全 文 ：灰白毛莓有效抑菌成分的提取
付　明 , 　　胡　兴 , 　　刘胜贵 , 　　牛友芽
(怀化学院 生物工程系 , 湖南 怀化　418008)
摘　要:采用水蒸气蒸馏法提取灰白毛莓挥发性油 、 乙醇回流法提取黄酮和生物碱 , 再用滤纸片法测定各成分
的抑菌效果.发现灰白毛莓生物碱对 6 种供试菌种均有抑制作用 , 抑菌范围最广 , 抑菌效果最强;灰白毛莓挥发性
油和黄酮分别对 4种和 3 种供试菌种有抑制作用.说明灰白毛莓的有效抑菌成分可能为生物碱类物质.
关键词:灰白毛莓;　抑菌;　有效成分;　生物碱
中图分类号:Q949.95　　　文献标识码:A　　　文章编号:1671-9743 (2007)05-0066-02
收稿日期:2007-03-24
作者简介:付　明 (1966-), 女 , 湖北荆门人 , 怀化学院高级讲师 , 主要研究药用植物的开发与利用.
　　近年来 ,对药用植物的研究范围越来越广泛 ,对植物提
取物抑菌效果的研究越来越多.植物体内发挥抑菌作用的
成分也有许多种 ,如:黄酮类物质具有抗炎 、抗过敏 、抑菌 、
抗病毒 、抗肿瘤 、护肝作用 ,也是一种天然的抗氧化剂 ,具有
清除人体中超氧阴离子自由基(O-2 ·)、增强机体免疫力等
生理活性[ 1] .生物碱是许多药用植物的有效成分[ 2] ,具有
抗肿瘤 、抑菌活性 ,并且毒性低 、成本低 ,因此引起了普遍关
注 ,目前运用于临床的生物碱药品已达 80多种[ 3] .许多植
物挥发性油对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌具有很强的抑制
作用[ 4].
灰白毛莓(Rubus tephrodes Hance)属蔷薇科悬钩子属植
物 ,该类植物具有作为果树种质资源 、药用植物 、色素和香
味成分的利用潜力 ,可治疗阳痿早泄 、肾虚尿频 ,有活血散
瘀 、止血 、清热解毒等功效[ 5] .灰白毛莓全株可入药 ,其中
叶具有广谱抗菌作用 ,可治疗外伤出血 、痈疖疮疡 ,具有止
血 、解毒 、祛腐生肌 、收敛止痛等药理作用 ,能有效控制疮面
感染[ 6] ;根祛风除湿 、活血调经 ,主治风湿疼痛 、慢性肝炎 、
月经不调 、痢疾 、跌打损伤;种子入药为强壮剂.我们曾对
灰白毛莓和苍耳的抑菌作用进行过比较研究[ 7] ,发现灰白
毛莓有较强的抑菌作用 ,但其有效抑菌成分还未见报道.
为了探讨灰白毛莓的有效抑菌成分 ,我们分别提取了灰白
毛莓的挥发性油 、黄酮和生物碱类物质 ,并且以 6种供试菌
种进行了抑菌实验 ,比较了它们的抑菌效果.
1　材料
1.1　实验仪器和试剂
回流提取装置 、抽滤装置 、电热恒温水浴锅 、电热鼓风
干燥箱 、天平 、高速离心机 、分光光度计 、植物粉碎机 、细菌
过滤器 、恒温振荡培养箱(DHP-2000型 ,天津市华北实验
有限公司)、水平层流净化工作台(苏州洁净技术研究所制
造)、立式压力蒸汽灭菌器(YXQ-LS-50S1 ,上海博迅实业
有限公司医疗设备厂)、摇床(ZHWY200B ,上海智城分析仪
器制造有限公司)、细菌培养箱等
芦丁(中国药品生物制品检定所 ,标号 080-9303)、蛋
白胨(生化试剂 ,上海东海制药厂出品)、琼脂粉(生化试剂 ,
北京奥博星生物技术责任有限公司)、酵母粉(生化试剂 ,北
京奥博星生物技术责任有限公司)、石油醚 、活性炭 、正丁
醇 、三氯化铝 、亚硝酸 、镁粉 、三氯化铁等 ,药品均为分析纯.
1.2　供试菌种
金 黄 色 葡 萄 球 菌 (Staphylococcus aureus CCTCC
AB91053)、大肠埃希氏菌(Escherichia coli CVCC249)、产气肠
杆菌 (Enterobacter aerogenes)、鸡沙门 氏菌 (Salmonella
gallinarum)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、普通变
形杆菌(Proteus vulgaris CCTCC AB91103)均由怀化学院微生
物学实验室提供.
1.3　实验样品
实验所用灰白毛莓样品于 2005年 7月采自湖南省怀化
市.
1.4　培养基
LB(Luria-Bertani)液体培养基:蛋白胨 10 g ,NaCl 5 g ,
酵母粉 5 g ,用 1 mol L NaOH 调 pH 7.0 ,重蒸水定容至1 000
ml.LB固体培养基:在液体培养基中加 1.6%的琼脂粉 ,煮
沸溶化后定容.
2　方法
2.1　灰白毛莓化学成分的提取
2.1.1　挥发性油的提取
挥发性油的提取采取水蒸气蒸馏法.具体操作:将采
摘来的材料清净 、晾干水分 ,剪成 2 ～ 3 cm长小段 ,称取 400
g样品装入挥发油提取器内 ,加2 500 ml 蒸馏水加热回流 ,
从流出第一滴油开始计时 ,蒸馏 3 h.共做 5份.从提取器
中取出淡黄色 、具有香味的挥发性油 ,用细菌过滤器过滤后
保存.
2.1.2　黄酮物质的提取
黄酮类物质采用乙醇—水体系 ,用回流装置进行灰白
毛莓粗黄酮的提取.具体操作步骤为:将采摘来的材料清
净 、晾干 ,于 60 ℃下烘至八成干 ,剪成 2 ～ 3 cm长小段后再
粉碎.称取样品干粉 100 g ,用索氏提取法(乙醚作抽提剂 ,
45 ℃水浴)脱脂和脂溶性色素 ,反复几次 ,至乙醚抽提液无
色时挥干乙醚[ 8] .将除脂后的样品装入回流提取装置中 ,
加 70%的乙醇(固液比为 1∶30)于 75 ℃恒温水浴锅中回流
提取 3 h[ 9] ,过滤.将滤渣再回流两次 ,每次 3 h.合并三次
滤液 ,浓缩.以石油醚脱脂 ,弃上层石油醚;活性炭去色素 ,
过滤.将滤液于3 500 r min 连续离心数次 ,每次 20 min ,直
到离心管底部无沉淀 ,上清液即为黄酮提取液.将黄酮提取
液减压浓缩至 10 ml ,将所得液体用细菌过滤器过滤后密封
第 26 卷第 5期　　 　 　　　　　　怀化学院学报　　 　 　　　　　　Vol.26.No.5
2 0 0 7 年 5 月　 　 　 　 　JOURNAL OF HUAIHUA UNIVERSITY 　 　 　 　 　 　May., 2007
保存于冰箱中.按照应国清等的方法[ 10] 以芦丁为标准样
品测定灰白毛莓黄酮的含量.以芦丁为标样制作标准曲
线 ,用最小二乘法作线性回归 ,得芦丁浓度Y与吸光度A的
关系曲线的回归方程式为:Y =0.0721A +0.0005(R2 =
0.9996).
2.1.3　生物碱的提取
准确称取灰白毛莓干燥粉末 400 g ,加 95%乙醇2 000ml
置5 000 ml圆底烧瓶中 80 ℃回流提取 4 h ,倒出乙醇提取
液 ,重新加入 95%乙醇2 000 ml继续提取 3 h.合并两次提
取液 ,过滤 ,转移至2 000 ml圆底烧瓶中 ,用旋转蒸发器 50
℃减压回收溶剂 ,直到浓缩液无明显乙醇味 ,加适量 5%HCl
于浓缩液中调 pH 至 3 ,搅拌 、溶解 ,静置过夜 ,析出不溶于
酸的树脂和油脂 ,过滤.上清液用等量石油醚萃取 3次 ,除
脂溶性杂质 ,再用等量乙醚萃取除酸性和中性杂质 ,将酸性
水母液加浓氨水调 pH至 10 ,用氯仿萃取 5次 ,减压回收氯
仿 ,干燥后称重得脂溶性生物碱 ,用细菌过滤器过滤后保存
.
2.2　菌液的制备
取 6种供试菌的斜面菌种 ,采用平板划线法接种到 LB
固体培养基平板上 ,35 ℃下培养 ,使菌种活化.分别挑取每
种菌种的 3 ～ 5个菌落接种于 LB液体培养基内于 35 ℃下
培养 5 h.然后对照麦氏比浊管用生理盐水稀释至菌悬液浓
度约 106 cfu ml[ 11].
2.3　滤纸片法测定抑菌效果
取直径为 6 mm的圆形滤纸片 180片于 121 ℃下湿热灭
菌备用.将其中的 162 片分成三组 ,分别放入灰白毛莓的
挥发性油 、黄酮 、生物碱提取液中浸泡 5min制成药敏纸片.
将制备好的菌悬液各取 0.1 ml于 15 min内涂布在固体培养
基上 ,制成含菌平板.接种好的平板可敞开盖子倒置在室
温下干燥 3 ～ 5 min ,然后在 15 min 之内将药敏纸片贴在平
板上 ,使纸片与培养基表面完全接触并轻压 ,纸片贴上后不
再移动.每皿贴 3片 ,每菌做 3份平行.另外 ,每个菌种用
已灭菌的滤纸片做一份空白对照.纸片贴好后 , 15 min内
将平板倒置放入 35 ℃±2 ℃孵箱 ,16～ 18 h后读取结果[ 11]
.
3　结果与讨论
3.1　灰白毛莓有关化学成分的含量
经测定得知 ,灰白毛莓中挥发性油的含量为 0.03%,黄
酮的含量为 0.23%,生物碱的含量为 0.28%,生物碱的含量
高于黄酮含量.
3.2　灰白毛莓各成分的抑菌作用
对 2.3所做的试验进行抑菌圈大小的测量 ,比较灰白
毛莓 3种成分的抑菌效果 ,结果见表 1.
从表 1得知:灰白毛莓生物碱对 6 种供试菌种均有抑
制作用 ,抑菌范围最广;灰白毛莓黄酮只对 3种供试菌种有
抑制作用 ,对产气肠杆菌 、铜绿假单胞菌 、普通变形杆菌无
抑制作用 ,抑菌范围最窄;灰白毛莓挥发性油对 4种供菌种
有抑制作用 ,对产气肠杆菌 、普通变形杆菌均无抑制作用.
表 1　灰白毛莓各成分的抑菌效果
供试菌种 抑菌圈大小(直径:mm)挥发性油 黄酮 生物碱
金黄色葡萄球菌 13 8.1 15
大肠埃希氏菌 6.2 7.3 13
产气肠杆菌 6.0 6.0 12
鸡沙门氏菌 9.0 7.5 10
铜绿假单胞菌 8.0 6.0 10
普通变形杆菌 6.0 6.0 9.0
　　本次试验所用的材料是灰白毛莓茎叶 ,提取的生物碱 、
黄酮 、挥发性油都来自其茎叶 ,因此提取物的抑菌范围应与
文献[ 7] 报道的灰白毛莓茎叶的抑菌范围一致 ,符合要求的
是生物碱类物质.而且生物碱的含量高于黄酮的含量 ,由
此说明灰白毛莓的有效抑菌成分可能是生物碱类物质 ,其
结构还有待于进一步的鉴定和探讨.
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A3.
Extraction of Effective Inhibitor Component of Rubus Tephrodes Hance
FU Ming , 　HU Xing , 　LIU Sheng-gui , 　NIU You-ya
(Department of Bioengineering , Huaihua University , Huaihua , Hunan 418008)
Abstract:To extract the essential oil in the way of vapor distillation and extract flavone and alkaloid in the way of ethanol
refluxing from Rubus Tephrodes Hance and then mensurate inhibitory activity of each component in the way of filter paper method.
We found that alkaloid of Rubus TephrodesHance had inhibitory effect on all six kinds of bacterium.The extension of inhibit was the
widest and inhibitory effect was the strongest.The essential oil of Rubus Tephrodes Hance and alkaloid respectively had inhibitory
effect on six and three kinds of bacterium.The result showed that the effective inhibitor component of Rubus Tephrodes Hance
probably was alkaloid substance.
Key words:Rubus Tephrodes Hance;　inhibitory activity;　effective component;　alkaloid
·67·第 26 卷第 5 期　　　　　　　付 明 ,胡 兴 , 刘胜贵 ,牛友芽:灰白毛莓有效抑菌成分的提取