全 文 ：药 物 生 物 技 术
Pharmaceutical Biotechnology 2015，22(3):226 ～ 228
马尾杉内生真菌分离及其抑菌活性研究
张 杰1，李俊峰2，张贝贝2，范真真2，叶志青2，刘文洪2
*
(1．杭州职业技术学院，浙江 杭州 310018;2．浙江中医药大学，浙江 杭州 310053)
摘 要 分离马尾杉内生真菌，并筛选其具抑菌活性菌株。用组织块分离法分离纯化菌株，通过形态学观
察对其进行初步鉴定，以大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌为指示菌，采用对峙法进行抑菌活性筛选。
实验分离获得马尾杉内生真菌 28 株，其中叶 4 株，叶鞘 12 株，茎 9 株，根 3 株。革兰氏染色结果表明，28 株菌
中，17 株菌的菌丝染色呈紫色(60. 71%)，11 株菌染色呈红色(39. 29%) ，各菌的菌丝形态和孢子形态各异。
抑菌实验结果表明所得 28 株马尾杉内生真菌，有 11 株至少能对 1 种指示菌有抑菌作用，占总分离菌株的
39. 29%，其中 3 株对金黄色葡萄球菌有较强的抑菌活性。马尾杉中存在大量的内生真菌，有些内生菌能产生
抑菌活性代谢产物，可以进一步对这些代谢产物开展研究，为微生物药物资源的开发提供前期的物质基础。
关键词 马尾杉;内生真菌;分离;纯化;抑菌活性
中图分类号 Q93 文献标志码 A 文章编号 1005-8915(2015)03-0226-03
马尾杉(PhlegmariurusphlegmariaHolub)为石杉科中型
附生蕨类植物，附生于海拔 100 ～ 2 400 米的林下树干或岩
石上［1］，国内外均有分布。该植物为观赏植物，同时又是药
用植物，全草入药可治风湿痹痛、跌打损伤、发热咽痛、水肿
及荨麻疹等症［2］。马尾杉在以往的研究中主要关注的是它
的化学有效成分如生物碱［3-4］，对其内生菌的抑菌活性报
道较少。实验对马尾杉植物根、茎、叶内生真菌进行分离及
纯化，并对分离的内生真菌的抑菌活性进行初步分析。
1 材料与方法
1. 1 供分离的马尾杉植物样本
马尾杉植物样本，采自浙江临安山区，盆栽于实验室。
1. 2 实验菌株
待筛菌株:从马尾杉植物样本中分离得到的内生真菌。
指示菌:大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌，由
浙江中医药大学生物与制药工程实验中心提供。
1. 3 实验试剂
MS培养基、PDA培养基、LB 培养基(实验室配制);其
他试剂均为国产分析纯。
1. 4 内生菌的分离与纯化
1. 4. 1 马尾杉植物样本的表面消毒 从新鲜健壮的马尾
杉不同部位(根、茎、叶)取下样本，自来水冲洗干净，再冲
洗 30 min，滤纸吸干表面水分。无菌操作下，采用酒精—升
汞法对植物样本进行表面消毒，用 75%酒精清洗 30 s，无菌
水冲洗 3 次，0. 1%升汞漂洗 10 min，无菌水冲洗 5 次，收集
最后一次冲洗植物样本的无菌水备用。
1. 4. 2 马尾杉植物样本表面消毒的检验 无菌水检验法:
取最后一次冲洗样本的无菌水 200 μL 涂布于 PDA 培养基
上，于 28 ℃下培养 5 ～ 8 d，观察是否有菌落长出作为对照
判断表面消毒是否彻底。
1. 4. 3 马尾杉内生真菌的分离培养 取表面消毒的植物
样本，用无菌手术刀轻轻刮去外皮，根、茎切割成 0. 5 cm3
的小块，叶切割成 0. 5 cm2 的小块，置于 MS 培养基上，于
28 ℃培养箱培养，逐日观察，待其切面长出菌后，及时挑取
菌落转移到 PDA培养基上，以备纯化。
1. 4. 4 马尾杉内生真菌的纯化 根据菌落形态、颜色的差
异以及生长时间的不同，分别挑取各平板菌落边缘的菌丝
采用平板划线法进行纯化，平板划线 3 次以上，最后平板中
菌落形态、菌丝和孢子形态和菌落颜色稳定，得菌落纯菌
株，编号并保存菌种。
1. 4. 5 马尾杉内生真菌的形态学初步鉴定 根据菌落在
固定的条件下，所呈现的形状、大小、颜色、纹饰等特征是不
变的原理，在 PDA培养基、28 ℃、培养时间(一般 3 ～ 5 d)，
观察菌落和菌丝等形态及颜色等，结合革兰氏染色进行形
态观察，对内生真菌进行初步鉴定。
1. 5 抑菌活性菌株的筛选
1. 5. 1 实验菌株的制备 待筛菌株的制备:将已保存的内
生真菌菌种转接到 PDA平板上培养 7 d，备用。
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* 收稿日期:2014-11-16 修回日期:2014-12-22
基金项目:国家自然科学基金(No． 31270051);浙江省教育厅重点项目(No． Z201121522)。
作者简介:张杰(1982-)，男，讲师，硕士，主要从事药用植物资源开发与产业化应用研究，E-mail:jzhang821209@ 163. com。
* 通讯作者:刘文洪，男，副教授，Tel:13675837998，E-mail:lwh687@ 163. com。
张 杰，等:马尾杉内生真菌分离及其抑菌活性研究
指示菌的制备:分别把大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和金黄
色葡萄球菌转接到 LB液体培养基中，37 ℃培养 8 ～ 12 h，
备用。
1. 5. 2 活性菌株的筛选 在 LB培养基上用涂布棒均匀涂
布指示菌菌液，再将内生菌菌饼接种到 LB 培养基上，置于
生化培养箱 37 ℃培养 2 d，测量抑菌圈大小。
2 实验结果
2. 1 表面消毒检验结果
最后一次冲洗后的无菌水涂板培养未见长菌，可以判
定表面消毒是彻底的。
2. 2 马尾杉内生真菌分离纯化及形态学初步鉴定结果
采用组织块分离法，从马尾杉植物样本中共分离得到
28 株内生真菌，其中叶 4 株，叶鞘 12 株，茎 9 株，根 3 株，分
别占总分离菌株的 14. 29%，42. 86%，32. 14%和 10. 71%。
分离结果表明内生真菌在马尾杉中普遍存在，其中以叶鞘
和茎中分离的内生真菌种类居多，而叶和根中分离的内生
真菌种类较少。
通过形态学观察对 28 株分离菌株从菌落形态和革兰
氏染色进行初步鉴定，实验结果表明，各菌株在菌落形态特
征和菌丝的染色结果、形态及孢子的形态等均存在不同。
染色结果表明，28 株菌中，17 株菌的菌丝染色呈紫色
(60. 71%)，11 株菌染色呈红色(39. 29%)，各菌的菌丝形
态和孢子形态各异(图 1:A-3、B-3、C-3)。马尾杉部分内生
真菌菌落形态各不相同(图 1 A-1，2、B-1，2、C-1，2)，HP1 气
生菌丝白色，致密，基内菌丝粉紫色;HP3 气生菌丝白色，絮
状，基内菌丝为牙色;HP17 菌丝灰色，蓬松，基质黑色。
A-1:Tissue culture vessels of HP1;A-2:Colony of HP1;A-3:Gram
staining of HP1;B-1:Tissue culturevessels of HP3;B-2:Colony of
HP3;B-3:Gram staining of HP3;C-1:Tissue culture vessels of
HP17;C-2:Colony of HP17;C-3:Gram staining of HP17
Fig 1 Purification of endophytic fungi and gram staining
2. 3 活性菌株筛选结果
采用对峙法测定 28 株内生真菌抑菌活性，实验结果表
明，有 11 株至少能对 1 种指示菌有抑菌作用，占总分离菌
株的 39. 29%，其中拮抗大肠杆菌的有 2 株，拮抗枯草芽孢
杆菌有 2 株，拮抗金黄色葡萄球菌有 11 株。经复筛重复实
验验证，有高抑菌活性且作用稳定的菌株只有 3 株，分别是
编号 HP9、HP16和 HP21，都是仅对金黄色葡萄球菌有稳定较
强抑菌效果。图 2 显示了部分内生真菌对指示菌的抑菌
活性。
A:Inhibition of Escherichia coli;B:Inhibition of Bacillus subtilis;
C，D:Inhibition of Staphylococcus aureus
Fig 2 Screening the antibacterial activity of strains
3 讨论
近年来，由于植物内生真菌种群及代谢产物的多样
性，其已成为植物新资源研究的一个热点［5］。目前已经从
红豆杉、喜树、杜仲等几百种植物中分离得到大量内生真
菌［6-8］，并从这些内生菌的代谢产物中分离到抗癌［9］、抗
菌［10］、抗氧化［11］等活性物质。实验采用组织块分离法从
严格表面消毒的马尾杉植物样本中分离得到 28 株内生真
菌，分离出的内生真菌种群丰富，分布广泛，但分布部位具
有差异性。叶、叶鞘、茎和根相比，叶鞘和茎中分离到的菌
株数量多，而叶和根中的内生真菌种类和数量相对较少。
这可能由于空气和土壤的温度、湿度、光照等气候条件的
差异，影响了内生真菌对马尾杉的感染、定殖。形态学观
察实验结果表明马尾杉内生真菌具有丰富的菌落形态，其
中革兰氏染色呈紫色共 17 株，革兰氏染色呈红色共 11 株。
对峙实验结果表明，马尾杉的内生真菌中存在着一定的抗
菌活性菌株。但马尾杉的不同部位的内生真菌其抑菌活
性菌株存在一定的差异，叶鞘和茎中分离到的菌株数量
多，抑菌活性高的菌株亦多，从叶鞘中分离的 HP9、HP16和
从茎中分离的 HP21都对金黄色葡萄球菌有稳定较强的抑
菌效果，可为进一步实验如分离得到具较强抑菌效果的单
体化合物提供材料。
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药 物 生 物 技 术 第 22 卷第 3 期
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Isolation of Endophytic Fungi from Phlegmariurusphlegmaria Holub and
Study on Their Antibacterial Activity
ZHANG Jie1，LI Jun-feng2，ZHANG Bei-bei2，FAN Zhen-zhen2，YE Zhi-qing2，LIU Wen-hong2*
(1． Hangzhou Vocational and Technical College，Hangzhou 310018，China;2． Zhejiang Chinese Medical University，
Hangzhou 310053，China)
Abstract The purpose is to isolate the endophytic fungi from Phlegmariurusphlegmaria Holub and to screen the antibacterial activity
of these strains. Endophytic fungi were isolated with tissue inoculation culture and identified by conventional morphological characte-
ristic method. Escherichia coli，Bacillus subtilis and Staphylococcus aureus were used as indicators to do the microbial inhibition experi-
ment. A total of 28 strains of endophytic fungi were isolated，including 4 strains from leaf，12 strains from sheath，9 strains from stem
and 3 strains from root. Gram staining results showed that 17 strains were purple (60. 71% of the total strains isolated)and，
11 strains were red (39. 29% of the total strains isolated). Mycelial and spore of endophytic fungi are of different forms. The anti-
bacterial test showed that，among 28 strains of endophytic fungi isolated from Phlegmariurusphlegmaria Holub，11 strains (39. 29%
of the total strains isolated)showed the antibacterial activity against at least one of indicator bacteria. And 3 stains of them showed
the stable and strong antibacterial activity against Staphylococcus aureus. The Phlegmariurusphlegmaria Holub contains abundant
endophytic fungi，some of which can produce antibacterial active metabolites. Further research can be focused on these metabolites，
which may provide the material basis for microbial medicine resource development.
Key words Phlegmariurusphlegmaria Holub，Endophytic fungi，Isolation，Purification，Antibacterial activity
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