全 文 ：◎研究原著 ◎ 中国临床药理学与治疗学中国药理学会主办
CN 34-1206 R , ISSN 1009-2501
http: www.DrugChina.net
2004 Jun;9(6):612-614
2003-12-30收稿　2004-04-01修回
湖南省卫生厅中医药科研基金项目(№2000006)
郭玉 ,女 ,硕士 ,副教授 ,研究方向:心血管药理学。
Tel:0734-8281408 　 E-mai l:Guoyuhy@sohu.com
金粉蕨素对脂质过氧化损伤内皮细胞的保护作用
郭 玉 ,严鹏科 ,朱炳阳
南华大学药物药理研究所 ,衡阳 421001 ,湖南
摘要　目的:探讨金粉蕨素对脂质过氧化损伤人内
皮细胞株(ECV304)的保护作用及其可能的分子作
用机制 。方法:在铜离子诱发的低密度脂蛋白氧化
修饰的基础上 ,建立内皮细胞(endothelial cell , EC)
的脂质过氧化损伤模型;采用 MTT 比色法 、硝酸还
原酶法等方法 ,测定不同浓度金粉蕨素(1.0 、5.0 、
10.0 μmol·L-1)对 EC 生长抑制率 、硫代巴比妥反应
物(thiobarbituric acid-reactive substances , TBARS)、
LDH及NO含量的影响。结果:氧化修饰低密度脂
蛋白(oxidatively modified low density lipoprotein , ox-
LDL)作用 24 h 后 ,对 EC 的生长增殖有明显的抑制
作用 ,细胞培养液中 TBARS 、LDH水平显著升高 ,NO
含量降价;而不同浓度金粉蕨素与 oxLDL 共同孵育
24 h ,呈剂量依赖性对抗 oxLDL 对 EC 的损伤 ,并促
进EC 增殖 , 同时使培养液中 TBARS 、LDH 含量降
低 ,NO 含量回升。结论:脂质过氧化能直接损伤内
皮细胞 ,金粉蕨素对脂质过氧化损伤的内皮细胞有
保护作用 。
关键词　脂质过氧化;金粉蕨素;内皮细胞;硫代巴
比妥反应物;一氧化氮;乳酸脱氢酶
中图分类号:R965.1;R966
文献标识码:A
文 章 编 号:1009-2501(2004)06-0612-03
血管内皮细胞位于血管内表面 ,其功能不仅是
解剖意义上的屏障作用 ,而且在调节血管弹性 、抗
凝 、抑制平滑肌增生 、维持血管内稳态等方面也起着
十分重要的作用。近年来不少研究证明 ,血管内皮
细胞损伤是多种心血管疾病的共同病理生理改变 ,
是动脉粥样硬化(atherosclerosis , As)发生的始动环
节 。尽管损伤内皮细胞的因素较多 ,但脂质过氧化
损伤在As中的作用已倍受人们关注 ,氧化修饰低密
度脂蛋白(oxidatively modified low density lipoprotein ,
oxLDL)可直接损伤内皮细胞 ,抑制修复及促进单核
细胞进入内皮从而引起 As病变部位的脂质过氧化
含量增高 ,促进As的形成。因此 ,研究 oxLDL对 EC
的损伤作用及机制已成为当前研究 As发生及防治
的重要内容 。
金粉蕨素(onychin)是从湖南永州采集到的中国
蕨科(Sinopteridaceae)金粉蕨属(Onychium ching)粟
柄金蕨粉(Onychium lucidum)植物中提出的二氢黄
酮苷(flavanone glycoside),属于黄酮类化合物 。黄酮
类化合物具有抗炎 ,抗氧化 ,抗癌等生理及药理活
性[ 1] 。初步研究发现金粉蕨素能促进血管内皮细胞
(vascular endothelial cell , VEC)释放和合成一氧化氮
(nitric oxide , NO),且抑制血管平滑肌细胞增殖 ,对
溶血性磷脂酰胆碱损伤血管内皮细胞的舒张功能有
明显的保护作用[ 2] 。本研究是以 oxLDL损伤 EC ,建
立氧化损伤模型 ,观察不同浓度金粉蕨素对细胞培
养液中硫代巴比妥反应物(TBARS)、乳酸脱氢酶
(LDH)、NO含量的影响 ,以期探讨金粉蕨素抗氧化
损伤内皮细胞的保护作用及其可能的分子机制 。
1　材料与方法
1.1　材料　金粉蕨素:用二甲基亚砜(dimethyl sul-
foxide , DMSO)溶解(DMSO终浓度不超过 1 1000);胰
酶 ,胶原酶 ,M199 ,内皮细胞生长因子等为 sigma 公
司产品;MDA测试盒 、NO检测试剂盒购自南京建成
生物工程研究所;BCA 蛋白定量试剂购自 PIERCE
公司 。CO2培养箱(USA);Elx800酶联仪(USA);Nikon
相差显微镜(日本);无菌超净台 ,超低温冰箱等 。
1.2　低密度脂蛋白的氧化修饰及鉴定　人血浆低密
度脂蛋白(LDL)采用超速离心法分离 ,经琼脂糖电
泳 、十二烷基磺酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶电泳 ,均
·612·
显示为单一蛋白带 。将 LDL置于 PBS 溶液中 ,4 ℃
透析 36 h , 充分去除 EDTA 后 , 用含 10 μmol·L-1
CuSO4的 PBS溶液(pH 7.2)中 ,37 ℃透析 20 h。氧
化修饰后的 LDL置于含 100 μmol·L-1 EDTA的 PBS
中 ,4 ℃透析 24 h ,终止氧化 。经 TBARS 含量检测
和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定后 ,超滤除菌 , BCA
试剂定量蛋白 ,调蛋白浓度至 1 g·L-1用于实验 。
1.3　人脐静脉内皮细胞株的培养　人脐静脉内皮
细胞株(ECV304)购自武汉大学细胞库存中心 。用
10%小牛血清的 DMEM 培养液于细胞培养箱中培
养;待细胞融合成单层后 ,用 0.25%胰酶和 0.01%
EDTA消化传代。
1.4　实验分组及处理方法　实验分 3组 。正常对
照组;oxLDL处理组:观察量效关系 ,分别用 25 、50 、
100 、200 g·L-1 oxLDL处理内皮细胞;oxLDL+金粉蕨
素处理组:以 100 g·L-1 oxLDL分别与不同浓度金粉
蕨素处理内皮细胞;按实验分组加入相应处理因素 ,
孵育 24 h 后 ,检测相应指标。
1.5　内皮细胞生长抑制率检测　采用MTT法即自动酶
联仪于 570 nm 波长下测定每孔细胞 OD 值 ,评价细
胞的生长抑制情况。按下列公式计算细胞生长抑制
率(inhibitory rate , IR):细胞生长抑制率=(正常对照
组OD值-用药组OD值) 正常对照组OD值×100%。
1.6　细胞培养液中 TBARS和 LDH含量测定　采
用比色法按南京建成生物公司提供丙二醛(MDA)试
剂盒内说明书方法测定细胞培养液中脂质过氧化物
(LPO)代谢产物MDA的含量即 TBARS 值;用 717型
HITACHI全自动分析仪测定 LDH含量。
1.7　培养液中 NO 含量的测定　采用硝酸酶还原
法按南京建成生物公司提供试剂盒内说明书方法测
定细胞培养液中 NO的含量 。
1.8　统计学处理　实验数据均采用 x±s 表示 ,组
间比较经方差齐性分析后进行 t 检验 。
2　结果
2.1　LDL氧化修饰及鉴定结果 　取氧化前后的
LDL ,经5%的聚丙烯酰氨凝胶电泳 , 2.5%考马斯
亮蓝常规染色 ,脱色后可见清晰均一的 LDL 条带 ,
经CuSO4处理的 LDL ,由于阴离子含量增多 ,电泳迁
移率明显增快。LDL 和 oxLDL 的 TBARS 检测 ,结果
氧化前 LDL (nLDL)的 TBARS 含量为 4.26 ±
0.52 μmol·mg-1 蛋白 , oxLDL 的 TBARS 含 量为
19.84±0.22μmol·mg-1 蛋白(n=8),说明LDL已被
氧化(图 1)。
图 1　低密度脂蛋白的 SDS-聚丙烯酰氨凝胶电泳图谱
2.2　oxLDL对内皮细胞增殖的影响　oxLDL 对内
皮细胞生长抑制作用呈剂量依赖性 ,低剂量 oxLDL
(25μg·ml-1)对内皮细胞无明显影响 ,随着 oxLDL浓
度增高 ,内皮细胞受抑制程度逐渐增强 ,当 oxLDL浓
度达到 200 mg·L-1时 ,镜下可见大部分细胞脱落 ,
死亡(图 2)。
图 2　氧化修饰低密度脂蛋白(oxLDL)抑制内皮细胞增殖的
浓度曲线
2.3　金粉蕨素对受损内皮细胞增殖的影响　oxLDL
(100 mg·L-1)作用内皮细胞 24 h 后 ,细胞的生长增
殖明显受到抑制 ,其生长抑制率达 50.3%,以不同
剂量的金粉蕨素 1.0 、5.0 、10.0 μmol·L-1同 oxLDL
(100 mg·L-1)一起与内皮细胞孵育 ,金粉蕨素呈剂
量依赖性地对抗 oxLDL 的损伤作用 ,降低 oxLDL 对
内皮细胞的抑制率(表 1)。
表 1　金粉蕨素对氧化损伤内皮细胞增殖的保护作用(n=8)
组别 OD IR %
对照组 0.796±0.039 -
oxLDL(100 mg·L-1) 0.396±0.043 50.3
oxLDL+金粉蕨素(1μmol·L-1) 0.433±0.054b 45.6
oxLDL+金粉蕨素(5μmol·L-1) 0.559±0.078b 29.7
oxLDL+金粉蕨素(10μmol·L-1) 0.605±0.082b 23.9
与 oxLDL(100μg·ml-1)比较bP<0.05;oxLDL:氧化修饰低密度脂蛋白
2.4　金粉蕨素对培养液中 TBARS、LDH及 NO含
量的影响　oxLDL 组细胞培养液中 TBARS 和 LDH
的含量明显高于正常组 ,NO含量明显低于正常组;
而金粉蕨素组随着金粉蕨素浓度的增加 ,其细胞培
养液中TBARS 和 LDH 的含量明显下降 ,NO的含量
明显上升;与 oxLDL 组比较 ,具有显著差异性(P <
0.05)。
·613·中国临床药理学与治疗学 2004 Jun;9(6)
表 2　金粉蕨素对氧化损伤内皮细胞培养液中 TBARS、LDH及 NO 含量的影响(x±s , n=4)
组别 TBARS nmol·L-1 LDH IU·L-1 NO μmol·L-1
对照组 0.60±0.03 46.3±2.5 78.2±4.3
oxLDL(100 mg·L-1) 3.49±0.28 120.7±6.8 36.3±2.1
oxLDL+金粉蕨素(1μmol·L-1) 3.23±0.29 108.3±5.6b 39.6±2.3
oxLDL+金粉蕨素(5μmol·L-1) 2.80±0.18b 90.6±5.2b 54.4±2.8b
oxLDL+金粉蕨素(10 μmol·L-1) 2.21±0.21b 71.4±3.9b 64.8±3.2b
与 oxLDL(100 mg·L-1)比较bP<0.05;TBARS:硫代巴比妥反应物;LDH:乳酸脱氢酶;NO:一氧化氮;oxLDL:氧化修饰低密度脂蛋白
3　讨论
内皮细胞的损伤和功能改变是动脉粥样硬化发
生的基础 。内皮细胞的损伤在动脉粥样硬化的发病
机理中作为起始机制 ,被认为具有重要作用。多种
研究提示内皮细胞对自由基和脂质过氧化作用非常
敏感 ,LDL氧化过程中产生的过氧化物可以直接损
伤内皮细胞[ 3 , 4] ;另有研究认为[ 5] , oxLDL 能降低内
皮细胞内皮型一氧化氮合酶的活性及其基因表达 ,
从而减少内皮源性 NO 的生成 。oxLDL 可使内皮细
胞对 LDL 的通透性增高 ,胞浆发生空泡变性 ,浆膜
皱缩 ,甚至可使细胞最终坏死;又使受损内皮细胞
NO的合成进一步减少 ,导致清除细胞代谢中产生的
氧自由基作用减弱 ,那么过量的氧自由基又进一步
加重内皮损伤。
细胞和 oxLDL 孵育使培养液中 TBARS 和 LDH
增多 ,提示内皮细胞膜自由基反应特别是脂质过氧
化 ,与 oxLDL 激发的内皮细胞损伤有关。金粉蕨素
是一种易氧化的黄酮类化合物 ,其抗氧化作用主要
是通过清除 O2 - ,抑制氧自由基形成而实现[ 6] 。在
对 oxLDL损伤内皮细胞及金粉蕨素保护作用的研究
中 ,金粉蕨素能增加NO的合成和释放 ,降低细胞培
养液中TBARS 和LDH 的含量 ,保护氧化损伤所抑制
的内皮细胞增殖 ,对抗 oxLDL 对内皮细胞的氧化损
伤作用 。
参 考 文 献
1　彭芳 , 陈植和.300 黄酮类化合物的生物学活性[ J] .国外
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2　庹勤慧 , 黄红林 , 谢志忠 , 郑兴 , 廖端芳.金粉蕨素对溶
血性磷脂酰胆碱损伤血管内皮依赖性舒张功能的保护作
用及机制[ J] .中国动脉硬化杂志 , 2001;9(1):27-30
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Superoxide anions and endothelial cell proliferation in normogly-
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1315-7
Protective effects of onychin on oxidative injured endothelial cells
GUO Yu , YAN Peng-Ke , ZHU Bing-Yang
Institute of Pharmacy and Pharmacology , Nanhua University , Hengyang 421001 , Hunan , China
ABSTRACT　AIM:To investigate the protective effects
of onychin on oxidative injured endothelial cells and its
protective mechanism.METHODS:The injured model
was established by endothelial cell treated with oxLDL.
Protective effect of onychin on growth inhibition of endo-
thelial cells injured by oxLDL was determined by MTT as-
say;NO concentrations in the medium were determined by
nitrate reductase assay.The damage degree of endothelial
cells was assessed by showing the TBARS and LDH levels
in conditioned media.RESULTS:Onychin with various
concentrations , given 24 hours , could decrease the growth
inhibitory rates of endothelial cells injured by oxLDL , in-
crease NO concentration and decrease the TBARS and
LDH levels in the medium.CONCLUSION:Onychin
can protect endothelial cells against oxidative damage.
KEY WORDS 　oxidative stree;onychin;endothelial
cell;thiobarbituric acid-reactive substances;NO;lactate
dehydrogenase
·614· Chin J Clin Pharmacol Ther 2004 Jun;9(6)