全 文 ：微卫星标记在分子生态学中的应用及其
位点的分离策略 3
薛　辉　吴孝兵 3 3 　晏　鹏
(安徽师范大学生命科学学院 ,芜湖 241000)
【摘要】　微卫星 DNA 作为一种优良的遗传标记在分子生态学领域得到了广泛应用 ,本文综述了其在分子
种群生物学、分子环境遗传学、分子适应等研究领域中的应用情况. 微卫星位点的获得是开展各项研究的
前提 ,传统的构建微卫星文库再杂交筛选的方法工作量大、效率低 ,因而在实践过程中又产生了富集文库
法、PIMA 法、FIASCO 法等新的分离策略. 本文对几种微卫星位点分离技术进行介绍并对其进行分析比
较 , 为分子生态学研究过程中微卫星位点筛选方法的选择提供参考.
关键词 　微卫星 DNA 　分离 　富集
文章编号 　1001 - 9332 (2005) 02 - 0385 - 05 　中图分类号 　Q141 　文献标识码 　A
Application of microsatellite DNA in molecular ecology and strategies for loci isolation. XU E Hui ,WU Xiaob2
ing , YAN Peng ( College of L if e Sciences , A nhui Norm al U niversity , W uhu 241000 , China) . 2Chin. J . A ppl .
Ecol . ,2005 ,16 (2) :385～389.
Microsatellite DNA has been widely used as a good genetic marker in molecular ecology. This paper reviewed its
application in molecular population biology ,molecular environmental genetics ,and molecular adaptation. The iso2
lation of the loci is the basis of microsatellite DNA genetic analysis. Compared with the traditional isolation
method by genomic library , some novel approaches carried out recently , such as enrichment library , PIMA and
FIASCO ,are more efficient and timesaving. The details and compare2analysis of these approaches were intro2
duced ,which would offer good choices for researches on molecular ecology.
Key words 　Microsatellite DNA , Isolation , Enrichment
3 国家自然科学基金项目 ( 30270213 ) 、安徽省自然科学基金
(01043501) 、安徽省优秀青年基金项目 (04043049) 、重要生物资源保
护与利用安徽省重点实验室基金及安徽省学术与技术带头人专项基
金资助项目.3 3 通讯联系人.
2004 - 05 - 02 收稿 ,2004 - 09 - 10 接受.
1 　引 　　言
20 世纪 80 年代后期 , Marshfield 医学研究基金会
(Marshfield Medical Research Foundation) 的 James 和俄勒冈
健康科学大学 (Oregon Health Sciences University) 的 Wis 等
人分离出来一种比小卫星 DNA 具有更短重复单元的卫星
DNA ,被称为微卫星 DNA[24 ] ,又被称作短串连重复 ( Short
Tandem Repeats , STRs) 或简单重复序列 ( Simple Sequence
Repeats ,SSRs) ,每单元长度在 1～6bp 之间. 根据重复单元的
构成与分布 ,微卫星 DNA 序列被分为 3 种类型 :单一型
(pure) ,复合型 (compound)和间断型 (interrupted) [16 ] ,例如 :
单一型 :CACACACACACACACACACA
复合型 :CACACACACACA GA GA GA GA
间断型 :CACA TTCACACA TTCA TTCA
微卫星 DNA 符合孟德尔遗传模式 ,共显性表达 ,广泛分
布于真核生物的基因组中 ,包括编码区和非编码区 [12 ] . 研究
表明 ,可能是 DNA 复制过程中的“链滑”( strand slippage) 现
象造成微卫星 DNA 多态性信息容量 (polymorphic informa2
tion content ,PIC) 较高[5 ] . 由于微卫星具有数量多、在基因
组内分布均匀、多态性信息丰富、易于检测等优点 [21 ]被作为
优良的遗传标记 (genetic marker) 而得到广泛应用. 1992 年
《Molecular Ecology》创刊 ,标志着分子生态学已经成为生态
学的一个新分支学科 ,主要研究内容包括种群遗传学、分子
环境遗传学、分子适应等 [3 ] . 事实上 ,在这门学科形成之前 ,
微卫星分子标记已经在该领域中得到了应用 ,参阅《Molecu2
lar Ecology》杂志中近年来有关微卫星应用的文章 ,本文综述
了其在分子生态学研究中的研究进展.
2 　微卫星标记在分子生态学中的应用
211 　在分子种群生物学中的应用
21111 种群遗传学 　种群遗传学主要研究繁育体系 ,以及突
变、选择、随机漂变等对种群基因频率的影响 ,即生物进化的
过程. 微卫星同大多数同工酶和 RFL Ps ( Restriction Frag2
ment Length Polymorphisms)一样 ,是很好的共显性标记物 ,
在监测种群基因频率波动时十分有力 ,常被运用于种群遗传
结构的研究. Cote 等[8 ] (2002) 以 14 个微卫星位点分析了斯
瓦尔巴特群岛驯鹿 ( Rangif er tarandus) 种群的遗传漂变. 样
本分别取自两个相邻区域 (Colesdalen 和 Reindalen)的驯鹿种
群 ,研究表明平均每个微卫星位点 214 个等位基因 ,预期杂
应 用 生 态 学 报 　2005 年 2 月 　第 16 卷 　第 2 期 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
CHIN ESE JOURNAL OF APPL IED ECOLO GY ,Feb. 2005 ,16 (2)∶385～389
合度 0136 ,与内陆的加拿大和挪威种群相比 ,各位点的杂合
度均偏低. 同时发现 Colesdalen 和 Reindalen 这两个相距 45
km 的驯鹿种群高度遗传分化 ,这样的地理距离有如此大的
分化 ,对有远距离迁移习性的驯鹿来说可能是首次发现. 按
蚊 ( A nopheles gambiae) 是疟原虫的寄主 ,20 世纪 80 年代初
圣多美和普林西比举国开展灭蚊运动以降低疟疾的传播 ,其
后由于运动的中断流行病又广泛传播. Pinto [26 ]用 13 个微卫
星位点研究了这个岛国内按蚊的遗传结构 ,分析种群的遗传
变异及杂合度 :固定系数 ( FST)及相似系数 ( RST) 均表明种群
间差异较大 ,杂合度检验结果是种间和种内杂合度都未见显
著差异 ( P > 0105) ,有效种群 ( Ne) 仍较大. 微卫星分析表明
灭蚊运动中使用的传统方法 (户内喷洒 DDT 和大量药剂的
配给)并未能降低有效种群数量 ,按蚊并未经历瓶颈效应 ,种
群仍处于平衡状态.
21112 行为生态学 　微卫星分子标记可用于个体识别及亲
权鉴定 ,为研究动物社群结构、迁移行为和繁殖策略提供了
强有力的工具 ,而在繁殖行为的研究方面应用更为突出. 尖
嘴鱼 ( Nerophis ophidion)雌性将卵产于雄性腹袋内的血管上
靠雄性体内的养分供养 ,雄体体外携带受精卵承担孕育鱼卵
的责任. 微卫星亲权分析发现雄鱼携带的卵来自同一雌体 ,
而雌鱼在一个繁殖周期中却将卵产在多个雄鱼身上 [23 ] . 微
卫星亲权分析也在侧颈龟 ( Podocnemis ex pansa) 身上进行 ,
同巢卵可能来自 2～3 个父系 ,由此说明该动物也是一妻多
夫制[34 ] . 国内曾用微卫星技术结合野外观察研究高原鼠兔
的繁殖行为 ,弄清了其配偶制度、亲缘关系、社会等级等 [41 ] .
在分子生态学领域中社会性动物的行为生态 (如蜜蜂和某些
蚁类)是有很趣的课题 ,微卫星技术在这些研究中也得到普
遍应用[2 ,11 ,25 ] .
21113 保护生物学 　微卫星多态检测技术在保护遗传学中
应用于种群杂合度、历史种群推测、种群异质性分析等研究
中[40 ] .瓶颈效应和有效种群大小对于种群遗传多态性和长
期生存力的影响是保护生物学研究的两个核心问题.
Waldick[35 ]用微卫星位点变异评估历史上瓶颈效应对北大
西洋露脊鲸 ( Eubalaena glacialis) 这一濒危物种遗传多态性
的影响. 结果表明 ,大西洋露脊鲸与近缘种南露脊鲸 ( Eubal2
aena aust ralis)相比 ,等位基因频率 (A) 和杂合度 ( H) 均显著
偏低 ( P < 01001) ,说明从 11 世纪以来的商业捕杀已经严重
影响到北大西洋露脊鲸的遗传多态. 澳大利亚野兔 ( Orycto2
lagus cuniculus)种群源于 1859 年由欧洲引入的 13 只奠基野
兔. Zenger[43 ]比较了欧、澳两洲野兔种群微卫星多态性以分
析瓶颈效应对澳大利亚野兔种群遗传多态的影响 ,分析证明
澳大利亚野兔种群遗传多态差异并未降低. 该研究的结果在
保护生物学中有重要启示 :种群经瓶颈效应后种群大小 ,尤
其是有效种群大小十分重要 ,它决定了遗传多态的丧失程
度.
212 　在分子环境遗传学中的应用
外因 (环境因素等) 和内因 (社会行为、繁殖策略及迁移
方式等)的交互作用对于生物种群数量具有重要影响 ,但人
类干涉导致自然种群与生境失去平衡更是影响种群数量的
重要因素. 生境片断化 (habitat fragmentation)影响基因流 ,导
致近亲交配 , 降低个体生活力 , 威胁濒危物种的生存.
Williams[37 ]为了弄清栖息地片断化对自然种群遗传方面的
影响 ,以蛱蝶 ( S peyeria idalia)为研究对象 ,从 5 个连续分布
和 5 个片断化分布的栖息地分别取样 ,通过微卫星位点差异
的比较发现 ,栖息地连续分布的自然种群的遗传分化程度低
于片断化种群 ,而遗传多态性则高于片断化种群. 种群的景
观位置 (landscape location)对于种群具遗传效应 ,Schwartz[30 ]
用微卫星标记研究了加拿大猞猁 ( L ynx canadensis) 边缘种
群 (peripheral population)与核心种群 (core population) 的遗传
结构 ,发现边缘种群虽然活动范围较大但种群较小 ,致使微
卫星位点平均等位基因数目较少 ,预期杂合度也较低.
213 　在分子适应研究中的应用
分子适应研究的内容包括遗传分化和生理适应、形态分
化的关系及环境对基因表达的影响. Storz[32 ]比较了印度半
岛果蝠 ( Cynopterus sphinx)种群间的数量性状分化和遗传分
化 ,发现遗传分化 ( Fst ) 和表型差异 ( Qst ) 程度显著相关.
Robert (2003)分析了加拿大魁北克省的侏儒型和正常型胡
瓜鱼 ( Osmerus mordax ) 的数量性状分化和遗传分化[20 ] .
Storzh 和 Robert 在分析遗传分化时都是以微卫星作为遗传
标记进行研究 ,这是因为微卫星标记作为中性基因可以与受
到选择压力的性状及其相关基因的分化作比较 ,为分子适应
研究提供了有力的工具.
3 　微卫星位点分离策略
　　微卫星位点的获得有两条渠道 ,一是借鉴同源近似物
种 ,由近缘物种微卫星引物来扩增研究物种基因组 DNA ,该
方法在部分物种中得到应用且效果较好 [4 ] ,但适用的范围有
其局限性 ,并非所有物种都能寻找到其近缘物种的引物 ;二
是直接分离 ,从研究对象的基因组中分离出多态的微卫星位
点 ,这在大多数物种的研究中是必须的. 因此 ,寻找到一种与
实验条件相适应的 ,较为经济适用的分离方法就成了大多数
研究者的目标. 传统的分离方法由 Rassmann 等[28 ]提出 ,即
先建部分基因组文库 ,再用探针杂交从基因组文库中筛选出
微卫星位点. 自 1994 年以来 ,国内期刊发表关于微卫星的论
文已有百余篇 ,其中有关微卫星位点直接筛选的多采用传统
的建部分文库的方法 [36 ,39 ,44 ] . 近年来 ,经过研究者的努力 ,
一些改进的微卫星位点分离技术已经出现 ,传统的筛选方法
正在被逐步替代 ,下面介绍几种现行的位点分离策略.
311 　富集文库法 ( Enriched Library)
传统的筛选方法直接从基因组文库中筛选微卫星位点 ,
从大量克隆中得到阳性克隆的比例很低. 为了提高筛选工作
效率 ,自 1993 年研究者陆续提出微卫星探针杂交方法达到
对微卫星片段富集的目的 ,然后再构建微卫星富集文库. 富
集过程中尽量去除不含有微卫星位点的片段 ,使得留下的
DNA 片段中含有微卫星位点的片段含量相对较高. 先后有
两种富集方法提出 ,最初为 Karagyozov 等[19 ]提出的滤膜富
683 应 　用 　生 　态 　学 　报 　　　　　　　　　　　　　　　　　　16 卷
集法 ,先将微卫星探针固定在滤膜上 ,通过与片断化基因组
DNA 杂交将目的片段富集到膜上 ,然后洗涤除去非目的片
段 ,最后变性回收目的片段 (图 1) . 之后是 1994 年 Kandpal
等[7 ,10 ,17 ,27 ,29 ]提出的磁珠 (magnetic bead) 富集法 ,具有高效
富集微卫星 DNA 的作用 ,提出后被迅速广泛地应用于微卫
星位点的筛选. 具体步骤为 :将生物素 (biotin) 标记的探针与
基因组 DNA 片段杂交 ,然后与包被一层亲合素 (avidin) 或链
亲合素 (streptavidin)的磁珠混合温育 ,亲合素或链亲合素与
生物素均能耦连 ,杂交上生物素标记探针的 DNA 片段 (即是
含有微卫星位点的片段)因生物素与抗生物素的结合而黏附
在磁性小珠上. 接着便用洗液将未杂交上的片段洗去 ,通常
2～4 遍. 在洗涤滤膜或磁珠时 ,尺度把握较为重要 ,太过严
格便有可能将附着在磁珠上的含微卫星位点的 DNA 片段洗
去 ,而过松则又会剩下较多的非目的片段 [33 ] . 最后高温变性
将附着在磁珠上的 DNA 片段洗脱下来 , PCR 扩增恢复片段
浓度 ,用于克隆[18 ] (图 1) .
图 1 　微卫星位点富集示意图 (改编自 Zane ,2002) .
Fig. 1 Show the enriched process of the microsatellite loci (adapted from
Zane ,2002) .
312 　微卫星序列 PCR 分离技术 ( PCR2based isolation of mi2
crosatellites arrays ,PIMA)
聚合酶链式反应 ( Polymerase Chain Reaction , PCR) 被研
究者运用于微卫星位点的分离. 一些研究者对随机扩增长度
多态性 DNA 分析 ( randomly amplified polymorphic DNA ,
RAPD)进行改进 ,直接使用重复锚定随机引物扩增出未知
的微卫星序列 ,而后通过 Southern 杂交选出目的片段[6 ,38 ] ,
但该种方法获得的微卫星序列因缺乏侧翼序列的信息而无
法进行单个位点的分析.
Lunt 等[22 ]在 Ender (1996)提出的 RAPD 分离微卫星位
点方法的基础上进一步发展 ,提出了较为完善的以 PCR 技
术为基础的微卫星位点分离技术 ,即 PIMA. 用 RAPD 引物
随机扩增基因组获得 DNA 片断 ,选出其中带型集中大小适
于克隆的扩增产物用于克隆. 由 PCR 法筛选阳性克隆 :将重
组阳性克隆接入影印平板 (replica plate) 中摇菌过夜 ,而后对
菌液双重 PCR 扩增 (3 条引物 ,“两侧载体序列引物”+“微卫
星引物”) ,阳性克隆除了针对载体序列的正反向引物扩出的
主带之外 ,在其前方还有一条带. 在用 PCR 筛选时做一阴性
对照更能提高筛选的准确性 ,即同一样本克隆不加微卫星引
物 PCR 扩增. 之后 ,对筛选出来的阳性克隆 LB 培养 ,并测
序.克隆在转入影印平板后使用多道移液器进行 PCR 加样
可以提高工作效率. 相对而言 , PCR 筛选简单快捷 ,虽然 PI2
MA 法仍需克隆 ,但整个过程以 PCR 反应为基础 ,易于操
作.
313 　AFL P 分离微卫星位点 ( Fast Isolation by AFL P of Se2
quences Containing repeats site ,FIASCO)
在 AFL P 技术产生后 , Hakki[13 ]用 AFL P 法分离出小麦
的微卫星位点. 这是一种无需克隆与筛选的快捷方法. 基因
组 DNA 被限制性内切酶随机酶切并被连接上 AFL P 接头 ,
AFL P 分析中使用的接头合成后末端去磷酸化 ,可防止接头
自身连接 ,设计的接头序列避免了含有酶切位点 ,因而 ,酶
切、连接反应可以在一个反应体系中一步完成. 在 AFL P 分
析中通常是双酶切 ,酶切2连接反应后的产物用 AFL P 特定
的接头引物扩增. 在 AFL P 分析过程中 ,第一次 PCR 扩增称
为预选扩增 (pre2selective amplification) ,即通过引物 3’端选择
性碱基与限制性位点第一个碱基匹配而有选择性的扩增.
AFL P引物设计为 : 核心序列 ( CORE) + 酶特异性序列
( ENZ) + 选择性碱基 ( EXT) . 在预扩增中选择性碱基只有一
个 ,常为 A. 而在接下来的选择性扩增 (selective amplification)
中 ,选择性碱基有 3 个选择性碱基 ANN ,选择性碱基组合成
几对引物分别对预选扩增产物扩增 [1 ] . AFL P 选择性扩增产
物用磁珠富集 ,富集后的产物扩增恢复 ,扩增使用的引物仍
为原引物 (CORE + ENZ + ANN) ,但反应体系中使用的碱基
A 被32 P 放射性标记. 扩增产物用测序胶 ( sequencing gel) 电
泳分离 ,在放射自显影的辅助下 ,将相应大小的显影条带回
收并纯化. 纯化产物再次扩增 ,使用相应的含三个选择性碱
基的引物. 扩增产物用琼脂糖凝胶电泳分离 ,回收适合长度
的片段并纯化 ,而后可用接头引物对 300 bp 左右的纯化产
物进行测序.
Zane[42 ]也提到了用 AFL P 法方法分离微卫星位点 ,其
方法主要是依靠 AFL P 分析过程中高效的酶切 - 连接反应.
与上述 AFL P 法分离微卫星位点有较大差别 ,该方法在预扩
增时使用的 AFL P 引物为接头序列 + N (选择性碱基位点为
兼并性位点) ,之后便是磁珠富集 ,富集产物用相同的引物扩
增恢复 ,接着分离出大小适合的扩增片段克隆 , PCR 法筛选
阳性克隆. 该方法实际上是对基因组 DNA 片段化及扩增的
方法作了改进 ,是建库筛选与纯 AFL P 分离方法的结合.
4 　几种分离技术的比较研究
411 　可行性分析
从 Genebank 获得近缘物种的微卫星位点信息 ,通过适
用性检验以进行微卫星多态性分析是最快捷的方法. 国内外
均有多例报道 ,如密河鳄 ( A lligator mississippensis) 在扬子鳄
( A lligator sinensis) 种群多态性研究中的应用[14 ] ,以及铲鲟
( scaphi rhynchus platorynchus ) 微 卫 星 位 点 在 中 华 鲟
( Acipenser sinensis)遗传分析中的应用均获得了成功 [31 ] . 这
7832 期 　　　　　　　　　　薛 　辉等 :微卫星标记在分子生态学中的应用及其位点的分离策略 　　　　　　　　　　　
一途径在某些濒危物种的遗传保护上起到了重要作用 ,然而
该方法有一定的适用范围 ,若物种的亲缘关系稍远则很可能
难以获得得满意的效果.
运用传统的构建文库法分离微卫星位点时 ,如果微卫星
位点丰度较高则该方法可行. 但由于某些物种基因组内的微
卫星位点丰度很低 [ 9 ,45 ] ,建立大容量的基因组文库并进行
筛选 ,工作量较大且效率极低. 富集文库法提高了工作效率 ,
缩短了筛选时间. James[15 ]在棉 ( Gossypium hirsutum ) 的微
卫星位点的筛选过程中 ,通过严格的杂交和洗脱 ,富集方法
建立的微卫星文库中阳性克隆比率高达 75 %. 随着文库筛
选方法的不断改进与简化 ,构建部分基因组文库筛选微卫星
位点方法将更为常见. Hakki 的 AFL P 法筛选 ,不仅使得酶
切与连接一步完成 ,更可以抛开克隆与筛选工作 ,让筛选工
作的周期大幅缩短. 然而 ,若单纯用 AFL P 方法而不再构建
文库分离微卫星位点 ,则似乎过于倚赖富集的成效. 相比之
下 ,Zane 提出的 AFL P 与建文库结合的方法则相对稳妥 ,故
在目前状况下提高富集效率再建文库筛选这一途径是较适
宜的选择.
412 　经济投入比较
相对而言 ,在上述的几种分离方法中 , PIMA 法较为经
济 ,所需时间也较少. 尤其是该方法中的 PCR 筛选方案正得
到越来越广泛的运用. 从时间与经济投入方面比较 ,传统的
建文库的方法分离需要约 2～3 万元 (人民币) ,所需时间约
1 个月 ; PIMA 法和建富集文库大约都需要 1～3 万元 ,时间
约 2 周 (在技术成熟前提条件下) ; FIASCO 法由于省去了构
建文库与筛选文库的过程 ,故所需时间可能更短 [42 ] . 随着微
卫星分离技术的发展 ,微卫星位点获得较为困难、成本较高
的问题将逐步得到解决 ,届时微卫星标记在分子生态研究领
域中的应用将更为广泛.
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作者简介 　薛 　辉 ,男 ,1980 年生 ,硕士 ,主要从事分子生态
学及保护生物学研究. Tel :055323387236 ; E2mail :xuehui8091
@126. com
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9832 期 　　　　　　　　　　薛 　辉等 :微卫星标记在分子生态学中的应用及其位点的分离策略