全 文 ：转 Bt 基因棉花杀虫晶体蛋白的表达及
光合特性的研究 3
孙彩霞1 ,2 　陈利军1 3 3 　武志杰1 　吴　琼3 　陈翠薇4
(1 中国科学院沈阳应用生态研究所 ,沈阳 110016 ;2 东北大学理学院 ,沈阳 110004 ; 3 辽宁省经济作物研究所 ,辽阳 111000 ;
4 沈阳农业大学 ,沈阳 110161)
【摘要】　转 Bt 基因棉花 ( GK、ZK)及非 Bt 基因棉花 (CZ)杀虫晶体蛋白表达及光合特性的研究表明 ,杀虫
晶体蛋白在转 Bt 基因棉花 GK与 ZK中的表达总量及在各器官中的分配均有所不同. 转 Bt 基因棉花叶片
的净光合速率的光响应与常规棉有所不同. 转 Bt 基因棉花 GK与 ZK叶片的叶绿素含量、净光合速率、蒸
腾速率的日变化有明显的不同 ,而胞间二氧化碳浓度、气孔限制值、叶温的日变化趋势则基本一致. 胞间二
氧化碳浓度的日平均值在两转 Bt 基因棉花间的差异达显著水平 ,而其它各指标在不同处理间的差异均未
达显著.
关键词 　Bt 棉花 　杀虫晶体蛋白 　光合特性
文章编号 　1001 - 9332 (2004) 10 - 1878 - 05 　中图分类号 　S154. 2 　文献标识码 　A
Photosynthetic characters and Bt toxin content of different transgenic Bt cottons. SUN Caixia1 ,2 ,CHEN Li2
jun1 ,WU Zhijie1 , WU Qiong3 , CHEN Cuiwei4 ( 1 Institute of A pplied Ecology , Chinese Academy of Sciences ,
S henyang 110016 , China ; 2 College of Science , Northeastern U niversity , S henyang 110004 , China ; 3 Institute
of Economic Crop of L iaoning , L iaoyang 111000 , China ; 4 S henyang A gricultural U niversity , S henyang
110161 , China) . 2Chin. J . A ppl . Ecol . ,2004 ,15 (10) :1878～1882.
The study on the photosynthetic characters and Bt toxin content of different Bt cottons(ZK , GK) and non2Bt cot2
ton (CZ) indicated that Bt cottons GK and ZK had different total expressed amount of Bt toxin and its distribution
in different tissues. The Bt cottons had obviously different chlorophyll contents ,responses of photosynthetic rate
to photosynthetic active radiation ,and diurnal changes of photosynthetic rate and transpiration rate ,but the diur2
nal change of leaf temperature ,CO2 concentration inside leaf cells and stomatal limit values were approximately
the same. There was a significant difference between two transgenic Bt cottons in the diurnal average value of
CO2 concentration inside leaf cells ,but the differences in other characteristics were not significant among different
cottons.
Key words 　Transgenic Bt cotton , Bt toxin , Photosynthetic characters.3 国家自然科学基金项目 (40101016)和中国科学院沈阳应用生态研
究所知识创新工程重大资助项目 (SCXZD0104202) .3 3 通讯联系人.
2003 - 07 - 24 收稿 ,2003 - 11 - 05 接受.
1 　引 　　言
基因工程技术能够对作物进行精确的改造 ,使
转基因作物在产量、抗逆能力和品质方面均得到显
著改进 ;同时也可极大降低农业生产成本 ,缓解不断
恶化的农业生态环境. 但是转基因作物中导入的外
源基因通常来源于非近源物种 ,甚至可以是人工合
成的基因 ,由于受到基因互作、基因多效性等因素的
影响 ,可能会破坏受体基因的活性 ,影响受体植物的
代谢过程 ,从而使表型发生了改变[2 ,14 ,20 ] ;另外 ,由
于在转化过程中 ,需要经过较长时间的组织培养和
再生过程以及选择标记基因试剂的筛选诱变 ,势必
增加了变异的频率 ,引起较为广泛的体系胞无性系
变异[1 ,17 ,24 ] . 因而 ,外源基因在新的遗传背景中可
能产生很难精确预测的表型效应和副作用. 国内外
许多文献报道了转基因作物会产生一系列的性状变
异[3 ,5 ,7～9 ,11 ,12 ,15 ,18 ,23 ] . 首先是转基因作物在农艺性
状上发生了一定程度的改变. Lynch 等[15 ]研究表明
转基因水稻的植株变小、花期推迟和育性降低. 陈德
华等[5 ]研究表明 ,与非 Bt 棉比较 ,Bt 抗虫棉的棉苗
生长快 ,叶面积大 ,株高较高 ,果枝较长 ,株型合理 ,
但现蕾强度低 ,成铃强度变化不一. 崔海瑞等[7 ]发
现 ,在大田生长的条件下 ,转基因抗虫水稻的株高、
穗长、育性、单株产量和千粒重明显降低 ,而单株分
蘖数增多 ,落粒性增强 ,转基因植株一般推迟 3～5 d
开花 ,后期叶片转色速度慢. 赵海祯等[23 ]研究表明 ,
抗虫棉与常规棉比较 ,在出苗时间、结铃性、干物质
应 用 生 态 学 报 　2004 年 10 月 　第 15 卷 　第 10 期 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
CHIN ESE JOURNAL OF APPL IED ECOLO GY ,Oct . 2004 ,15 (10)∶1878～1882
积累、经济系数等生物学特性上有一定的差异. 其
次 ,外源基因的导入可能改变受体植物的生理特性.
Donegan 等[9 ]指出美国几种抗虫棉的生理特性可能
发生了一定的改变 ,从而导致了抗虫棉与常规棉组
织对土壤微生物区系有显著不同的影响. Grayston
等[11 ]指出基因操作最直接影响是改变了植物分泌
物和化学成分. 丁志勇等[8 ]研究结果表明 ,常规棉
与抗虫棉之间的过氧化物酶和酯酶的活性和酶带均
存在一定差异. 转 Bt 基因棉花是通过遗传工程技术
能够表达 Bt 基因并产生一定杀虫晶体蛋白的棉花.
因其对提高棉花产量和减少化学杀虫剂的用量起了
重要的作用 ,转 Bt 基因的抗虫棉已进入大规模的商
品化生产[13 ] . 我国是世界产棉大国 ,也是原棉消费
和棉制品出口大国 ,棉花生产在国民经济中具有举
足轻重的作用. 光合作用是棉花生长发育和产量形
成的基础 ,也是全球碳循环及其它物质循环的最重
要环节 ,叶片作为光合作用的主要器官直接影响作
物的光能利用率和生产力. 而 Bt 棉的抗虫性又与植
株体内杀虫晶体蛋白的表达特性直接相关. 在进行
生态风险评价时 ,除了考虑转基因作物导入的外源
基因及产物外 ,作物自身性状的改变而带来的生态
学效应也应是一个重要方面. 因而 ,深入进行转 Bt
基因棉花叶片的光合生理特性及其杀虫晶体蛋白的
研究 ,对于进一步揭示转 Bt 基因棉花的生长发育规
律 ,指导转基因棉花安全生产具有重要意义.
2 　材料与方法
211 　供试棉花
供试材料为国内育成转 Bt 基因棉花国抗 12 ( GK) 、中抗
30 (ZK)及非转 Bt 基因棉花中棉所 30 (CZ) . 盆栽温室种植.
供试土壤为棕壤 ,土壤有机质含量为 2152 g·kg - 1 ,p H 5172 ,
全氮 1122 g·kg - 1 ,全磷 ( P2O5 ) 1112 g·kg - 1 ,全钾 ( K2O)
24124 g·kg - 1 ,碱解性氮 106137 mg·kg - 1 ,有效磷 15192 mg
·kg - 1 ,有效钾 143129 mg·kg - 1 . 按照陈恩凤 (1987) 的方法 ,
化肥作底肥一次施用 ,尿素 1125 g·盆 - 1 , KH2 PO4 0197 g·
盆 - 1 ,每盆装土 4 kg. 5 月初播种 ,10 月末收获. 防治蚜虫、红
蜘蛛 2 次. 其它栽培管理按照常规进行. 于盛蕾期进行本试
验的取样并测定. 每个处理 3 次重复.
212 　测定方法
21211 Bt 杀虫晶体蛋白 (BICPs) 含量的测定 　采用 EL ISA
方法 ,EL ISA 试剂盒购于中国农业大学作物化控中心. 具体
操作步骤如下 : ①每个棉花组织样品取 015 g ,加入 215 ml
提取液 (Na2CO3 1133 g ,DTT 01192 g ,NaCl 11461 g ,Vc 015
g ,加蒸馏水 250 ml)及 60 mg PVP 研磨成匀浆. ②摇匀 ,4 ℃
下提取 4 h ,5 000 rpm 离心 15 min ,取上清液 ,用于测定. ③
包被. 每孔加入样品上清液 100μl ,每个样品重复三次. 在同
一酶标板上的两行孔中加入不同梯度的 Bt 标准杀虫晶体蛋
白用来做标准曲线. 将包被好的酶标板放入内铺湿纱布的带
盖瓷盘中 ,37 ℃下培养 3 h. ④洗板. 将包被好的酶标板取
出 ,甩掉包被液 ,用 8 孔道加样器每孔加入 150μl 洗涤液
(NaCl 810 g , KH2 PO4 012 g ,Na2 HPO4·12H2O 2196 g ,1 ml
Tween220 ,加蒸馏水 1000 ml) ,放置 1 min ,甩掉洗涤液 ,重复
洗涤 4 次 ,将板内残留洗涤液在吸水纸上用力甩干. ⑤每孔
加入稀释好的 Bt 晶体蛋白抗体 100μl ,放入湿盒 ,37 ℃下培
养 30 min. ⑥洗板. 重复步骤 ④. ⑦每孔加入稀释好的二抗
100μl ,放入湿盒 ,37 ℃下培养 30 min. ⑧洗板. 重复步骤 ④.
⑨显色. 每孔加入底物 (OPD 250 mg ,C6 H8O7·H2O 5110 g ,
Na2 HPO4 ·12H2O 18413 g , 10 ml Tween220 , 40 μl 30 %的
H2O ,加蒸馏水 100 ml) 100μl ,放入湿盒 ,37 ℃下培养 18 min
后 ,每孔加入 50μl 终止液 (2MH2 SO4) ,终止反应. ⑩用酶标
仪测定 450 nm 处的吸光值. 根据标准曲线计算各个棉花组
织中杀虫晶体蛋白含量.
21212 叶绿素及叶绿素 a、b 含量 　采用丙酮乙醇混合液法
提取并按 Arnon 公式计算[25 ] .
21213 光合参数 　于盛蕾期选晴天 ,利用美国 L I2COR 公司
生产的 Li26400 便携式光合系统分析仪测定棉花叶片净光
合速率 ( Pn ,μmol O2·m - 2·s - 1 ) 、蒸腾速率 ( Tr ,mmol·m - 2·
s
- 1) 、胞间二氧化碳浓度 (Ci ,μmol·μmol - 1 Air) ,光合有效辐
射 ( PAR ,μmol·m - 2 ·s - 1 ) 、空气温度 ( Tair , ℃) 、叶片温度
(Tleaf , ℃) 、空气相对湿度 ( RH , %) 、空气二氧化碳浓度
(μmol·μmol - 1 Air)等. 具体测定如下 :选取棉花功能叶片 ,自
上午 6 :30 至下午 17 :30 ,每小时测定一次. 每次测定各处理
的叶片 10 个 ,取平均值用于统计分析. 其中 ,气孔限制值
(Ls)利用 Downton[10 ] 方法计算 : Ls = Co - CiCo - Γ≈1 -
Ci
Co
方程
中 , Ci 、Co 和Γ分别为 :细胞间隙 CO2 浓度、叶外 CO2 浓度
及 CO2 补偿点.
3 　结果与分析
311 　不同转 Bt 基因棉花各组织中杀虫晶体蛋白的
表达
转Bt 基因棉花是经过遗传修饰能表达杀虫晶
体蛋白并杀死取食植株组织的鳞翅目害虫的棉花.
由图 1 可知 ,杀虫晶体蛋白在各棉花组织器官中均
有表达. 其中 ,杀虫晶体蛋白在两种转 Bt 基因棉花
叶片和花蕾中的表达量均高于根系和茎秆 ;转 Bt 基
因棉花 GK 叶片中的杀虫晶体蛋白含量高于转 Bt
基因棉花 ZK ,但转 Bt 基因棉花 ZK(479109 ng·g - 1
鲜重)整个植株体杀虫晶体蛋白的表达总量则高于
转 Bt 基因棉花 GK(451140 ng·g - 1鲜重) . 可见 ,不
同转 Bt 基因棉花品种及不同组织器官中的杀虫晶
体蛋白的表达量有所不同.
978110 期 　　　　　　　　　　孙彩霞等 :转 Bt 基因棉花杀虫晶体蛋白的表达及光合特性的研究 　　　　　　　　　　　
图 1 　不同转 Bt 基因棉花各器官在盛蕾期的杀虫晶体蛋白含量
Fig. 1 BICPs contents in different tissues of different Bt cottons at full
squaring stage.
312 　不同品种棉花叶片的叶绿素含量
叶绿素 a 和叶绿素 b 均可作为集光色素而捕获
光能 ,而只有部分叶绿素 a 才能充当反应中心色素 ,
叶绿素中的叶绿素 a/ b 的比值不同则光合活性不
同.由图 2 可知 ,不同棉花品种叶片中的叶绿素及
a、b 含量有所不同 ,依次为转 Bt 基因棉花 GK > 非
转 Bt 基因棉花 > 转 Bt 基因棉花 ZK. 与非转 Bt 基
因棉花比较 , 转 Bt 基因棉花 GK 的叶绿素 a/ b
(2119) 较大而转 Bt 基因棉花 ZK 的叶绿素 a/ b
(2114)较小 ,表明转 Bt 基因棉花 GK叶片的光合性
能优于 ZK.
图 2 　不同品种棉花叶片在盛蕾期的叶绿素含量
Fig. 2 Chlorophyll content in different cotton leaves at full squaring stage.
313 　不同品种棉花叶片净光合速率的光响应
光是调控作物生长的重要因子 ,也是形成叶绿
素、叶绿体以及正常叶片的必要条件 ,光还显著地调
节光合酶的活性和气孔开度 ,因此光直接制约着光
合速率的高低. 将棉花叶片净光合速率和光合有效
辐射作交互式散点图并进行拟合 (图 3) ,发现非转
基因棉花的净光合速率与光合有效辐射的散点趋势
线基本符合直角双曲线方程 ,而两种转基因棉花的
拟合趋势线则与非转基因棉花有明显不同.
图 3 　棉花叶片净光合速率的光响应
Fig. 3 Response of net photosynthetic rate to light of cotton leaves.
314 　不同品种棉花叶片净光合速率、蒸腾速率的日
变化
由图 4 可知 ,不同转 Bt 基因棉及常规棉花叶片
的净光合速率和蒸腾速率的日变化趋势有所不同.
其中 ,转 Bt 基因棉花 GK 与非转 Bt 基因棉花的变
化趋势基本相同 ,呈明显的单峰曲线 ,即早晨低 ,中
午高 ,在 10 :30 左右 Pn 分别达到最大 (转Bt 基因棉
花 GK为 18171μmol CO2·m - 2·s - 1 ,非转Bt 基因棉
花为 19183μmol CO2·m - 2·s - 1) ,在下午又逐渐降
低. 转 Bt 基因棉花 ZK的净光合速率则在中午出现
低谷 ,在 12 :30 左右达到最高值 (18184μmol CO2·
m
- 2·s - 1) . 两种转 Bt 基因棉花与非转 Bt 基因棉花
叶片蒸腾速率的日变化规律与净光合速率的日变化
趋势基本相同. 转 Bt 基因棉花 GK的净光合速率的
日平均值 (10139 ±2111)比非转 Bt 基因棉花 (10182
图 4 　棉花叶片净光合速率和蒸腾速率的日变化
Fig. 4 Daily changes of net photosynthetic rate ( Pn) and transpiration rate
( Tr) of cotton leaves.
1) Pn (Bt2GK) ;2) Pn (Bt2ZK) ;3) Pn (Non2Bt) ;4) Tr (Bt2GK) ;5) Tr (Bt2
ZK) ;6) Tr (Non2Bt) .
0881　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　应 　用 　生 　态 　学 　报 　　　　　　　　　　　　　　　　　　15 卷
±1124) 低 3199 % ,而 ZK(11159 ±0159) 则比非转
Bt 基因棉花高出 3145 % ;转 Bt 基因棉花 GK 的蒸
腾速率的日平均值 (4161 ±1133) 比非转 Bt 基因棉
花 (4172 ±0161) 低 2119 % ,而 ZK(5135 ±0157) 则
比非转 Bt 基因棉花高出 13150 %. 方差分析表明 ,
不同棉花叶片净光合速率和蒸腾速率的日平均值差
异未达显著.
315 　不同品种棉花叶片胞间 CO2 浓度和气孔限制
值的日变化
胞间 CO2 浓度和气孔限制值可以用作确定光合
速率变化主要原因的判断依据. 由图 5 可知 ,从上午
8 :30 到下午 16 :30 之间 ,当光合速率呈现低值时 ,伴
随着胞间 CO2 浓度降低和气孔限制值增加 ,说明“气
孔因素”是此时光合速率低的主要原因 ;而在早上或
晚上光合速率呈现低值时并伴随胞间 CO2 浓度提高 ,
说明“非气孔因素”是此时光合速率低的主要原因. 不
同棉花叶片胞间 CO2 浓度和气孔限制值的日变化趋
势基本相同. 转 Bt 基因棉花 GK的胞间 CO2 浓度的
日平均值 ( 228149 ±17176) 比非转 Bt 基因棉花
(228187 ±7180) 低 0117 % ,而 ZK(240141 ±8172) 则
比非转Bt 基因棉花高出 5104 %;转 Bt 基因棉花 GK
的气孔限制值的日平均值 (0138 ±0106)比非转 Bt 基
因棉花 (0136 ±0102) 高出 6122 % ,而 ZK (0133 ±
0103)则比非转 Bt 基因棉花低 7174 %. 方差分析表
明 ,两转Bt 基因棉花的胞间 CO2 浓度的日平均值差
异显著 ,而气孔限制值的差异未达显著.
316 　影响光合作用环境因子的日变化
由图 6 可知 ,不同棉花品种叶片的温度日变化
趋势没有明显的不同 ,且与气温的变化趋势相同. 转
基因棉花 GK的叶温日平均值 (37108 ±0128)比非
图 5 　棉花叶片胞间 CO2 浓度 (Ci)和气孔限制值 (Ls)的日变化
Fig. 5 Daily changes of CO2 concentration inside cells (Ci) and stomatal
limit value (Ls) of cotton leaves.
1) Ci (Bt2GK; 2) Ci (Bt2ZK) ; 3) Ci ( Non2Bt) ; 4) Ls (Bt2GK) ; 5) Ls (Bt2
ZK) ;6) Ls(Non2Bt) .
转 Bt 基因棉花 (37104 ±0122) 高出 0104 ℃,而 ZK
(36190 ±0166)则比非转 Bt 基因棉花低 0114 ℃. 方
差分析表明 ,不同棉花叶温的日变化差异未达显著.
棉花叶片净光合速率日变化与 PAR 日变化曲线基
本吻合 (图 4、图 6) ,说明光合有效辐射是净光合速
率日变化形成的主要原因. 空气相对湿度与叶片净
光合速率日变化之间的关系相对不明显.
图 6 　影响棉花叶片光合作用几个环境因子的日变化
Fig. 6 Daily variation of environmental factors effecting photosynthesis.
1) PARi ;2) Tleaf (Bt2GK) ;2) Tleaf (Bt2ZK) ;3) Tleaf (Non2Bt) ;5) Tair ;
6) RH2S.
4 　讨 　　论
苏云金芽孢杆菌 ( B acill us thuri ngiensis) 杀虫
晶体蛋白基因导入棉花植株后获得的转 Bt 棉花可
以特异性地毒杀棉铃虫及鳞翅目的一些其他害虫 ,
有效地保护棉花植株不受此类棉花害虫的危害. 转
Bt 基因棉之所以能够抗虫是由于棉株能够合成表
达具有杀虫毒性的杀虫晶体蛋白. 因而 ,国内外许多
学者都对抗虫棉各器官毒蛋白的含量及时空表达特
性进行了一系列研究. Sachs 等[16 ]测定了 Bt 棉顶尖
嫩叶的杀虫晶体蛋白含量 ,结果表明 ,在蕾期和花铃
期其含量较高 ,而苗期、初花期、吐絮期含量较低 ,呈
M 型. 陈松等[6 ]的测定结果表明 ,功能叶片中杀虫
晶体蛋白在不同生育期的表达为苗期 > 蕾期 > 花铃
期.邢朝柱等[22 ]测定新棉 33B 和 GK3 的顶尖平展
叶的杀虫晶体蛋白含量为 :初花期 > 蕾期、花铃期 >
苗期 > 吐絮期. 张永军等[26 ]的研究结果表明 ,新棉
33B、GK12 和 GK2 的杀虫蛋白在苗期和蕾期的表
达量较高 ,花期呈下降趋势 ,花铃期下降最为明显 ,
到铃期和吐絮期含量略有回升 ;杀虫蛋白在不同组
织器官中的表达量依次为 :叶 > 铃、花心、花萼、蕾 >
花瓣 > 苞叶. 王保民等[21 ]试验结果表明 ,中棉 30 叶
片中的杀虫晶体蛋白含量远远高于蕾、花、铃 ,而蕾、
花、铃中的含量差异不大 ;而在不同生育阶段 ,相同
188110 期 　　　　　　　　　　孙彩霞等 :转 Bt 基因棉花杀虫晶体蛋白的表达及光合特性的研究 　　　　　　　　　　　
发育期的叶、蕾、花、铃中的毒蛋白的表达并未出现
明显的前期高、后期低或者峰谷现象. 本项研究结果
表明 ,杀虫晶体蛋白在转 Bt 基因棉花 GK与 ZK中
的表达总量及在各器官中的分配均有所不同. 不同
研究结果之间存在一定差异 ,这可能是由于试验中
采用的供试棉花的品系和采样的时间及测定部位的
不同而造成的 ,或者是由于作物内部发育的调控及
其生长环境、管理条件等一些外界条件的不同而对
杀虫晶体蛋白的表达产生一定的影响[4 ,19 ] .
光合作用和蒸腾作用是棉花生长发育和产量形
成的物质基础 ,包括一系列生物物理、生物化学反
应. 作为生理过程 ,光合作用与蒸腾作用是相互联系
相互影响的. 光合速率是叶片内外 CO2 浓度梯度和
扩散阻力的函数. 叶片外面的空气和叶绿体内的羧
化部位之间的浓度梯度越大 ,从空气到羧化部位之
间的扩散阻力越小 ,即导度越大 ,叶片的光合速率越
高.蒸腾作用对叶片净光合速率的影响是通过气孔
的开度和引起叶内含水量的变化而间接起作用的.
本项研究结果表明 ,转 Bt 基因棉花 GK与 ZK叶片
的叶绿素含量、净光合速率的光响应、净光合速率、
蒸腾速率的日变化有明显的不同 ,而叶温、胞间 CO2
浓度、气孔限制值的日变化则基本一致. 具有较低杀
虫晶体蛋白含量 ZK棉花叶片的叶绿素含量和气孔
限制值低于杀虫晶体蛋白含量高的 GK ,而 ZK的净
光合速率、蒸腾速率和胞间 CO2 浓度的日平均值则
比 GK 高. 其中 ,胞间 CO2 浓度的日平均值在两转
Bt 基因棉花间的差异达显著水平 ,而其它各指标均
无显著差异.
然而 ,本文仅对棉花叶片在盛蕾期的光合生理
特性进行了研究 ,这些差异能否稳定尚需通过对棉
花不同生长发育时期以及在群体水平上开展的研究
进一步证实. 另外 ,如果这些差异不仅与基因型有关
而且与杀虫晶体蛋白的表达量有关 ,则可将其作为
进行综合生态风险评价中考虑的鉴定指标 ,为大规
模种植抗虫棉的风险评价提供依据.
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作者简介 　孙彩霞 ,女 ,1973 年 ,博士后 ,主要从事植物逆境
生理和转基因作物生态安全性评价方面的研究. E2mail :sun2
caixia @hotmail. com
2881　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　应 　用 　生 　态 　学 　报 　　　　　　　　　　　　　　　　　　15 卷