全 文 ：DOI: 10.13925/j.cnki.gsxb.20130480
豆梨NADH型硝酸还原酶基因克隆、
表达及酶活性分析
李 慧 1，丛 郁 2，常有宏 1*，蔺 经 1，盛宝龙 1
（1江苏省农业科学院园艺研究所·江苏省高效园艺作物遗传改良重点实验室，南京 210014；
2中国科学院南京土壤研究所土壤与农业可持续发展国家重点实验室，南京 210008）
摘 要:【目的】克隆豆梨硝酸还原酶基因（PcNR），并对其序列特征、表达特点及酶活性进行分析。【方法】采用电子克
隆、RT-PCR和长片段PCR，得到PcNR的cDNA和DNA序列，利用生物信息学方法进行序列分析，半定量RT-PCR检测
其表达特点，并测定硝酸还原酶活性。【结果】获得了豆梨硝酸还原酶基因（PcNR）的cDNA 编码区，其长度为2 712 bp，
编码903个氨基酸，对应的基因组DNA序列长4 115 bp，包括4个外显子和3个内含子。PcNR编码的多肽含有硝酸还
原酶特征序列：含钼因子、血红素结合区域和 FAD 绑定区域，属于NADH型硝酸还原酶。PcNR与湖北海棠MhNR
（JN632526）、桃PpNR（AB061670）和野草莓FvNR（XM_004300392）蛋白间的相似性较高，并与蔷薇科植物NR处于系
统进化树的同一分枝上。在无氮处理的豆梨叶片中几乎检测不到PcNR的表达；随着培养液中NO3-浓度的提高，其表
达量先上升后下降；此外，供氮时间、环境温度及光照均可调控该基因的表达。豆梨叶片中硝酸还原酶的活性变化规
律与PcNR表达量变化趋势相一致。【结论】首次从豆梨中克隆获得PcNR 基因的 cDNA 和DNA序列，揭示了其序列特
征，并对调控该基因表达和硝酸还原酶活性的相关因素进行分析，为开展梨砧木氮素营养研究提供资料。
关键词：豆梨；硝酸还原酶；序列特征；表达特点；酶活性
中图分类号：S661.2 文献标志码：A 文章编号：1009-9980(2014)05-0760-09
Cloning，expression and enzyme activity analysis of Nitrite Reductase
Gene from Pyrus calleryana
LI Hui1，CONG Yu2，CHANG You-hong1*，LIN Jing1，SHENG Bao-long1
(1Institute of Horticulture，Jiangsu Academy of Agricultural Sciences·Jiangsu Key Laboratory for Horticultural Crop Genetic Improvement，
Nanjing，Jiangsu 210014 China；2State Key Laboratory of Soil and Sustainable Agriculture，Institute of Soil Science，Chinese Academy of
Sciences，Nanjing，Jiangsu 210008 China)
Abstract:【Objective】The aim of this study was to clone the full-length cDNA and DNA of a gene encod⁃
ing nitrate reductase from Pyrus calleryana Dcne.，investigate its sequence characteristics and analyze its
expression in different environmental conditions in addition of the activities of nitrate reductase.【Method】
The full-length cDNA and DNA sequences of PcNR were isolated by electronic cloning together with PCR
techniques from P. calleryana，and the bioinformatics characteristics were analyzed using online software.
The expression profiles of PcNR and the nitrate reductase activities of leaves were determined using semi-
quantitative RT-PCR and sulfanilamide colorimetric method，respectively.【Result】The obtained cDNA
of PcNR was 2 712 bp in length with Genbank accession number KC545876，which encoded 903 amino
acid residues. The genomic DNA of PcNR was 4 115 bp in length with 4 exons and 3 introns. The deduced
protein of PcNR belonged to NADH-type NR subfamily and shared common structural features with that
of other higher plants，which included three distinguishable sequence regions named the Mo cofactor，the
cytochrome b5-like Fe-heme domain，and a flavin adenine nucleotide (FAD) cofactor binding domain，
果 树 学 报 2014，31（5）: 760～768
Journal of Fruit Science
收稿日期：2013-12-03 接受日期: 2014-04-03
基金项目：国家自然科学基金（31101529）；江苏省农业科技自主创新资金（CX(12)5033）
作者简介：李慧,女,博士,研究方向为果树逆境生理与分子生物学。Tel: 025-84390224，E-mail: lihui7904@163.com
􀆽通信作者 Author for correspondence. Tel: 025-84390224，E-mail: cyh@jaas.ac.cn
5期
respectively. PcNR was highly similarity to MhNR from Malus hupehensis (JN632526)，PpNR from
Prunus persica (AB061670) and FvNR from Fragaria vesca (XM_004300392). Furthermore，PcNR and
NRs of other Rosaceae plants，were located in the same branch of the phylogenetic tree. Semi-quantitative
RT-PCR results demonstrated that the mRNA abundance of PcNR was response to different nitrogen sta⁃
tus. PcNR was only slightly expressed in leaves without nitrogen supply，however，its abundance in⁃
creased sharply and then decreased along with the increase of nitrate concentrations. In addition，PcNR
expression was also regulated by treatment time，temperature and illumination. In all treatments，nitrate
reductase activity exhibited a positive correlation to the expression abundance of PcNR in leaves.【Conclu⁃
sion】The cDNA and DNA of PcNR gene of P. calleryana were firstly isolated and characterized. Then，
the relationships between several regulation factors of PcNR expression and the corresponding nitrate re⁃
ductase activity were disclosed preliminarily. This study will provide some useful information for the re⁃
search on nitrogen nutrition of pear rootstocks.
Key words: Pyrus calleryana Dcne.；Nitrate reductase；Sequence features；Expression characteristics；
Enzyme activity
硝酸还原酶（Nitrate reductase，NR）是氮同化过
程的关键限速酶，在调节植物对硝酸盐的还原及维
持体内多种代谢生理平衡中起重要作用[1]。高等植
物的NR由 nia基因所编码，为同型二聚体蛋白，每
个亚基包括含钼因子（Mo cofactor，MoCo）、血红素
结合区域（Cytochrome b5- like Fe- heme domain，
Heme）和黄素腺嘌呤二核苷酸绑定区域（Flavin ade-
nine nucleotide cofactor binding domain，FAD）3个辅
基。拟南芥中存在两个 nia基因，敲除 AtNIA1[2]或
AtNIA2[3]后，拟南芥突变体 NR活性显著下降，而
nia1，nia2双突变体中几乎检测不到NR活性[4]。在
植株中过量表达外源NR基因，能够增强转化体NR
活性，并减少硝酸盐的积累[5]。将N-末端缺失的烟
草nia2转入马铃薯后，转基因植株各器官中硝酸盐
含量显著降低[6-7]。目前，NR基因的研究大多集中于
草本植物，梨为我国主要的木本果树之一，氮素营养
在其生长过程起着不可代替的作用，其氮代谢机制
与草本植物存在一定差异[8]，因此，分离并鉴定梨NR
基因，研究该基因表达调控和酶活性变化之间的关
系有助于揭示该物种的氮代谢机制。
NR是一种诱导酶，其活性水平受到诸多因素
影响，光照为调控NR活性（Nitrate reductase activi-
ty，NRA）的关键因子之一[9]。此外，环境温度、供氮
状况和植株NR表达水平均可调节NRA [10-16]。随着
喷施KNO3的浓度上升，新高梨叶片NRA先上升后
下降[13]，但光照和温度如何调控该酶在梨树体内的
活性尚不清楚。
梨树生产中普遍用砧木嫁接优良品种的繁殖方
式[17]，嫁接苗生长发育所需的氮素营养主要通过砧
木根系吸收，因此研究砧木氮代谢的分子调控机制
有着重要的实践意义。本文以原产我国的梨砧木豆
梨（Pyrus calleryana Dcne.）为研究对象，借助 PCR
技术分离PcNR基因的 cDNA及DNA序列，研究不
同处理条件下植株叶片中该基因的表达规律及硝酸
还原酶的活性变化，为有针对性地解析PcNR基因
在豆梨硝态氮吸收过程中所起的生理功能提供理论
依据，以期为在基因水平上对硝酸还原酶进行调控
奠定基础。
1 材料和方法
1.1 材料
2012年 11月于浙江省嵊州市长乐镇（E120.58，
N30.01）收集豆梨单株成熟种子，种子用流水冲洗干
净，湿砂拌种在 4 ℃冰箱层积40 d后，播种于泥炭土
基质盆钵内，培养温度（25 ± 0.5）℃，光照周期 14 h/
10 h（光照/黑暗），光强为 300 μmol· m-2· s-1。生长期
间常规管理，并用 1/10 Hoagland营养液浇灌 [18]。
待豆梨幼苗生长至8叶一心时，选取生长健壮、长势
一致的植株作为研究材料。
RNA plant plus Reagent和 Plant Genomic DNA
Kit购自天根生化科技（北京）有限公司，M-MLV
RTase cDNA Synthesis Kit、PrimeSTAR HS DNA
Polymerase、DNA marker和 pMD19-T Vector购自宝
生物工程（大连）有限公司，引物由上海英骏生物技
术有限公司合成。大肠杆菌DH5α为本实验室保
存，硝酸还原酶测定试剂盒购自南京建成生物工程
研究所。
1.2 方法
李 慧等:豆梨NADH 型硝酸还原酶基因克隆、表达及酶活性分析 761
果 树 学 报 31卷
1.2.1 豆梨PcNR基因 cDNA和DNA的获得 豆梨
8叶一心幼苗用10 mmol· L-1 NaNO3溶液浸泡根部诱
导 24 h后，收集叶片并按照RNA plant plus Reagent
说明书提取总RNA，M-MLV RTase cDNA Synthesis
Kit 合成第一链 cDNA；同时采用 Plant Genomic
DNA Kit提取 10 mmol· L-1 NaNO3溶液处理后的叶
片 DNA。 采 用 芜 青 硝 酸 还 原 酶 基 因 BrNR
（ACF93242）氨基酸序列检索苹果EST数据库，将获
得的相关序列（CN914834、GO539476、CV883678、
GO539567、EB122874、EB121611和 GO538498）采
用 CAP3软件 [19]进行 Contig拼接，设计引物 PcNR-
ORF-S（5′-ATGACGGCCTCCGTTGAGAACCG-3′）
和 PcNR- ORF- F（5′-TCAAAACAACAGCAATGAA
TTTG-3′）利用高保真酶 PrimeSTAR HS DNA Poly-
merase扩增豆梨NR基因ORF区的cDNA和DNA序
列。扩增程序为：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，
72 ℃ 4 min，30个循环；72 ℃ 10 min。PCR产物连接
测序载体 pMD-19T并转化大肠杆菌DH5α，经PCR
鉴定后，选择3个阳性克隆菌送华大基因测序。
1.2.2 PcNR基因的生物信息学分析 PcNR基因核
苷酸翻译采用 BioXM2.6，Gene Structure Display
Server（http://gsds.cbi.pku.edu.cn/index.php）分析基因
的内含子与外显子组成。利用InterProScan Sequence
Search（http://www.ebi.ac.uk/Tools/pfa/iprscan）分析
蛋白家族特征结构。氨基酸序列比对作图及系统进
化树构建分别采用 CLC Sequence Viewer 6（http://
www.clcbio.com）和 MEGA5（http://www.megasoft-
ware.net/），所用序列来自 http://www.ncbi.nlm.nih.
gov。
1.2.3 PcNR基因的表达研究 将豆梨 8叶一心幼
苗移至无氮 1/4 MS营养液（以 4.7 mmol·L-1 KCl代替
4.7 mmol·L-1 KNO3，同时去除 NH4NO3）进行氮饥饿
24 h后进行处理。试验 1：以无氮 1/4 MS营养液为
基础，加入0、2.5、10或30 mmol·L-1NaNO3处理24 h；
试验2：植株在添加10 mmol·L-1NaNO3的无氮1/4 MS
营养液中处理 24、48、72、96 h；试验 3：在 18、28或
38 ℃条件下，植株在添加10 mmol·L-1NaNO3的无氮
1/4MS营养液中处理 24 h；试验 4：在光照或黑暗条
件下，植株在添加10 mmol·L-1NaNO3的无氮1/4 MS
营养液中处理 24 h。除特别指出之外，所有的处理
均在25 ℃，光周期为14 h/10 h（光照/黑暗）条件下进
行。处理后的植株叶片保存于-70 ℃冰箱待用。
叶片总RNA提取和 cDNA合成同上，以跨内含
子的表达引物PcNR-BD-S（5-TACTGGTGCTGGT-
GTTTCTG- 3）/PcNR- BD- F（5- CCAGCGTTGATG
AGAATGCT-3）扩增PcNR基因，采用引物PcActin-
S（5′-GGAATGGTCAAGGCTGGGTT-3′）/PcActin-F
（5′-CAAAGCATCTGTGAGGTCACG-3′）扩增豆梨
Actin基因 [16]，进行半定量RT-PCR，比较分析 PcNR
基因的表达情况。扩增程序为：94 ℃ 3 min；94 ℃
30 s，57 ℃ 30 s，72 ℃1 min，28个循环；72 ℃ 5 min。
1.2.4 硝酸还原酶活性的测定 取上述处理植株的
叶片（去叶脉）后采用硝酸还原酶测定试剂盒（磺胺
显色法）进行硝酸还原酶活性（NRA）测定。硝酸还
原酶还原NO3-生成NO2-，在酸性条件下，后者与磺胺
及α-萘胺生成红色偶氮化合物，通过测定产物的吸
光值，可知NO2-产量，进而计算得到NRA，NRA以每
毫克样品每分钟产生的 NO2-的量来表示，单位为
μmol·mg-1·min-1。酶活测定实验 3次重复，数据采
用SPSS软件进行差异显著性检验（P<0.05），Excel
作图。
2 结果与分析
2.1 PcNR基因的克隆
以 10 mmol·L-1 NaNO3溶液诱导 24 h的豆梨叶
片 cDNA为模板，采用PcNR-ORF-S和PcNR-ORF-F
进行扩增，获得单一条带（图1-A），同时利用该对引
物对豆梨DNA进行扩增，亦获得单一条带（图 1-
B）。测序结果表明，扩增得到的 cDNA序列长2 712
bp，其对应的DNA长度为4 115 bp，含有4个外显子
和3个内含子，编码一个含903个氨基酸的蛋白，推
测的分子质量为101.5 kD，等电点6.75。
2.2 PcNR基因的生物信息学分析
利用 InterProScan Sequence Search对上述 cD-
NA序列所编码蛋白进行分析，发现其具有构成NR
图1 豆梨PcNR基因的PCR扩增结果
M. 250 bp DNA Ladder Marker；A.编码区cDNA；B.编码区DNA
Fig. 1 The PCR amplification results of PcNR from
Pyrus calleryana
M. 250 bp DNA Ladder Marker；A. cDNA coding sequence；B.
DNA coding sequence
M A M B
4 5003 0002 2501 500750500250
4 5003 0002 2501 500750500250
bp bp
762
5期
必不可少的 3个辅基：含钼因子（334~465位氨基
酸）、血红素结合区域（515~595 位氨基酸）和 FAD
绑定区域（640~759位氨基酸），并且包含CGPPP-M
基序（874~879位氨基酸）（图 2-A），说明该基因属
于NADH型NR。将其命名为 PcNR（GenBank登录
号为KC545876）。
PcNR与其他植物NR基因的氨基酸序列间存
在较高的相似性，如湖北海棠（JN632526）(94%)、桃
（AB061670）（91%）、野草莓（XM_004300392）（88%）
和葡萄（NM_001281120）（86%）（图 3）。此外，蔷薇
图2 豆梨PcNR基因的核苷酸序列及其编码的氨基酸
A.方框部分依次为真核生物NR蛋白具有的3个功能结构域：含钼因子、血红素结合区域和FAD 绑定区域；双下划线为CGPPP-M 基序。B.
外显子和内含子分别用方框和直线表示，数字为核苷酸的数目。
Fig. 2 Nucleotide and deduced amino acid sequences of PcNR from Pyrus calleryana
A. The three regions which were identical to the amino acid sequences of mo-co oxidoreductase dimerisation domain，heme-binding domain pro⁃
file and oxidoreductase FAD-binding region are showed in the boxes. Double underline is CGPPP-M motif. B. The boxes represent exons, straight lines
indicate introns and numbers mean nucleotide number, respectively.
A
B
李 慧等:豆梨NADH 型硝酸还原酶基因克隆、表达及酶活性分析 763
果 树 学 报 31卷
科植物NR基因位于系统进化树上的同一分枝，豆
梨PcNR与湖北海棠MhNR亲缘关系最近（图4）。
2.3 PcNR基因的表达特点
采用跨内含子引物进行半定量RT-PCR，对豆梨
PcNR的表达特点进行研究。结果表明：生长在无氮
1/4 MS营养液中的豆梨幼苗叶片中PcNR基因的表

A
A
B
B C
C
******
图3 不同植物 NR基因氨基酸序列同源性比较
KC545876、JN632526、AB061670、XM_004300392、NM_106425、U76701、D86226和NM_001281120分别为豆梨、湖北海棠、桃、野草莓、拟南芥、
马铃薯、菠菜和葡萄NR基因的NCBI登陆号。A.血红素结合区；B.含钼因子；C. FAD 绑定区域；*. CGPPP-M 基序
Fig. 3 Alignment of predicted amino acid sequences of NR genes from different plants
KC545876，JN632526，AB061670，XM_004300392，NM_106425，U76701，D86226 and NM_001281120 are NCBI numbers of NR genes from Pyrus call-
eryana，Malus hupehensis，Prunus persica，Fragaria vesca，Arabidopsis thaliana，Solanum tuberosum，Spinacia oleracea and Vitis vinifera. A: mo-co oxido-
reductase dimerisation domain; B: heme-binding domain profile; C: oxidoreductase FAD-binding region; *: Shows the CGPPP-M motif
764
5期
达非常微弱；施加 2.5、10、30 mmol·L-1 NaNO3处理
24 h后，PcNR在豆梨叶片中的表达量增加，当Na-
NO3为 10 mmol·L- 1时，其表达水平最高；施加 10
mmol·L-1 NaNO3处理后，PcNR在豆梨叶片中的表达
随着处理时间的延长先上升后下降，表达峰值出现
在供氮 72 h；在 10 mmol·L- 1 NaNO3供氮 24 h条件
下，随着处理温度的提高，PcNR在豆梨叶片中的表
达先上升后下降，表达峰值出现在28 ℃；此外，光照
状况也会影响PcNR在豆梨叶片中的表达，连续光
照24 h可以促进该基因的表达，持续黑暗情况下，该
基因的表达水平下调（图 5）。即PcNR基因在豆梨
叶片中为诱导型表达，对植株的供氮水平、供氮时
间、环境温度以及光照状况均存在转录响应。
2.4 NRA分析
对豆梨叶片NRA在不同处理条件下的变化进
行分析发现：施加 0、2.5、10、30 mmol·L-1 NaNO3处
图4 豆梨PcNR推导的氨基酸序列和其他植物NR基因的系统进化树
标尺表示进化距离，节点上的数值表示Bootstrap验证中基于1 000次重复该节点可信度的百分比（%）。
Fig. 4 The phylogenetic tree of PcNR protein from Pyrus calleryana and NR genes from other plants
Scale shows evolutionary distance，the number at the nodes represents the reliability percent (%) of bootstraps values based on 1 000 replications.
图5 不同处理对豆梨叶片PcNR基因表达的影响
Fig. 5 Effects of different treatments on PcNR expression level in leaves of Pyrus calleryana
10 mMNO3-(24 h)18℃ 28℃ 38℃NO3-(24 h)0mM 2.5mM 10mM 30mM
10 mMNO3-24h 48h 72h 96h 10 mMNO3-(24 h)光照（Light）黑暗（Dark）
PcNR
Actin
PcNR
Actin
李 慧等:豆梨NADH 型硝酸还原酶基因克隆、表达及酶活性分析
湖北海棠Malus hupehensis，JN632526
100
100
100
100
100
100
0.05
99
54
92
66
37
79
43
39
99
100
豆梨Pyrus callervana，KC545876
桃 Prunus persica，AB061670
野草莓 Fragaria vesca，XM_004300392
拟南芥 Arabidopsis thaliana，NM_106425
欧洲油菜 Brassica napus，D38219
蔓菁 Brassica rapa，EU662272
蓖麻 Ricinus communis，AF314093
阔叶椴 Tilia platyphyllos，AY138811
葡萄 Vitis vinifera，NM_001281120
菠菜 Spinacia oleracea，D86226
马铃薯 Solan ntuberosum，U76701
烟草 Nicotiana benthamiana，AB245431
矮牵牛 Petunia hybrida，L11563
大豆 Glycine max，U13987
光叶百脉根 Lotus japonicus，X80670
菜豆 Phaseolus vulgaris，U01029
大麦 Hordeum vulgare，X57844
水稻 Oryza satiya，NM_001068544
0 m ol·L-12.5 mmol·L-1 10 mmol·L-1 30 m ol·L-1
2 h h h 9610 mmol·L
-1NO3-
明 Light 黑暗10 mmol·L
-1NO3-（24 h）
℃ 8 ℃
10 m ol·L-1NO3-（24 h）3-（ ）
765
果 树 学 报 31卷
b
a
0
20
40
60
光照 （Light） 黑暗（Dark）
d
ab
c
0
20
40
60
24 48 72 96
理 24 h后，NRA随着供氮浓度的增加先上升后下
降，当NaNO3为 10 mmol·L-1时，NRA水平最高；施
加 10 mmol·L- 1 NaNO3处理后，随着供氮时间的延
长，NRA先上升后下降，峰值出现在供氮72 h；在10
mmol·L-1 NaNO3供氮 24 h条件下，随着处理温度的
提高，NRA先上升后下降，峰值出现在28 ℃；此外，
光照状况也会影响豆梨叶片NRA，连续光照24 h可
以增加NRA，持续黑暗情况下，NRA水平下调（图
6）。即豆梨叶片中NRA受植株的供氮水平、供氮时
间、环境温度以及光照状况所调节。
图6 不同处理对豆梨叶片硝酸还原酶活性的影响
不同小写字母表示差异显著（P<0.05）
Fig. 6 Effects of different treatments on nitrate reductase activity in leaves of Pyrus calleryana
Different letters within columns represent significantly at 5% level
10 mmol·L-1NO3-/24 h10 mmol·L-1NO3-/h
10 mmol·L-1NO3-24 h/℃NO3-/（mmol·L-1）
硝
酸
还
原
酶
活
性
Nitr
ate
redu
ctas
eac
tivit
y/（μ
mol
·mg
-1 ·m
in-1 ）
3 讨 论
NR在生物体中普遍存在，根据电子供体的不
同，该酶可分为NADH:NR（EC1.6.6.1）、NAD（P）H:
NR（EC1.6.6.2）和NADPH:NR（EC1.6.6.3）3种，高等
植物中以NADH:NR 最为常见[20]。NR的C端 FAD
结构域具有Cys-Gly保守基序，它下游的氨基酸残
基种类决定该酶的具体亚类，CGPPP-M为NADH:
NR的特定基序，拟南芥、玉米、烟草、马铃薯、不结
球白菜等植物的NR均为该类型[3-4，6，10，21-23]。本研究
发现豆梨C端FAD结构域Cys-Gly保守基序下游为
CGPPP-M基序（874~879位氨基酸），说明此NR与
上述植物的NR同样属于NADH:NR。
NR蛋白的铰链 1连接含钼因子和血红素结合
区域，它们之间含有一个翻译后调控NRA的保守基
序[LK（K/R）（T/S）XS（T/S）PFM]（字体加粗部分为
所有植物NRs中完全相同的氨基酸，它们参与识别
激酶的磷酸化位点）[9，24]，该基序的第 6位为保守的
丝氨酸残基（拟南芥 Ser 534，菠菜 Ser 543，马铃薯
Ser 528，等等）（数字表示氨基酸位置，下同），它的
磷酸化直接影响NR翻译后调控NRA的效果 [10，24]，
当植株从光照转移到黑暗后，该保守丝氨酸残基发
生磷酸化，NRA被抑制[8]。本研究发现，豆梨叶片NRA
受光照调节：连续光照 24 h可以增加NRA，持续黑
暗情况下，NRA水平下调，并且，豆梨PcNR中亦存
在翻译后调控NRA的保守基序[504LKKSFSTPFM513
（其中的保守丝氨酸为Ser 509）]，但是，光照对豆梨
叶片NRA的调控是否通过PcNR翻译后丝氨酸残基
（Ser 509）的磷酸化来实现？这仍需氨基酸点突变
实验来加以证实。
植株供氮状况和NR表达水平是调控NRA的主
要因素 [10- 13，15- 16，20]，前人研究发现，梨叶片 NRA受
NO3-的浓度影响[13]，本实验也观察到相同现象。当
植株施加NO3-≤10 mmol·L-1 时，豆梨幼苗叶片NR
基因表达量随着供氮水平的提高而增加，NRA变化
规律与其相同，表明植株施氮后，NR基因产生转录
Light Dark
cab
0
20
40
60
18 28 38
d
b a c
0
10
20
30
40
50
0 2.5 10 30.0 2. 10.0 30.0 18 28 30
60
40
20
0
50
40
30
20
10
0
60
40
20
0
24 48 72 96
766
5期
响应，导致NR mRNA水平上升，从而促进NR的从
头合成，最终 NRA提高 [10，16]；植株施加 NO3-为 30
mmol·L-1时，叶片NR转录水平下降，NRA也相应下
降；这意味在较低的施氮水平下，NO3-对NR表达水
平和NRA有正效应，在较高的施氮水平下，NR表达
水平和NRA到达平台值，甚至下降，这一调控过
程与前人在马铃薯、黄瓜等物种中的研究结果类
似[12，16]。
植物的营养吸收过程对温度比较敏感，较低
的环境温度和高温均会抑制NRA，减少植株对氮
素的吸收[14，25-26]。在10 mmol·L-1 NaNO3供氮24 h条
件下，随着处理温度的提高，豆梨叶片NRA先上升
后下降，峰值出现在 28 ℃，表明豆梨氮吸收过程亦
受温度调控，但其具体影响仍需进一步测定植株的
氮含量来明确。
4 结 论
采用电子克隆、RT-PCR和长片段 PCR得到豆
梨PcNR的 cDNA和DNA序列，该基因具备植物NR
基因家族的特征序列，包含CGPPP-M基序（874-879
位氨基酸），属于NADH型硝酸还原酶。采用跨内
含子引物进行半定量RT-PCR分析PcNR的表达特
点，发现植株的供氮水平、供氮时间、环境温度及光
照均可调控豆梨叶片中该基因的表达。豆梨叶片中
硝酸还原酶的活性变化规律与PcNR基因表达变化
趋势相一致。本研究结果为探讨梨砧木氮素营养的
基因调控提供重要信息。
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