
已报道的研究结果相似[5 ] .
312 　连栽对杉木土壤微生物多样性的影响
31211 连栽对杉木土壤细菌多样性的影响 　采用对
大多数细菌的 16SrRNA 基因片断具有特异性的引
物进行了供试土壤细菌的基因组DNA特异性扩
图 1 　不同连栽代数杉木土壤细菌 (A) 、真菌 (B) 、放线菌 (C)总数
Fig. 1 Total bacteria (A) ,fungi (B) ,actinomyces(C) in different genera2
tions soils.
不同字母代表差异极显著 (LSD test P < 0101) Different letters are
significantly different (LSD test P < 0. 01) . 1 G:头耕土 1st generation
soil ;2 G:二耕土 2nd generation soil ; 3 G:三耕土 3rd generation soil ;
4 G:四耕土 4th generation soil.
增 ,其 PCR 扩增产物的变性梯度凝胶电泳 (D GGE)
图谱如图 2 所示. 在第 1 代、第 2 代、第 3 代和第 4
代杉木土样 D GGE 电泳条带数目均有一定差异但
变化不明显. 供试土壤有许多共同的条带 ,说明供试
土壤有相似的细菌类型 ,但个别条带的强度在不同
土样中存在明显差异 ,表明杉木连栽能影响某些种
类细菌的数量. 采用非加权成对算术平均法 (U PG2
MA)对土壤细菌 D GGE 指纹图谱作相似性聚类分
析 ,结果 (图 3)表明 ,各代杉木土壤之间的细菌遗传
相似性为 87 % ,4 代杉木土壤细菌的遗传差异并非
随连栽代数的增加而增加. 如与第 3 代杉木土壤相
比 ,第 2 代杉木土壤细菌的遗传差异大于第 1 代杉
木土壤细菌 ,表明连栽对土壤细菌多样性影响不大.
31212 连栽对杉木土壤真菌多样性的影响 　真菌的
D GGE 图谱如图 3 所示. 第 1、2、3、4 代杉木土壤真
菌 D GGE 电泳条带数目、各条带的强度均存在较大
差异. 随连栽代数的增加 ,电泳条带数目逐渐减少 ,
D GGE 带谱中每个条带都代表一个微生物物种或类
6721 应 　用 　生 　态 　学 　报 　　　　　　　　　　　　　　　　　　16 卷
图 2 　不同连栽代数杉木土壤细菌 16SrRNA 片断的 DGGE 图谱及
其遗传相似性聚类分析
Fig. 2 DGGE patterns of 16SrRNA fragments of bacteria and genetic
similarity of bacteria community obtained with PCR2DGGE from four
different generation soils of Chinese fir .
每个土样设 2 个重复 (即 2 条泳道) ,泳道 1～2 代表头耕土 ;泳道 3～
4 代表二耕土 ;泳道 5～6 代表三耕土 ;泳道 7～8 代表四耕土 Each
soil has three replicates (tree lanes) . Lanes 1～2 are the 1st generation
soil ; Lanes 3～4 are the 2nd generation soil ; Lanes 5～6 are the 3rd
generation soil ; Lanes 7～8 are the 4th generation soil. 下同 The same
below.
群 ,条带的多少即反映出该环境中微生物类群的数
量[1 ] . 因此 ,电泳条带数目逐渐减少表明长期种植
杉木纯林降低了土壤真菌的多样性. 某些条带的强
度在不同连栽代数的土壤中存在明显差别 ,表明杉
木连栽影响了土壤生态系统某些真菌的数量 ,从而
使土壤真菌群落结构发生变化. 不同代数间相似性
聚类分析 (图 3) 表明 ,各代杉木土壤之间的真菌遗
传相似性较低 ,仅为 45 %. 与第 1 代杉木土壤相比 ,
随连栽代数的增加其遗传相似性越低 ,表明长期种
植杉木纯林对土壤真菌群落结构有较明显的影响 ,
种植时间越长影响越明显.
图 3 　不同连栽代数杉木土壤真菌 18SrRNA 片断的 DGGE 图谱及
其土壤真菌群落 PCR2DGGE 的遗传相似性聚类分析
Fig. 3 DGGE patterns of 18SrRNA fragments of fungi and genetic simi2
larity of fungi community obtained with PCR2DGGE from four different
generation soils of Chinese fir .
313 　连栽对杉木土壤真菌主要类群的影响
对不同连栽代数土壤真菌的分析表明 (表 1) ,1
代、2 代、3 代、4 代杉木土壤中均以青霉菌为主要类
群 ,青霉菌的变化趋势不明显. 曲霉和木霉在土壤中
所占的比例有较显著的减少 ,镰刀菌所占比例增加
明显 ,其它非典型类群的真菌除二耕土外 ,其所占比
例亦呈下降趋势. 这进一步表明同一块地长期种植
杉木能影响土壤微生物区系 ,印证了图 3 所反映的
结论. 镰刀菌是重要的植物病原菌类群 ,它可以以活
体直接侵染寄主植物 ,亦可以分泌植物毒素毒害植
物. 调查结果表明 ,镰刀菌在头耕土中所占的比例为
2. 4 % ,二耕土为 3. 3 % ,三耕土为 4. 6 % ,四耕土中
所占比例上升到 6. 3 %. 镰刀菌等病原菌及其致害
真菌所占比例及绝对数量的明显增加可能是造成杉
木连栽土壤中毒的一个原因.
表 1 　不同连栽代数土壤真菌的比较
Table 1 Comparison of soil fungi under different generations soils ( cfu·g - 1 soil)
真菌类型
Fungi type
头耕土
1st generation soil
二耕土
2nd generation soil
三耕土
3rd generation soil
四耕土
4th generation soil
青霉 Penicilli um 1. 3 ×105 (61. 9) 3 2. 2 ×105 (73. 3) 4. 1 ×105 (77. 4) 6. 4 ×105 (71. 9)
曲霉 Asperqull us 3. 5 ×103 (1. 7) 4. 1 ×103 (1. 4) 6. 7 ×103 (1. 3) 6. 6 ×103 (0. 7)
木霉 Trichoclerma 8. 8 ×103 (4. 2) 9. 5 ×103 (3. 2) 1. 45 ×104 (2. 7) 7. 2 ×103 (0. 8)
毛霉 M ucor 2. 8 ×104 (13. 4) 3. 1 ×104 (10. 3) 2. 5 ×104 (4. 7) 1. 3 ×105 (14. 6)
镰刀菌 Fusarium 5. 0 ×103 (2. 4) 9. 9 ×103 (3. 3) 2. 4 ×104 (4. 6) 5. 0 ×104 (5. 7)
其它 Others fungi 3. 4 ×104 (16. 4) 2. 5 ×104 (8. 5) 4. 9 ×104 (9. 3) 5. 6 ×104 (6. 3)
总数 Total 2. 1 ×105 (100) 3. 0 ×105 (100) 5. 3 ×105 (100) 8. 9 ×105 (100)3 括号中数字表示所占比例 Numbers in the parentheses are relative values over total.
4 　讨 　　论
　　森林土壤微生物在枯枝落叶分解、腐殖质合成、
土壤养分循环、物质和能量的代谢过程中起着十分
重要的作用 ,土壤微生物的数量分布 ,不仅是土壤中
有机养分、无机养分及土壤通气透水性能的反应 ,而
且亦是土壤中生物活性的具体体现[21 ] ,是土壤肥沃
程度的一个重要指标[5 ] . 通过对不同连栽代数杉木
77217 期 　　　　　　　　　　　　　李延茂等 :杉木连栽土壤微生物多样性的比较研究 　　　　　　　　　　　
土壤细菌、真菌、放线菌的调查 ,发现随连栽代数的
增加 ,细菌、放线菌数量明显减少 ;而真菌数量随连
栽代数的增加而显著增加. 土壤微生物在土壤养分
的转化过程中起着非常重要的作用 ,微生物区系的
改变必然影响土壤中养分的转化和土壤有效养分的
含量[3 ] . 大量研究表明 ,随杉木连栽次数的增加 ,土
壤养分含量呈逐代下降趋势 , N、P、K 含量明显降
低[2 ,8 ,9 ,16 ,20 ] . 可以认为 ,土壤微生物数量及组成的
改变是造成杉木连栽土壤肥力下降的一个重要原
因.
森林土壤中毒与植物和微生物之间的相互关系
这一观点是由莱尼尔、米柯拉和克拉西里科夫等人
的工作确立起来的[17 ] . 他们证明了森林土壤比耕作
土壤具有更强的毒性 ,灰化土地带表现的最明显 ,枞
树林下土壤比松树、白桦树和柞树林下的土壤毒性
更大 ,并认为森林土壤中毒的原因可能来自于土壤
微生物. 早在 20 世纪 60 年代 ,中国科学院林业土壤
研究所 (现中国科学院沈阳应用生态研究所)的周崇
莲等人在湖南会同森林生态实验站对杉木连载土壤
中毒现象进行了研究 ,证实了杉木连载土壤存在毒
性物质 ,并进一步用三耕土中分得的真菌代谢产物
进行毒性试验 ,证实微生物抑制体可能是土壤中毒
性物质的来源之一. 不同连栽代数杉木土壤真菌经
PCR2D GGE 分析显示 :杉木连栽对土壤真菌多样
性、群落结构、丰富度影响较大. 随连栽代数的增加 ,
土壤真菌生物多样性降低 ,某些真菌种类富集 ,通过
传统方法发现 ,真菌数量随连栽次数的增加而增加
(图 1) ,镰刀菌等致害真菌所占的比例也显著提高.
可以认为 ,真菌作为主要的植物病原菌类群 ,杉木土
壤中 ,随连栽次数增加真菌 ,尤其是镰刀菌等致害真
菌的增加 ,可能是造成杉木连栽土壤中毒的重要原
因之一.
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作者简介 　李延茂 ,男 ,1979 年生 ,硕士研究生. 主要从事微
生物生态学方面的研究 ,已发表论文数篇. E2mail : liyan2
mao2000 @yahoo. com. cn
8721 应 　用 　生 　态 　学 　报 　　　　　　　　　　　　　　　　　　16 卷