全 文 ：蝙蝠葛酚性碱对血栓形成和血小板聚集的影响
孔祥英 , 龚培力*
(华中科技大学 同济医学院 药理系 , 湖北 武汉 430030)
摘要:目的　观察蝙蝠葛酚性碱(PAMD)对血栓形成 、血小板聚集的影响并研究其作用机制。方法　用动静脉
短路血栓形成模型观察血栓形成;比浊法测定血小板聚集度;电镜技术观察血小板超微结构变化;放射免疫法测定
TXB
2
和 6-酮基-PGF
1α的水平;硝酸还原酶法测定兔血浆 NO浓度。结果　PAMD体内给药可剂量依赖性地抑制血栓
形成及由 ADP, AA和 THR诱导的大鼠和兔的血小板的聚集;可显著抑制血小板超微结构的变化;能明显升高兔血
管壁 6-酮基-PGF1α产生量 , 对血小板释放的 TXB2无明显影响;还可提高兔血浆 NO的浓度。结论　PAMD具抗血栓
形成和抗血小板聚集的作用 ,其机制与增加血管壁 PG I2含量 ,提高兔血浆 NO的浓度有关。
关键词:蝙蝠葛酚性碱;血栓形成;血小板聚集;超微结构;血栓素;前列环素;一氧化氮
中图分类号:R282. 71;R973. 2　　　文献标识码:A　　　文章编号:0513 -4870(2005)10 - 0916 - 04
收稿日期:2004-11-22.
*通讯作者　Tel:86 - 10 - 65126586,
E-m ai l:kongu0051@ hotm ai.l com
E ffect of phenolic alkaloids ofMenispermum dauricum on thrombosis
and p latelet aggregation
KONG X iang-ying, GONG Pei-li*
(Departm ent of Pharmacology, Tong jiMed ical College of Huazhong University of Science and Technology , Wuhan 430030 , Ch ina)
Abstract:Ami 　To observe the effect of pheno lic a lkaloids o fMenispermum dauricum (PAMD) on
th rombosis and plate let agg regation, and to exp lore its mechanism of ac tion. M ethods　Th rombosis w as
obse rved w ith arteriovenous shunt th rombus mode l in rat;plate let agg regation w as de te rm ined by Bo rn’ s
me thod;u ltrastructure of p latele tw as obse rved by transm ission electronm icroscope;TXB2 o r 6-ke to-PGF1α
levels w ere assessed by radio immunoassay; and NO was de te rm ined by co lo rimetric method. Results
PAMD dose-dependently inhibited expe rimental thrombus fo rmation, pla te let aggregation induced by ADP,
AA and THR in vivo and u ltrastructu re changes stimu lated by THR;PAMD increased the generation o f
6-keto-PGF1α in thorac ic ao rtae and NO level in p lasm a; and had no inf luence on TXB2 release
(P >0.05). Conc lusion　PAMD inhibited th rombosis and pla telet aggrega tion, and itsmechanism m igh t
be due to the increase of PG I2 and NO leve.l
Key words: phenolic a lkalo ids of Menispermum dauricum; th rombosis; p latele t agg regation;
ultrastructure;TXB2;PG I2;nitric oxide
　　蝙蝠葛酚性碱(pheno lic alka lo ids ofMenispermum
dauricum , PAMD)是从蝙蝠葛根茎中分离出的双苄
基异喹啉类生物碱 ,主要包括蝙蝠葛碱 (dauricine,
Dau)和蝙蝠葛苏林碱 (dauriso line, DS)等多种生物
碱 。以往研究表明 Dau具有抗心肌缺血 、抗动脉粥
样硬化 、抗心律失常和抗血小板聚集等作用 ,并具钙
拮抗作用。 PAMD在生药中含量比单一的蝙蝠葛碱
高 ,提取工艺简单 ,成本低 ,具有较大的开发应用前
景。本研究通过体内外给药观察 PAMD对实验性
血栓形成 、血小板聚集和血小板超微结构的影响 ,并
测定其对血栓素-前列环素系统 、一氧化氮 (nitric
oxide, NO)等诸方面的作用 ,进一步探讨其可能的作
用机制。
材料与方法
药品与主要试剂 　PAMD 本室提取 , 批号
2001205,其提取过程大致如下:北豆根粗粉用稀硫
916 药学学报 Ac ta Pharm aceutica S inica 2005, 40(10):916 -919
DOI牶牨牥牣牨牰牬牫牳牤j牣牥牭牨牫牠牬牳牱牥牣牪牥牥牭牣牨牥牣牥牨牨
酸溶液渗漉 ,调 pH值至 8.5,沉淀为北豆根总生物
碱 。再用乙醇回流提取 、浓缩 、过滤 、水洗至中性 、干
燥 ,即得蝙蝠葛酚性碱 。采用非水滴定法测定蝙蝠
葛酚性碱纯度 (大于 95%),其中主要成分 D au占
45%以上 , DS含量为 5%。阿司匹林 (aspirin, A sp)
由吉林恒和制药公司提供 ,批号 2001070876。
二磷酸腺苷 (ADP)、凝血酶 (THR)、花生四烯
酸 (AA)和消炎痛为 S igm a公司产品 。 TXB2和 6-酮
基-PGF1α放射免疫试剂盒是中国人民解放军总医院
科技开发中心放射免疫研究所产品 。 K rebs氏液
(mmo l L - 1 ):NaC l 118, KC l 2.8 , NaHCO3 25,
KH2 PO 4 1.2, MgSO 4 1.2, CaC l2 2.5, g lucose 5.5 (pH
7.4)。NO检测试剂盒为南京建成生物工程研究所
产品。
血栓形成试验　雄性 SD大鼠 50只 ,随机分为
5组:Asp组 (60 mg kg- 1), PAMD低 、中 、高剂量组
(7.5, 15和 30 mg kg- 1)及生理盐水 (NS)组 ,每组
各 10只 ,灌胃给药 , 3次 /d,连续 3 d。末次给药后
1 h,动-静脉短路血栓形成模型制备方法见文献
[ 1] 。血栓湿重由总重量减去丝线重量表示 ,计算
血栓形成抑制率 。
体内血小板聚集试验　大鼠分组及药物处理同
前;雄性日本大耳白兔 50只 ,随机分为 5组:A sp组
(30mg kg- 1), PAMD低 、中 、高剂量组(4, 8和 16
mg kg -1)及生理盐水 (NS)组 ,每组 10只 ,灌胃给
药 , 3次 /d,连续 3 d。术前 1 h追加 1次。常规方法
制备富血小板血浆 (p late le t-rich plasma, PRP)和贫
血小板血浆 (p late le t-poo r p lasma PPP),调整大鼠和
兔 PRP血小板数分别为 6×108 ～ 7 ×108 mL -1和
4×108 ～ 5 ×108 mL - 1 ,每次取 PRP 200 μL,分别
加入不同浓度的药物或生理盐水 , 37 ℃温育 5 m in,
然后加入不同的诱聚剂 ADP(终浓度为 5 μmo l
L
- 1), AA(终浓度为 0.33 mmo l L- 1)和 THR(终浓
度为 200 U L - 1),按 Born比浊法测定血小板聚集
率 [ 2] ,计算血小板聚集抑制率。并留取血浆测定
NO浓度 。
血小板超微结构的观察　雄性日本大耳白兔 6
只 ,心脏穿刺采血 ,制备 PRP。分别于 37 ℃与药物
温育 15m in,然后以诱导剂 THR(终浓度为 200 U
L
- 1)诱导血小板活化 ,作用 30 s后立即加入 0.1%
戊二醛停止反应 ,经 2 000 r m in-1离心 10 m in,弃
上清液 ,将所取标本经 2.5%戊二醛及 1%四氧化锇
先后固定 ,包埋 ,铅 、铀双染后 EM10C透射电镜观察
血小板超微结构变化 。
血小板内 TXB2的测定　取兔 PRP 200 μL分
别加入药物或生理盐水 , 37℃温育 5m in后 ,再加入
THR 200 U L -1诱导血小板聚集 , 5 m in后立即加
入终浓度为 10 μmol L -1的消炎痛终止反应。取
一定量的 PRP不加诱聚剂 ,直接加入终浓度为 10
μmo l L -1的消炎痛终止反应 ,以了解血小板自发
性释放 TXB2的含量。聚集后的 PRP及未加诱聚剂
的 PRP以 2 000 r m in-1同时离心 10 m in,取上清
液于 -20 ℃保存 ,以放射免疫方法测定 TXB2的含
量。
胸主动脉环 6-酮基-PGF1α含量的测定　击昏
兔后立即颈动脉放血 ,迅速开胸取胸主动脉 ,放入
95% O2 +5% CO 2的混合气体饱和的 K rebs氏液中 ,
除去周围血管结缔组织 ,剪成 3 ～ 5 mm的血管环 ,
平衡 1 h后 ,分别与 NS , A sp (100 μmo l L -1 )和
PAMD (1, 10和 100 μmo l L- 1), 37 ℃温育 30
m in。取出血管环用 K rebs氏液洗涤两次 ,再放入含
THR终浓度为 200 U L- 1的 K rebs氏液中 , 37 ℃温
育 30m in。取出血管环用滤纸吸干后称重 ,孵育液
在室温下放置 2 h后 , -20℃保存 ,以放射免疫方法
测定 6-酮基-PGF1α的含量 。
数据统计学处理　实验数据以 –x ±s表示 ,采用
student t检验进行统计处理 。
结果
1　PAMD对大鼠血栓形成的影响
PAMD 7.5, 15和 30 mg kg -1分别给药后 ,
PAMD各剂量组与对照组相比 ,呈剂量依赖性明显
降低血栓的重量 (P <0.01), 其抑制率分别为
22.9%, 37.8%和 49.3%。 A sp 60mg kg- 1亦可抑
制血栓形成 ,抑制率为 34.3%,其作用弱于 PAMD
30 mg kg-1 (P <0.05), 而与 PAMD 7.5和 15
mg kg- 1相比无显著性差异(P >0.05)。
2　PAMD对血小板聚集的影响
实验结果表明 ,体内给予 PAMD ,可剂量依赖性
地抑制由 ADP, AA和 THR诱导的大鼠和兔血小板
聚集 (P <0.05或 P <0.01)。 A sp也可以抑制由
ADP, AA和 THR诱导的大鼠和兔体内血小板聚集
(P <0.05或 P <0.01,表 1 , 2)。
3　PAMD对兔血小板超微结构的影响
运用透射电镜技术观察了 THR诱导的兔血小
板聚集过程中超微结构的变化以及 PAMD体外给
药的影响 。结果显示体外 200 U L- 1 THR可诱导
血小板活化 ,表现为伪足形成 ,颗粒分泌 ,糖原储备
917 孔祥英等:蝙蝠葛酚性碱对血栓形成和血小板聚集的影响
减少 ,胞内结构破坏等 。体外给予 PAMD 1, 10和
100μmol L - 1和 A sp 100 μmol L - 1可显著抑制由
THR诱导的血小板超微结构的变化(图 1)。
4　PAMD对 TXB2和 6-酮基-PGF1α生成的影响
采用放射免疫法测定 ,兔血小板 TXB2自发的释
放量为 (10.9±3.3) pg /107血小板 , THR处理后释
放量明显增加 ,达 (44.2±9.9) pg /107血小板。 A sp
可显著抑制 THR诱导的 TXB2释放量的增加 ,抑制
率为 35.3%(P <0.01)。而 PAMD 1, 10和 100
μmo l L -1处理后对 TXB2释放量无显著性影响
(P >0.05)。 A sp能抑制兔胸主动脉环 6-酮基-
PGF1α的生成 ,抑制率为 71.3%(P <0.01),而 PAMD
各剂量组可增加 6-酮基-PGF1α的生成 ,增加率分别
为 9.0%, 37.6%和 76.1%(P <0.05或 P <0.01)。
5　PAMD对兔血浆 NO浓度的影响
NS组与 A sp组兔血浆 NO浓度相比无显著性
Table 1　E ffect o f PAMD on rat p late le t agg regation induced by ADP, AA and THR in vivo
Group
Dose
/m g kg- 1
ADP
AGGm ax /% I /%
AA
AGGm ax /% I /%
THR
AGGm ax /% I /%
NS 71.3±10. 8 55. 7±14. 0 93. 9±7. 2
A sp 60 40.6±10. 9** 43. 1 3. 1±4.5** 94. 4 76. 8±7. 5** 18. 2
PAMD 7.5 45.1±12. 5** 36. 7 40. 5±10. 7*▲▲ 27. 3 83. 2±8. 0** 11. 4
15 38.8±13. 1** 45. 6 36. 3±15. 6**▲▲ 34. 8 81. 0±6. 7** 13. 7
30 22.6±13. 4**▲ 68. 3 26. 0±12. 7**▲▲ 53. 3 78. 9±12. 2** 16. 0
n =10, –x±s. *P <0. 05, **P <0.01 vsNS g roup;▲P <0.05, ▲▲P <0.01 vsA sp group. AGGm ax(%)=m ax im um
aggrega tion in%;I(%)=inhibition in %. PAMD:Pheno lic alka lo ids ofMen isperm um dauricum;A sp:A spirin;ADP:
Adeno sine d iphospha te;AA:A rach idonic acid;THR:Throm bin
Tab le 2　E ffect of PAMD on rabb it pla telet agg rega tion induced by ADP, AA and THR in vivo
Group
Dose
/m g kg- 1
ADP
AGGm ax /% I /%
AA
AGGm ax /% I /%
THR
AGGm ax /% I /%
NS 85.4±9. 6 95. 0±7.7 94. 6±8. 6
A sp 30 61.6±17. 5** 28. 0 45. 6±28. 4** 52. 0 7. 8±15. 3** 28. 3
PAMD 4 58.3±8. 8** 31. 7 72. 3±7.7**▲ 23. 9 69. 0±7. 2** 27. 1
8 57.9±5. 8** 32. 2 67. 9±8.7**▲ 28. 5 60. 7±21. 2** 35. 8
16 50.3±17. 5** 41. 1 61. 6±10. 7** 35. 2 52. 4±12. 3**▲ 44. 6
n=10, –x±s. **P <0.01 vsNS g roup;▲P <0. 05 vsA sp g roup
F igure 1　E ffect of PAMD on THR-induced ultrastruc tura l changes and degranu lation in rabbit p late le ts( ×10 000). A:Contro l group;B:NS+THR (100U L - 1);C:A sp (100μmo l L -1)+THR (100
U L -1);D -F:PAMD (1, 10, 100 μmo l L -1)+THR (100 U L -1), respec tively
918 药学学报 Ac ta Pharm aceutica S inica 2005, 40(10):916 -919
差异(P >0.05);PAMD (1, 10和 100 μmo l L - 1)
可显著升高兔血浆 NO浓度 ,以低剂量组为最明显
(与 NS相比:P <0.05或 P <0.01,表 3)。
Tab le 3　E ffect of PAMD on n itric oxide concentra tion
in rabb it plasma
G roup Dose /m g kg - 1 NO /μmo l L- 1 △%
NS - 31. 7±7. 9
Asp 30 33. 9±15. 2 6. 9
PAMD 4 59. 7±11. 1**▲ 88. 3
8 52. 1±12. 1**▲ 64. 4
16 52. 3±16. 1* 64. 8
n =10, –x ±s. *P <0.05, **P <0. 01 vs NS g roup;
▲P <0.05 vs Asp g roup
讨论
本文选用动-静脉短路血栓形成模型 , 表明
PAMD体内给药可剂量依赖性地减轻血栓的湿重 ,
提示 PAMD具有抗血栓形成的作用 。血小板诱聚
剂 ADP和 TXA2等也可促进血小板聚集和血栓形
成 ,本实验结果同时表明 PAMD能抑制 ADP, AA和
THR诱导的血小板聚集 ,与血栓湿重的减轻相平
行 ,表明 PAMD的抗血栓作用与抗血小板聚集作用
具有一致性 ,提示 PAMD的抗血栓作用可能与抑制
血小板聚集有关 。
本文选择不同的诱聚剂代表不同的血小板激活
途径来观察 PAMD对血小板活化的影响。结果表
明 , PAMD能抑制不同诱聚剂诱导的血小板聚集 ,提
示 PAMD可抑制不同途径的血小板激活 。而 A sp
对由 AA诱导的血小板聚集的抑制作用最强 ,这与
它抑制环氧化酶的作用相符 。 THR可以激活血小
板 ,表现为伪足生成 、颗粒成分减少 、糖原储备减少 。
PAMD可剂量依赖性地抑制血小板这种活化的程
度 。
本实验结果表明 , PAMD对兔血小板 TXB2的释
放无明显抑制作用 ,而剂量依赖性地提高兔胸主动
脉环 6-酮基-PGF1α的含量 ,提示 PAMD抗血小板聚
集的作用机制与提高 6-酮基-PGF1α的释放有关 。而
A sp可使 TXA2和 PG I2的生成都减少 ,提示两药的作
用部位不同 。A sp通过抑制环氧化酶 [ 3] ,而使 TXA2
和 PG I2的前体物质前列腺素内过氧化物 PGG 2和
PGH 2的生成减少 ,最终导致 TXA 2和 PG I2的量均减
少 ,本实验结果与之相符 。 PAMD可能是作用于
PG I2合成酶 ,使 PG I2的生成增加。本研究还发现
PAMD对 PG I2生成的影响与其抗血小板聚集作用不
完全平行 。如 PAMD低剂量组对 PG I2的生成无明
显增高作用 ,但可以抑制血小板聚集 , 提示 PAMD
抗血小板聚集的机制除此以外还存在其他的机制 。
NO在心血管 、神经和免疫系统中作为信使分
子 ,具有舒张血管 、维持血管基础张力 、抑制血管平
滑肌细胞活性 、抗血小板聚集 、抗血小板与血细胞的
黏附等作用[ 4 ～ 6] 。 NO可通过 cGMP依赖性和 cGMP
非依赖性通路 ,抑制血小板内 Ca2+的水平 ,从而抑
制血小板聚集 [ 7] 。NO还可抑制血小板表面膜糖蛋
白 GPIIb /IIIa, CD63及 CD62p(P-选择素 )的表达 ,使
PG I2升高 ,说明 NO抑制血小板聚集的作用机制较
为复杂[ 8] 。本实验表明 PAMD具有升高兔血浆 NO
浓度的作用 ,剂量依赖性地增加兔胸主动脉环 6-酮
基-PGF1α的含量 ,这样可以协同作用抑制血小板的
聚集 。鉴于 PAMD的升高 NO浓度与其抗血小板聚
集和抗血栓形成并不平行 ,提示其作用机制是多途
径的 ,但其具体机制还待进一步研究。
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