全 文 ：长柄石杉与有柄马尾杉内生真菌的分离与初步鉴定
宋育红 1 ， 叶晓慧 2 ，陈作毅 1，2 ， 张杭颖 1，2
（1 三明学院 应用生物技术研究所，福建 三明 365004; 2 福建农林大学 食品科学学院，福建 福州 350002）
摘要：对长柄石杉和有柄马尾杉的内生真菌进行分离与鉴定。 共分离纯化到 17 株真菌，其中从长柄石杉植株内
分离出 12 株真菌，有柄马尾杉植株内纯化分离出 5 株真菌，分别隶属于青霉属、被孢霉属、木霉属、枝氯霉属、生赤壳
属 、曲霉属 、希金氏指行霉 、肉座菌属 、赤霉属 、球座菌属等 10 个属 ，其中长柄石杉与有柄马尾杉二者共有的为青
霉属。
关键词：内生真菌；分离；鉴定；长柄石杉；有柄马尾杉
中图分类号：Q93-331 文献标识码：A 文章编号：1673-4343（2012）06-0085-04
Isolation and Identification of Endophyte Fungi from Huperzia serrata and
Phlegmariurus Petiolatus
SONG Yu-hong1 ,YE Xiao-hui1, CHEN Zuo-yi1,2, ZHANG Hang-ying1
(1. Institute of Applied Biotechnology, Sanming University, Sanming 365004, China;
2. College of Food Science, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350002, China)
Abstract：The endophyte fungi isolated fromHuperzia serrata and Phlegmariurus petiolatus were identified. There were
17 strains of fungi in total to be isolated and pured. Among them, 12 strains of fungi were isolated fromHuperzia serrata, 5
strains of fungi were isolated and pured from Phlegmariurus petiolatus. They were respectively belonging to 10 genera, such
asPenicillium, Mortierella, Trichoderma, Ramichloridium, Bionectria, Aspergillus, Dactylaria, Hypocrea, Gillerella and
Guignardia. Penicillium was the fungi genus which was contained in common inHuperzia serr ta an Phleg ariurus
petiolatus.
Key words: endophyticfungi;isolation;identification;Huperzi serratavar.longipetiolata; Phlegmariuruspetiolatus
石杉科植物为蕨类植物最古老的植物类群之一，现存马尾杉属和石杉属两属约 170 余种，广布
世界各地，我国南北均产 [1]。 1972 年国内首次报道从蛇足石杉中分离得到的石杉碱甲(Hup A)具有松
驰横纹肌作用后， 进一步发现该生物碱是一种高效、 低毒、 可逆并高选择性抑制乙酰胆碱酯酶
(AChE)的药物，可用于治疗重症肌无力、提高学习效率以及改善老年人的记忆功能等，引发了许多
关注 [2]。 石杉植物对生境条件要求高、生长缓慢，石杉碱甲目前几乎全部依赖于石杉科范围内的天然
来源，石杉资源问题显得日益紧迫 [3]。
内生菌是植物微生态系统的天然组成部分 [4]。 由于内生菌长期与宿主共进化, 内生真菌通常会
产生与其宿主植物相同或相似的生理活性物质 [5]，或拥有特殊的代谢途径而产生结构全新的生理活
性物质，为研究与开发微生物制品和微生物药物提供了宝贵的源头线索 [6]。 微生物具有生长周期短、
收稿日期:2012-09-08
基金项目 ：福建省科技厅重点项目 （2010N0027）；福建省自然科学基金项目 （2012J01145）；福建省教育厅科技项目
（JA10263）；福建省高校服务海西重点项目（HX200801）
作者简介：宋育红，女，福建闽侯人，副教授。 研究方向：药用植物生物技术。
2012 年 12 月
第 29 卷 第 6 期
三 明 学 院 学 报
JOURNAL OF SANMING UNIVERSITY
Dec. 2012
Vol.29 No.6
DOI:10.14098/j.cn35-1288/z.2012.06.006
代谢易于控制、菌种易于选育及可通过大规模发酵实现工业化生产的优势，因此内生菌微生物资源
的利用和开发应无来源之忧，因此加速内生菌资源的研究与利用具有重要意义。 有关蕨类植物尤其
是石杉科植物内生真菌的报道较少 [8]。 有研究表明长柄石杉（Huperzia serrata (Thunb. ex Murray) Trev.
var. longipetiolata (spring) H.M.Chang）是石杉科植物在华南地区的广布种，有柄马尾杉（Phlegmariurus
petiolatus）的石杉碱甲(Hup A)含量较高 [3，7]。 本研究对长柄石杉和有柄马尾杉的内生真菌进行了分离
与初步鉴定，为下一步开发利用提供基础。
1 材料与方法
1.1 材料
实验植物为长柄石杉和有柄马尾杉健康的植株，分别采自福建省建宁县和尤溪县。真菌分离与培
养的培养基为马铃薯葡萄糖培养基(PDA)，其中分离培养基中添加链霉素(50 U·mL-1)以抑制细菌生长。
1.2 实验方法
1.2.1 材料处理、表面菌灭活和内生真菌的分离筛选
取新鲜植株用自来水充分冲洗干净，去除叶片和根段。 剪切茎段成约 3～3.5 cm 的小段，75%乙
醇浸泡 1 min，0.1%升汞浸泡 4 min，无菌水洗涤 3 次；75%乙醇再次浸泡 8 min，无菌水洗涤 3～5 次，
将其接种到 PDA 培养基平板上，28 ℃培养一周（在培养期间将表面长菌的茎段弃除）。 一周后，将茎
段切成约 0.75 cm 的小段，分别转接至含有和不含有抗生素的 PDA(Ampr 100 g·mL-1)培养基平板
上，28 ℃培养，观察并用接种针将长出的真菌菌苔在相应的培养基上划线分离，挑取真菌单菌落，最
后对平板上出现异样的菌落或菌苔进行 2、3、4 次纯化分离。
1.2.2 内生真菌的鉴定
根据菌落形态、孢子颜色差异，挑取实验菌株的孢子（或者菌丝段），接种到 PDA 液体培养基中，
28℃摇床 160 r/min 振荡培养 24~48 h；再离心收集菌体，液氮研磨，用 CTAB 法抽提基因组 DNA；然
后 采 用 PCR 仪 扩 增 ITS 基 因 ， 引 物 ITS1：5 -TCCGTAGGTGAACCTGCGG -3′ , ITS4：5 -
TCCTCCGCTTATTGATATGC-3 循环参数为 95℃ 30 s，42℃ 60 s，72℃ 60 s，28 个循环， 反应液总体
积为 20 μL (含 10×Buffer 2μL，引物各 10 pmol，4×dNTP 各 0.2 mmol/L,TaqDNA 聚合酶 2U，基因组
DNA100 ng)，扩增产物约 500 bp 片段，在 1.5 %琼脂糖上电泳。 纯化扩增产物并委托上海申速生物
技术公司测序，所得结果提交 EMBL 数据库比对鉴定。
2 结果与分析
从两种石杉的茎段组织中共分离获得内生真菌 17 株，分别属于 10 个属。 其中从有柄马尾杉中
分离到 5 株，分别属于 3 个属 ，其中青霉属 (Penicillium) 2 株 、被孢霉属 （Mortierella）2 株 、木霉属
（Trichoderma）1 株； 从长柄石杉中分离得到 12 株， 分别属于 8 个属， 其中青霉属 2 株、 生赤壳属
（Bionectria）2 株、曲霉属（Aspergillus）2 株、希金氏指行霉(Dactylaria) 2 株、枝氯霉属 (Ramichloridium)
1 株、肉座菌属（Hypocrea）1 株、赤霉属(Gillerella)1 株和球座菌属(Guignardia)1 株。
两种植物内生菌菌种差异明显，除青霉属 (Penicillium)为两种植物共有分布，占总被测株数的
29.5%外，其余菌种各不相同，这可能与两种植物遗传差异、生长环境（有柄马尾杉中多为石生，长柄
石杉多为土生）[3]、包括石杉碱甲在内的次生代谢物的合成与代谢等生理特点有关，相关证据还需要
进一步实验来发现。
近来的研究表明，几乎所有石杉植物体内均存在内生真菌，不同产地的石杉科植物中的内生真
菌的种类和数量各不相同，且具有丰富的物种多样性（表 1）。其中，本文中被孢霉属、枝氯霉属、生赤
壳属、希金氏指行霉、赤霉属肉座菌属为首次报道。
三明学院学报 第 29 卷86- -
本研究对内生真菌的鉴定采用形态学和 rDNA ITS 序列分析相结合的方法，比常规的形态特征
鉴定法更为精确客观，分离鉴定出其它研究未报道的 6 个石杉内生真菌属菌株，可能与鉴定方法的
改进有一定关系。 有研究表明石杉植物不同部位所分离得到的内生真菌的数目不同，茎部最多，叶
片次之，根部最少 ［14］，且不同部位分离出的内生真菌菌株存在差异 ［10］，本研究仅对两种石杉的茎部
内生真菌进行分离和鉴定，存在于叶片和根部的内生真菌有待作继续的分离鉴定研究。
3 讨论
同种石杉科植物因产地不同，其内生真菌的种类和数量存在差异 [10-14]，本研究的材料之一长柄
表 1 本研究及石杉科植物已报道的内生真菌类群
编号 内生真菌 宿主 样品采集地 参考文献
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枝孢霉属 Cldosporium
顶孢霉属 Acremonium
头孢霉属 Cephalosporium
酵母属 Saccharomyces
束梗孢霉属 Meria
木霉属 *Trichoderma
曲霉属 * Aspergillus
青霉属 * Penicillium
峡筒串孢霉属 Prophytroma
聚孢霉属 Glomerularia
单轴霉属 Plasmopara
交链孢属 Alternaria
球座菌属 Guignardia
间座壳属 Diaporthe
茎点霉属 Phoma
镰刀菌属 Fusarium
轮枝孢属 Verticilliun
组丝核菌属 Phacodium
瓶梗青霉属 Paecilomyces
刺盘孢属 Colletotrichum
伯克霍尔德属 Burkholderia
芽胞菌属 Blastomyces
葡萄孢属 Botrytis
生赤壳属 *Bionectria
希金氏指行霉 * Dactylaria
枝氯霉属 *Ramichloridium
肉座菌属 *Hypocrea
赤霉属 * Gillerella
球座菌属 * Guignardia
被孢霉属 *Mortierella
蛇足石杉
蛇足石杉
蛇足石杉
蛇足石杉
蛇足石杉
有柄马尾杉 *、蛇足石杉
长柄石杉 *
蛇足石杉
有柄马尾杉 *、长柄石杉 *
蛇足石杉
蛇足石杉
蛇足石杉
蛇足石杉
蛇足石杉
蛇足石杉
蛇足石杉
蛇足石杉
蛇足石杉
蛇足石杉
蛇足石杉
蛇足石杉
蛇足石杉
蛇足石杉
柳杉叶马尾杉
柳杉叶马尾杉
长柄石杉 *
长柄石杉 *
长柄石杉 *
长柄石杉 *
长柄石杉 *
有柄马尾杉 *
湖南古丈及八大公山自然保护区
浙江庆元、安徽青阳
浙江庆元、安徽黄山
浙江庆元
浙江庆元
福建尤溪 *、安徽宣城、安徽广德、
江西抚州、安徽黄山
福建建宁 *、安徽宣城、安徽广德、
江西抚州、安徽黄山
福建尤溪 *、福建建宁 *、
安徽青阳，安徽黄山、安徽宣城
安徽宣城、安徽广德、江西抚州
安徽宣城、安徽广德、江西抚州
安徽青阳
安徽黄山
安徽黄山
安徽黄山
安徽黄山
安徽黄山
安徽黄山
安徽黄山
安徽黄山
安徽黄山
江西庐山植物园
福建连城
福建连城
福建建宁 *
福建建宁 *
福建建宁 *
福建建宁 *
福建建宁 *
福建尤溪 *
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注：* 为本研究分离得到
宋育红，等： 长柄石杉与有柄马尾杉内生真菌的分离与初步鉴定第 6 期 87- -
石杉，为亚热带区域分布广、资源储量高的石杉科植物，具有高的研究利用价值，对其扩大内生真菌
分离的数量和种类，并对分离的菌株能否合成石杉碱甲进行鉴定, 以论证长柄石杉内生真菌发酵生
产石杉碱甲的可行性具深远的意义。
自 Stierle[17]首次从短叶红豆杉(Taxus breviflia)中分离得到一株能合成抗癌物质紫杉醇的内生真
菌，表明有的内生菌具有合成和宿主植物相同或相似的活性成分的能力，这一发现为某些药用植物
生长缓慢、资源紧缺带来的药源紧张的问题解决提供了新的思路。 近年来先后从数十种药用植物中
也分离得到了内生菌， 并从这些药用植物内生菌中分离得到了和宿主植物相同或相似的其它活性
成分。 石杉科植物内生菌极为丰富，这也是石杉植物组织培养一直难以成功的原因之一。 近年黎万
奎 [18]、鞠錾 [16]、苏经迁 [19]等陆续报道产石杉碱甲的石杉内生菌筛选与发酵培养工作，在利用共生菌合
成石杉碱方面做了很好的探索， 为利用真菌发酵生产石杉碱甲以缓解蛇足石杉资源压力提供了可
能。 但真正利用内生菌工业化发酵来生产石杉碱甲，并使之成为石杉碱甲的稳定而经济的来源，尚
需进一步实验论证。 本研究分离纯化得到的 17 株真菌中哪些菌株有合成石杉碱甲的能力，需要进
一步的实验支持。
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三明学院学报 第 29 卷88- -