全 文 ：苏州大学学报(医学版)2011;31(5) 743
收稿日期:2011 － 05 － 26
作者简介:任丽洁(1983 －) ，女，江苏苏州人，助理实验师，理学硕士，研究方向为血栓与止血。通讯作者:朱 力、吴开云
毛葡萄叶水提物抑制血小板聚集的初步研究
任丽洁1，杨 飞1，张灿灿2，米 辰2，杨 林2，朱 力1，吴开云2
(1．苏州大学唐仲英血液中心，2．苏州大学医学部基础医学与生物科学学院 解剖学与组织胚胎学系，江苏苏州 215123)
摘要:目的 探讨毛葡萄叶水提物(Gx)对血小板聚集的影响。方法 分离健康人的血小板，与不同生药浓度
的 Gx于 37 ℃孵育 10 min后，检测胶原(collagen)和凝血酶(thrombin)诱导的人血小板聚集的变化。小鼠腹腔注射
Gx后，分离小鼠血小板，检测二磷酸腺苷(ADP)诱导的血小板聚集的变化。结果 Gx对 2 μg /ml collagen诱导的血
小板聚集有显著抑制作用(P ＜ 0． 05) ，且呈现 Gx 的剂量依赖性(P ＜ 0． 05) ;只有 0． 01 mg /ml 的 Gx 对 0． 1 U /ml
thrombin诱导的血小板聚集有抑制作用，且不呈现 Gx的剂量依赖性。同时，Gx可抑制 ADP诱导的腹腔注射 Gx 的
小鼠血小板聚集，且呈现 ADP剂量依赖性。结论 Gx具有明显抗血小板聚集作用，为开发抗血栓药物提供了实验
依据。
关键词:毛葡萄叶水提物;血小板聚集;胶原;凝血酶;二磷酸腺苷
中图分类号:R282． 71 文献标识码:A 文章编号:1673 － 0399(2011)05 － 0743 － 04
Preliminary Study on Effects of Extracts of Vitis Quinquangularis Rehd
Leaves on Inhibition of Platelet Aggregation
REN Li-jie1，YANG Fei1，ZHANG Can-can2，MI Chen2，YANG Lin2，ZHU Li1，WU Kai-yun2
(1． Cyrus Tang Hematology Center，2． Dept of Anatomy and Embryology，School of Biology and Basic
Medical Sciences，Medical college，Soochow University，Jiangsu Suzhou 215123，China)
Abstract:Objective To study the effect of extract of Vitis quinquangularis Rehd leaves(Gx)on
platelet aggregation．Methods Isolated healthy human platelets were incubated with Gx at different con-
centration for 10 minutes at 37 ℃，and were stimulated with collagen and thrombin，then platelet aggrega-
tion was performed． After intraperitoneal injection of Gx，isolated mouse platelets were stimulated with
ADP to examine the change of platelet aggregation． Results Human platelet aggregation incuced by 2
μg /ml collagen was dose-dependently inhibited by Gx(P ＜ 0． 05) ;but only 0． 01 g /ml Gx was able to in-
hibit human platelet aggregation induced by 0． 1 U /ml thrombin，in a Gx dose-undependent way． And Gx
was able to inhibit platelet aggregation induced by ADP in the intraperitoneally injected mice． Conclusion
Gx can obviously inhibit platelet aggregation，and it can provide a experimental basis for development of
antithrombotic drugs．
Key words:extract of Vitis quinquangularis Rehd leaves;platelet aggregation;collagen;thrombin;ADP
毛葡萄(Vitis quinquangularis Rehd)是葡萄科蛇
葡萄属，为木质藤本植物，味酸、微苦;性平，根皮和
叶可被用于药，有调经活血、舒筋活络作用，外用治
跌打损伤、筋骨疼痛、外伤出血等。蛇葡萄属植物
主要含有黄酮类、酚酸类、低聚芪类化合物、甾醇
类、挥发油等化学成分。有文献报道毛葡萄类植物
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有降血压、降血糖和降血脂作用［1］，但尚未有文献
报道毛葡萄具有抗血小板聚集的作用。在我们的
前期工作中已证实毛葡萄叶水提物(extract of Vitis
quinquangularis Rehd leaves，Gx)有抗血栓形成的作
用［2，3］，但其机制还不清楚，为此，我们利用现代中
药提取技术，提取 Gx 用于实验，观察其对血小板聚
集的影响，探讨 Gx 抗血栓形成的可能机制，为进一
步开发其植物抗血栓药物打下基础。
1 材料与方法
1． 1 试剂
二磷酸腺苷(ADP) ，购自 CHRONO-LOG 公司，
批号:3407。ADP试剂的准备:2． 5 mg 的 ADP，加入
5 ml生理盐水，所获得的储存浓度为 1 mmol /L。胶
原(collagen) (皮) ，购自 CHRONO-LOG 公司，批号:
3405。collagen原液浓度为 1 mg /ml，本实验所使用
浓度为 2 μg /ml。凝血酶(thrombin) ，购自 CHRO-
NO-LOG 公司，批号:3406。Thrombin 试剂的准备:
10 U的凝血酶，加入 1 ml生理盐水获得的储存浓度
为 10 U /ml。
1． 2 实验动物
ICR小鼠，SPF级，雄性，体质量 30 ～ 35 g，由苏
州大学实验动物中心提供，使用许可证号为:SYXK
(苏)2007-0035。
1． 3 方法
1． 3． 1 Gx的制备 取 500 g 干毛葡萄叶(来源:江
西，苏州大学生药研究所鉴定) ，浸泡于水中，加热
提取 3 次，每次 45 min，合并提取液用蒸发浓缩至
1 000 ml，再用终浓度为 50%乙醇沉去杂质，过滤后
用旋转蒸发除去乙醇，浓缩后的溶液经冷冻干燥后
得到粉末状提取物 150 g(批号为:KXSH-T1) ，主要
成分含黄酮 25% 还含有酚类、氨基酸等，实验时配
成 30%(约含生药 1 g /ml)。
1． 3． 2 分离人的洗涤血小板［4］ 采健康人的血，
以 1∶ 5的比例以 ACD(65 mmol /L 柠檬酸三钠，70
mmol /L柠檬酸，100 mmol /L葡萄糖，pH 4． 4)抗凝，
150 g 离心 20 min 获得富含血小板的血浆(Platelet
Rich Plasma，PRP)。PRP以 340 g 转速离心 15 min
得到血小板沉淀。血小板沉淀再用含有血小板活
化抑制剂 PGE1(1 μmol /L)和 apyrase(1 U /ml)的
HEN缓冲液(150 mmol /L NaCl，1 mmol /L NaEDTA，
10 mmol /L HEPES ，pH 6． 5)洗涤一次，最后重悬于
Tyrodes buffer (137 mmol /L 氯化钠，20 mmol /L
Hepes，5． 6 mmol /L葡萄糖，1 g /L BSA，1 mmol /L氯
化镁，2． 7 mmol /L氯化钾，3． 3 mmol /L磷酸二氢钠，
pH 7． 4)里，计数，血小板浓度调为 2 × 108 个 /ml。
1． 3． 3 分离小鼠血小板［4，5］ 取小鼠 6 只，体质量
30 ～ 35g，随机分为两组:空白对照组和毛葡萄叶水
提物组。毛葡萄叶水提物组以 2． 8g /kg 鼠腹腔注射
给药(按生药量计算) ，给药 1 h 后，以 3． 8%的柠檬
酸钠为抗凝剂，从麻醉的小鼠的下腔静脉采血，150
g离心 10 min 得到 PRP。空白对照组给等量生理
盐水。
1． 3． 4 血小板聚集［3 － 5］ 取 250 μl 人的洗涤血小
板于血小板聚集仪(CHRONO-LOG)专用的比色杯
(CHRONO-LOG，型号 P /N312)中，加入 2． 5 μl Gx
或等量生理盐水，37 ℃孵育 10 min，然后加入刺激
剂 collagen(终浓度 2 μg /ml)和 thrombin(终浓度 0．
1 U /ml) ，在搅拌小棒搅拌的条件下刺激 4 min。同
样，取小鼠 PRP，加入不同浓度的刺激剂 ADP刺激 4
min。
1． 4 统计学处理
数据采用 GraphPad Prism 5． 01 处理。以 x ± s
表示，组间比较采用 t 检验。P ＜ 0． 05 表示差异有
统计学意义。
2 结果
2． 1 Gx对 collagen诱导的人血小板聚集的影响
Gx 对 2μg /ml collagen 诱导的血小板聚集有显
著抑制作用，而且呈现 Gx 的剂量依赖性(P ＜
0． 05)。生药浓度为 0． 0001g /ml 和 0． 001g /ml 的
Gx都能部分抑制 collagen 诱导的人血小板聚集(P
＜0． 05) ，分别从(6． 0 ± 5)%到(15 ± 2)%，n = 3;从
(60 ± 5)%到(12 ± 2)%，n = 3。而生药浓度为 0． 01
g /ml的 Gx 能完全抑制血小板聚集(P ＜ 0． 05) ，从
(60 ± 5)%到(2 ± 2)%，n = 3。见图 1。
2． 2 Gx对 thrombin诱导的人血小板聚集的影响
0． 1 U /ml 的 thrombin 刺激血小板产生的聚集
率为(90 ± 5)%，而生药浓度为 0． 01 g /ml 的 Gx 孵
育血小板 10 min 后，thrombin 刺激产生的聚集下降
为(2 ± 1)%(P ＜ 0． 05)。而降低 Gx 的生药浓度
后，其对 thrombin 诱导的血小板聚集的抑制作用消
失，提示 Gx 对 thrombin 诱导的血小板聚集抑制并
不呈现 Gx的剂量依赖性。见图 2。
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①空白对照组;②Gx生药浓度 0． 01g /ml;③Gx生药浓度
0． 001g /ml;④Gx生药浓度 0． 0001g /ml
图 1 Gx对 collagen诱导的人血小板聚集的影响
①空白对照组;②Gx生药浓度 0． 01 g /ml;③Gx生药浓
度 0． 001 g /ml;④Gx生药浓度 0． 000 1 g /ml
图 2 Gx对 thrombin诱导的人血小板聚集的影响
2． 3 Gx经小鼠腹腔注射后对 ADP 诱导的血小板
聚集的影响
Gx对不同浓度的 ADP诱导的小鼠血小板聚集
有明显抑制作用，且随着 ADP 浓度的升高，Gx 对血
小板聚集的抑制效应逐渐减弱，即呈 ADP的剂量依
赖性，见图 3。
3 讨论
我国传统的一些活血化瘀中草药(如丹参等)
已证实对血栓性疾病有预防和治疗作用，毛葡萄是
葡萄科蛇葡萄属，主要含有黄酮类、酚酸类、低聚芪
类化合物、甾醇类、挥发油等化学成分。我们实验
室的前期工作证实毛葡萄具有抗血栓形成作用，其
机制之一可能与降低血浆血栓素 B2(thromboxane
B2，TXB2)和升高 6 酮 前列腺素 F1α(6-keto-
PGF1α)水平有关［2，3］。血栓素 A2(thromboxane A2，
TXA2)和前列环素(prostacyclin，PGI2)是细胞膜释
放的花生四烯酸代谢的主要产物，TXA2主要在血小
板生成，其引起微血管收缩、血小板凝聚、血栓形成
和止血。而 PGI2主要在血管壁生成，作用与 TXA2
相反呈强力扩张微血管，抗血小板凝聚，防止血栓
形成，正常生理状态下，完整无损的血管内皮细胞
具有抑制血小板在其表面粘附聚集和活化、抗血栓
功能，在循环血液中 TXA2和 PGI2的浓度处于相对
平衡状态，二者在体内形成一种精巧的分子调节机
制，对血管舒缩，血小板聚集及血栓形成起着重要
的调节作用［7］。因此，本文着重观察了 Gx 的抗血
小板聚集作用。
①空白对照组;②:Gx组 曲线①、②、③为 Gx 组，分别代表 A 使用浓
度为 10 μmol /L、15 μmol /L、20 μmol /L
图 3 ADP诱导的血小板聚集呈 ADP的剂量依赖性
人洗涤血小板在诱导剂刺激的情况下能发生
聚集反应。其中胶原蛋白 collagen 通过糖蛋白(gly-
coprotein，GP)Ⅵ信号通路影响血小板的聚集反
应［8］。我们研究发现，在体外，Gx 对 2 μg /ml colla-
gen 诱导的人血小板聚集有显著抑制作用(P ＜
0． 05) ，而且呈现 Gx 剂量依赖性。血管损伤时，胶
原蛋白与血小板 GPⅥ的结合导致 GPⅥ的聚集和
FcRγ的免疫受体酪氨酸激活序列(immunoreceptor
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tyrosin-based activation motif，ITAM)区域的酪氨酸被
Lyn和 Fyn磷酸化，从而与 Syk相结合导致 Syk的酪
氨酸磷酸化。这又导致了活化的 T 细胞连接子
(linker of activated T cells，LAT)的酪氨酸磷酸化，而
LAT酪氨酸磷酸化使包括 SLP-76 和 Gads在内的信
号蛋白复合体聚集，进一步募集和激活磷脂酶 Cγ2
(phospholipase C，PLCγ2)。磷脂酰肌醇 3 激酶
(phosphatidylinositol-3-kinase ，PI3K)也可被募集到
LAT 上，并通过产生磷脂酰肌醇磷酸 3(phosphati-
dylinositol-3-phosphate，PIP3)来影响 PLCγ2 的募集
和激活。PLCγ2 能够分解磷脂酰肌醇二磷酸(phos-
phatidylinositol bisphosphate，PIP2)产生肌醇三磷酸
(inositol triphosphate，IP3)和甘油二酯(diglyceride，
DAG) ，分别导致钙离子动员和蛋白激酶 C(protein
kinase C，PKC)的激活，两者都能导致血小板的分泌
和聚集［8］。目前，Gx 如何影响 GPVI 通路还不清
楚。进一步研究 Gx 对钙动员、PLCγ2 磷酸化、Syk
磷酸化和 FcRγ磷酸化的影响，寻找 Gx 在血小板活
化中的作用靶点和方式有助于确定 Gx 对血小板的
影响机制，并为进一步的开发和应用提供实验依据。
诱导剂 thrombin是一种非常强烈的血小板刺激
剂，血小板对 thrombin 的反应是通过 G 蛋白偶联受
体(G-protein-coupled receptors，GPCRs)的蛋白酶激
活受体(protease-activated receptors，PAR)家族成员
调节的。在洗涤血小板的聚集反应中，thrombin 的
使用浓度一般为 0． 1 U /ml 到 0． 5 U /ml，在本实验
中我们使用的 thrombin浓度为 0． 1 U /ml，来验证不
同生药浓度的 Gx 对 thrombin 诱导的人洗涤血小板
聚集是否产生影响。研究结果显示，生药浓度为 0．
01 g /ml 的 Gx 孵育血小板 10 min 后，能显著抑制
thrombin诱导的聚集，聚集率由(90 ± 5)%下降为(2
± 1)%(P ＜ 0． 05)。而降低 Gx 的生药浓度后，其
对 thrombin 诱导的血小板聚集的抑制作用消失，也
就是说 Gx对 thrombin诱导的血小板聚集抑制并不
呈现 Gx的剂量依赖性。
上述体外实验已证明 Gx 抑制 collagen 和
thrombin诱导的血小板聚集。为了测试 Gx 体内急
性给药后是否会对血小板聚集有影响，我们在小鼠
腹腔注射 1 h Gx(2． 8 g /kg)1 h后，提取小鼠 PRP做
血小板聚集实验，结果显示，Gx 对 ADP 诱导的血小
板聚集有抑制作用，而且呈 ADP的剂量依赖性。以
上实验证实 Gx 对血小板聚集有明显抑制作用，这
与我们实验室以前的结果是一致的，为开发毛葡萄
植物抗血栓药物进一步提供了实验依据和奠定了
较好的基础。
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［责任编辑:肖丽娟］