全 文 ：ＤＯＩ：１０．１１６８６／ｃｙｘｂ２０１５５４７ ｈｔｔｐ：／／ｃｙｘｂ．ｌｚｕ．ｅｄｕ．ｃｎ
陈辉，杨晖，强维亚．十个歪头菜居群遗传多样性分析．草业学报，２０１６，２５（９）：９６－１０３．
ＣＨＥＮ　Ｈｕｉ，ＹＡＮＧ　Ｈｕｉ，ＱＩＡＮＧ　Ｗｅｉ－Ｙａ．Ｇｅｎｅｔｉｃ　ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　ｔｅｎ　Ｖｉｃｉａ　ｕｎｉｊｕｇａｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ　ｂｙ　ＩＳＳＲ　ｍａｒｋｅｒｓ．Ａｃｔａ　Ｐｒａｔａｃｕｌｔｕｒａｅ　Ｓｉｎｉｃａ，２０１６，
２５（９）：９６－１０３．
十个歪头菜居群遗传多样性分析
陈辉１，杨晖２，强维亚１＊
（１．兰州大学生命科学学院，草地农业生态系统国家重点实验室，甘肃 兰州７３００００；
２．甘肃省科学院生物研究所，微生物开发应用重点实验室，甘肃 兰州７３００００）
摘要：采用ＩＳＳＲ分子标记对１０个歪头菜自然居群的１０４个样本进行遗传多样性分析，筛选的１０条ＩＳＳＲ引物共
扩增出１１５个位点，其中多态性位点１１０个。在物种水平上多态性比率（ＰＰＢ）为９５．６５％，在居群内多态位点比率
为２４．３５％～４９．７０％。ＰＯＰＧＥＮＥ分析结果显示，物种水平上Ｎｅｉ’ｓ基因多样性（Ｈ）为０．２６３２，Ｓｈａｎｎｏｎ’ｓ遗传多
样性信息指数（Ｉ）为０．４０４６，基因流（Ｎｍ）为０．４５５３，基因分化度（Ｇｓｔ）为０．５２８３，ＡＭＯＶＡ分析居群间遗传分化程
度为５０．５１％。研究表明，１０个采样点的歪头菜在物种水平上具有较高的遗传多样性，但在居群之间已经出现了
一定程度的遗传分化，且居群间的遗传分化程度高于居群内的分化程度。同时，证明了环境压力大小对于遗传多
样性的高低具有选择作用，环境压力小的烟台和环境压力大的合作地区具有较高的遗传多样性，但环境压力介于
二者之间的地区遗传多样性水平相对较低。本研究结果不仅对于了解歪头菜遗传进化和其生长地的环境的关系
具有重要的参考价值，对合理利用歪头菜遗传资源及育种还具有非常重要的作用。
关键词：歪头菜；ＩＳＳＲ；遗传多样性；遗传分化　　
＊Ｇｅｎｅｔｉｃ　ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　ｔｅｎ　Ｖｉｃｉａ　ｕｎｉｊｕｇａｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ　ｂｙ　ＩＳＳＲ　ｍａｒｋｅｒｓ
ＣＨＥＮ　Ｈｕｉ　１，ＹＡＮＧ　Ｈｕｉ　２，ＱＩＡＮＧ　Ｗｅｉ－Ｙａ１＊
１．Ｓｔａｔｅ　Ｋｅｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｏｆ　Ｇｒａｓｓｌａｎｄ　Ａｇｒｏ－ｅｃｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｓｃｈｏｏｌ　ｏｆ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｌａｎｚｈｏｕ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｌａｎｚｈｏｕ７３００００，Ｃｈｉｎａ；２．
Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇａｎｓｕ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｌａｎｚｈｏｕ７３００００，Ｃｈｉｎａ
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｉｎｔｅｒ－ｓｉｍｐｌｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｒｅｐｅａｔ（ＩＳＳＲ）ｍａｒｋｅｒｓ　ｗｅｒｅ　ｕｓｅｄ　ｔｏ　ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ　ｔｈｅ　ｇｅｎｅｔｉｃ　ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｗｉｔｈｉｎ　ａｎｄ
ａｍｏｎｇ　ｔｅｎ　ｎａｔｕｒａｌ　ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ　ｏｆ　Ｖｉｃｉａ　ｕｎｉｊｕｇａ．Ｔｅｎ　ＩＳＳＲ　ｐｒｉｍｅｒｓ　ｇｅｎｅｒａｔｅｄ　１１５ｄｉｓｃｅｒｎｉｂｌｅ　ＤＮＡ　ｂａｎｄｓ，ｏｆ
ｗｈｉｃｈ　１１０（９５．６５％）ｗｅｒｅ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ．Ｏｎ　ａｖｅｒａｇｅ　ｅａｃｈ　ｐｒｉｍｅｒ　ｐｒｏｄｕｃｅｄ　１１．５ｂａｎｄｓ，ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ　１１ｐｏｌｙｍｏｒ－
ｐｈｉｃ　ｂａｎｄｓ．Ａｔ　ｔｈｅ　ｓｐｅｃｉｅｓ　ｌｅｖｅｌ，ｈｉｇｈ　ｇｅｎｅｔｉｃ　ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｗａｓ　ｄｅｔｅｃｔｅｄ－ＰＰＢ（ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ　ｏｆ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ　ｌｏｃｉ）：
９５．６５％；Ｎｍ（ｇｅｎｅ　ｆｌｏｗ）：０．４５５３；Ｇｓｔ（ｇｅｎｅｔｉｃ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ）：０．５２８３；Ｈｓ（ｇｅｎｅ　ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｉｎ
ｓｕｂｄｉｖｉｄｅｄ　ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ）：０．２６３２．Ｈｏｗｅｖｅｒ，ｒｅｌａｔｉｖｅｌｙ　ｌｏｗ　ｇｅｎｅｔｉｃ　ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｅｘｉｓｔｅｄ　ｗｉｔｈｉｎ　ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ；ｔｈｅ
ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ　ｏｆ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ　ｌｏｃｉ　ｒａｔｅ　ｒａｎｇｅｄ　ｆｒｏｍ　２４．３５％ｔｏ　４８．７０％．Ａ　ｒｅｌａｔｉｖｅｌｙ　ｈｉｇｈ　ｌｅｖｅｌ　ｏｆ　ｇｅｎｅｔｉｃ　ｄｉｆｆｅｒｅｎ－
ｔｉａｔｉｏｎ　ａｍｏｎｇ　ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ　ｗａｓ　ｒｅｖｅａｌｅｄ　ｂｙ　Ｓｈａｎｎｏｎ’ｓ　ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｍｅａｓｕｒｅ（０．４０４６）ａｎｄ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
ｖａｒｉａｎｃｅ（ＡＭＯＶＡ，０．５０５１）．Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ｔｅｎ　ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ　ｏｆ　Ｖ．ｕｎｉｊｕｇａｈａｄ　ｈｉｇｈ　ｇｅｎｅｔｉｃ　ｄｉ－
ｖｅｒｓｉｔｙ，ｂｕｔ　ａｍｏｎｇ　ｔｈｅ　ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ　ａ　ｃｅｒｔａｉｎ　ｄｅｇｒｅｅ　ｏｆ　ｇｅｎｅｔｉｃ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　ｈａｄ　ｏｃｃｕｒｒｅｄ：ｔｈｅ　ｇｅｎｅｔｉｃ　ｄｉｆｆｅｒｅｎ－
ｔｉａｔｉｏｎ　ａｍｏｎｇ　ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ　ｗａｓ　ｈｉｇｈｅｒ　ｔｈａｎ　ｗｉｔｈｉｎ　ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ．Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｓｕｇｇｅｓｔ　ｔｈａｔ　ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ　ｐｒｅｓｓｕｒｅ
ｈａｓ　ａ　ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ　ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ　ｗｉｔｈ　ｇｅｎｅｔｉｃ　ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ．Ｌｏｗ　ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ　ｐｒｅｓｓｕｒｅ　ｉｎ　Ｙａｎｔａｉ　ａｎｄ　ｈｉｇｈ　ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎ－
９６－１０３
２０１６年９月
　　　草　业　学　报　　　
　　　ＡＣＴＡ　ＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥ　ＳＩＮＩＣＡ　　　
第２５卷　第９期
Ｖｏｌ．２５，Ｎｏ．９
＊ 收稿日期：２０１５－１２－０２；改回日期：２０１６－０１－２６
基金项目：国家自然科学基金项目（３１０７０３５３）资助。
作者简介：陈辉（１９９０－），男，山东临沂人，在读硕士。Ｅ－ｍａｉｌ：ｃｈｅｎｈ２０１３＠ｌｚｕ．ｅｄｕ．ｃｎ
＊通信作者Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ　ａｕｔｈｏｒ．Ｅ－ｍａｉｌ：ｑｗｙ＠ｌｚｕ．ｅｄｕ．ｃｎ
ｔａｌ　ｐｒｅｓｓｕｒｅ　ｉｎ　Ｈｅｚｕｏ　ｒｅｇｉｏｎｓ　ｗｅｒｅ　ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ｈｉｇｈ　ｌｅｖｅｌｓ　ｏｆ　ｇｅｎｅｔｉｃ　ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ，ｂｕｔ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｍｅｄｉｕｍ　ｐｒｅｓｓｕｒｅ
ｒｅｇｉｏｎｓ　ｔｈｅｒｅ　ｗａｓ　ｌｏｗ　ｇｅｎｅｔｉｃ　ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ．Ｔｈｉｓ　ｓｔｕｄｙ　ｓｕｇｇｅｓｔｓ　ａｎ　ｉｍｐｏｒｔａｎｔ　ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ　ｂｅｔｗｅｅｎ　Ｖ．ｕｎｉｊｕｇａｇｅ－
ｎｅｔｉｃ　ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ　ａｎｄ　ｃａｎ　ａｌｓｏ　ｂｅ　ｕｓｅｄ　ａｓ　ａ　ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ　ｆｏｒ　ｗｏｒｋｉｎｇ　ｗｉｔｈ　ｇｅｎｅｔｉｃ　ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ　ａｎｄ
ｂｒｅｅｄｉｎｇ．
Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：Ｖｉｃｉａ　ｕｎｉｊｕｇａ；ＩＳＳＲ；ｇｅｎｅｔｉｃ　ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ；ｇｅｎｅｔｉｃ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ
植物遗传多样性是植物的自然属性之一，是植物在长期进化、发展过程中形成并存在于植物种群之间，或个
体之间的遗传差异。植物遗传多样性对于其在复杂环境条件下生存和发展具有至关重要的作用，是植物物种稳
定性和进化潜力的基础。遗传多样性与植物所处的环境有着密不可分的联系，植物的遗传多样性越丰富，对外界
环境变化的适应能力就越强［１］。因此，作为植物适应多重环境变化的遗传基础，植物遗传多样性研究得到越来越
广泛的重视。Ｒｅｅｄ等［２］证明基因杂合度的丧失会降低植物种群的适合度，现阶段遗传多样性则更多地应用于物
种的保护研究［３］。
歪头菜（Ｖｉｃｉａ　ｕｎｉｊｕｇａ）作为一种天然的优良牧草，广泛分布于东亚地区，在我国的东北、华北、西北以及长
江以南大部分省（区）都有分布。歪头菜适应性强，生长于半湿润气候和微酸性土壤，喜阴湿。在红壤、棕壤、灰化
土甚至瘠薄的沙土均能生长，在南方温暖湿润地区也常有分布［４］。因其适应性强，分布广泛，又是饲草中植物蛋
白的重要来源，因此在土地荒漠化以及草场退化日益严重的背景下，作为优质天然牧草歪头菜受到越来越多研究
的重视［５－７］。关于植物遗传多样性，目前有相当多的研究［８－１０］，但对于歪头菜的遗传多样性和各居群间的遗传关
系以及遗传结构方面的研究鲜见报道。因此，对于歪头菜的遗传多样性的研究对合理利用歪头菜遗传资源及育
种具有非常重要的作用。
简单重复序列间扩增（ｉｎｔｅｒ－ｓｉｍｐｌｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｒｅｐｅａｔ，ＩＳＳＲ）分子标记技术是由加拿大蒙特利尔大学Ｚｉｅｔｋ－
ｉｅｗｉｃｚ等［１１］提出的一种利用聚合酶链式反应 （ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　ｃｈａｉｎ　ｒｅａｃｔｉｏｎ，ＰＣＲ）扩增进行检测的ＤＮＡ分子标记
技术，具有操作简单、重复性好，对ＤＮＡ模板要求低和多态性高等优点［１２］，可以方便快速检测样本间的遗传差异
和遗传多样性［１３－１４］。报道显示该方法已在多种植物的遗传图谱建立、品种鉴定、遗传多样性检测、基因定位和亲
缘关系鉴定中广泛应用［１５－１９］。因此，本研究采用该方法对１０个不同居群的歪头菜进行遗传分析，在分子水平上
探讨其遗传多样性和遗传变异程度，旨在研究歪头菜的遗传分化与其生长地环境的关系。
１　材料与方法
１．１　实验材料与实验过程
实验所用歪头菜种子于２０１４年８－１０月采自不同地区的１０个样点（表１），两个单株之间的距离间隔为２
ｍ。２０１４年１１月选择饱满成熟一致的种子，用浓硫酸浸泡２５ｍｉｎ打破休眠后用清水彻底冲洗除去种子表面残
留硫酸，将去休眠种子植入营养土中萌发生长，每日光照１６ｈ（６：００－２１：００），昼／夜温度为２５℃／１５℃。
１．２　ＤＮＡ的提取
于２０１４年１２月将１０个采样点共１０４个单株歪头菜的幼叶，参照Ｖｏｌｋｏｖ等［２０］ＣＴＡＢ（十六烷基三甲基溴
化铵，ｈｅｘａｄｅｃｙｌ　ｔｒｉｍｅｔｈｙｌ　ａｍｍｏｎｉｕｍ　ｂｒｏｍｉｄｅ）法提取基因组ＤＮＡ。
１．３　ＩＳＳＲ－ＰＣＲ分析
本研究从Ｂｒｉｔｉｓｈ　Ｃｏｌｕｍｂｉａ大学公布的１００条ＩＳＳＲ引物序列中，于２０１４年１２月－２０１５年１月从４０条引
物里筛选出１０条多态性好、条带清晰的引物序列（表２），由上海生工生物有限公司合成；Ｔａｇ　ＤＮＡ 聚合酶、
ｄＮＴＰｓ、ＭｇＣｌ２、１００ｂｐ　ＤＮＡ　ｍａｒｋｅｒ和１０×Ｂｕｆｆｅｒ均购买自甘肃鹏程生物科技发展有限公司。ＰＣＲ反应总体
积为２５．０μＬ，反应体系为：１０×ＰＣＲ　Ｂｕｆｆｅｒ（含 Ｍｇ
２＋）５．０μＬ，２．５Ｕ／μＬ　ｒ　Ｔａｇ　ＤＮＡ 聚合酶０．５μＬ，２．５
ｍｍｏｌ／Ｌ　ｄＮＴＰｓ　４．０μＬ，１０μｍｏｌ／Ｌ引物２．０μＬ，３０ｎｇ／μＬ模板ＤＮＡ　２．０μＬ，用ｄｄＨ２Ｏ补充到２５．０μＬ。ＰＣＲ
反应程序为：９４℃ 预变性２ｍｉｎ，９４℃３０ｓ，４０～５４℃３０ｓ，７２℃２ｍｉｎ，３５个循环，７２℃１０ｍｉｎ。对１０４个样
品扩增，每个引物扩增两次，反应在基因扩增仪（ＢＩＯ－ＲＡＤ　Ｓ１０００ＴＭ　Ｔｈｅｒｍａｌ　Ｃｙｃｌｅｒ美国）上进行。扩增产物用
７９第２５卷第９期 草业学报２０１６年
２％琼脂糖凝胶（含０．５μｇ／ｍＬ　ＥＢ）电泳分离，电泳结果在全自动凝胶成像系统（培清ＪＳ－６８０Ｂ，中国上海）下观察
并拍照，采用Ｇｅｌｐｒｏ　ａｎａｌｙｚｅｒ对结果进行定量分析。
１．４　数据处理
将得到的电泳图用Ｇｅｌｐｒｏ　３２处理后按相同位置上条带的有无进行１，０计数，计数结果以１／０矩阵的形式
输入计算机。利用ＰＯＰＧＥＮＥ　Ｖｅｒｓｉｏｎ　１．３１对得到的矩阵图进行分析处理，利用ＮＴｓｙｓ　２．０构建ＵＰＧＭＡ聚类
图，利用分子方差变异分析（ＡＭＯＶＡ）进行遗传分化系数分析。
在ＰＯＰＧＥＮＥ　Ｖｅｒｓｉｏｎ　１．３１输出报告中查找得到歪头菜各居群的遗传多样性（Ｈｓ）、居群遗传距离（Ｄ）、遗
传一致度（Ｉｎ）、多态位点百分率（ＰＢＢ）、Ｓｈａｎｎｏｎ’ｓ遗传多样性信息指数（Ｉ）、观测等位基因数（Ｎａ）、有效等位基
因数（Ｎｅ）、居群间基因间分化度（Ｇｓｔ）、基因流（Ｎｍ）等。
表１　歪头菜采集点的环境因子
Ｔａｂｌｅ　１　Ｔｈｅ　ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ　ｆａｃｔｏｒｓ　ｏｆ　Ｖ．ｕｎｉｊｕｇａｇｅｏｇｒａｐｈｉｃａｌ　ｏｒｉｇｉｎｓ
采样点
Ｇｅｏｇｒａｐｈｉｃａｌ　ｏｒｉｇｉｎｓ
经纬度
Ｌａｔｉｔｕｄｅ　ａｎｄ　ｌｏｎｇｉｔｕｄｅ
海拔
Ａｌｔｉｔｕｄｅ（ｍ）
降雨量
Ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ（ｍｍ）
年均温度
Ａｎｎｕａｌ　ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ（℃）
土壤ｐＨ
Ｓｏｉｌ　ｐＨ　ｖａｌｕｅ
烟台Ｙａｎｔａｉ　 ３６°４６′０５．４５″Ｎ，１２０°５１′５９．０５″Ｅ　 １００　 ８００　 １１．２　 ５．９
文县 Ｗｅｎｘｉａｎ　 ３２°５６′３８．００″Ｎ，１０４°４１′１２．００″Ｅ　 ２０００　 ６００　 １０．０　 ７．８
榆中Ｙｕｚｈｏｎｇ　 ３５°５５′１９．２４″Ｎ，１０３°５５′２７．２７″Ｅ　 ２０９６　 ５６０　 ４．０　 ７．５
土门关Ｔｕｍｅｎｇｕａｎ　 ３５°２５′１４．２２″Ｎ，１０２°５６′２６．４４″Ｅ　 ２１５７　 ５３７　 ５．９　 ７．４
永登Ｙｏｎｇｄｅｎｇ　 ３６°３９′２４．２７″Ｎ，１０２°４２′４９．０１″Ｅ　 ２３０５　 ４１９　 ７．４　 ７．９
大通Ｄａｔｏｎｇ　 ３６°５６′０３．１７″Ｎ，１０１°４１′３５．１９″Ｅ　 ２４３２　 ５０８　 ４．９　 ７．５
和政 Ｈｅｚｈｅｎｇ　 ３５°１６′５０．１８″Ｎ，１０３°１４′５６．１６″Ｅ　 ２５３４　 ６６０　 ５．１　 ７．８
夏河Ｘｉａｈｅ　 ３５°１３′１７．０６″Ｎ，１０２°４２′０９．２２″Ｅ　 ２６７４　 ５１６　 ２．６　 ７．５
卓尼Ｚｈｕｏｎｉ　 ３４°４６′２５．２５″Ｎ，１０３°０９′３３．０８″Ｅ　 ２８８０　 ５８０　 ４．６　 ７．５
西山坡Ｘｉｓｈａｎｐｏ　 ３４°５８′５０．１９″Ｎ，１０２°５３′３４．５３″Ｅ　 ２９７８　 ５４５　 ２．０　 ７．５
表２　１０个歪头菜居群遗传多样性分析的ＩＳＳＲ引物及其扩增结果
Ｔａｂｌｅ　２　ＩＳＳＲ　ｐｒｉｍｅｒｓ　ｕｓｅｄ　ｉｎ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｇｅｎｅｔｉｃ　ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　ｔｅｎ　Ｖ．ｕｎｉｊｕｇａｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ　ａｎｄ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｒｅｓｕｌｔｓ
引物
Ｐｒｉｍｅｒｓ
序列
Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ
（５′－３′）
退火温度
Ａｎｎｅａｌｉｎｇ　ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ
（℃）
扩增出片段数量
Ｔｏｔａｌ　ｎｕｍｂｅｒ　ｏｆ　ｂａｎｄｓ
ａｍｐｌｉｆｉｅｄ
多态性片段数
Ｎｕｍｂｅｒ　ｏｆ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ
ｂａｎｄｓ
多态性
Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ
（％）
ＵＢＣ８１１ （ＧＡ）８Ｃ　 ５２　 １２　 １２　 １００．００
ＵＢＣ８１５ （ＣＴ）８Ｇ　 ５２　 １０　 １０　 １００．００
ＵＢＣ８１８ （ＣＡ）８Ｇ　 ５２　 １３　 １２　 ９２．３１
ＵＢＣ８２２ （ＴＣ）８Ａ　 ５０　 １２　 １２　 １００．００
ＵＢＣ８４５ （ＣＴ）８ＡＧ　 ５４　 １２　 １１　 ９２．３１
ＵＢＣ８５２ （ＴＣ）８ＡＡ　 ５２　 １２　 １２　 １００．００
ＵＢＣ８５３ （ＴＣ）８ＡＴ　 ５２　 １２　 １１　 ９２．３１
ＵＢＣ８５８ （ＴＧ）８ＡＧ　 ５４　 １１　 １０　 ９０．９１
ＵＢＣ８６４ （ＡＴＧ）６ ４８　 １０　 ９　 ９０．００
ＵＢＣ８６８ （ＧＡＡ）５ ４０　 １１　 １１　 １００．００
总计Ｔｏｔａｌ　 １１５　 １１０
平均Ａｖｅｒａｇｅ　 １１．５　 １１　 ９５．６５
８９ ＡＣＴＡ　ＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥ　ＳＩＮＩＣＡ（２０１６） Ｖｏｌ．２５，Ｎｏ．９
２　结果与分析
２．１　ＤＮＡ提取
提取的ＤＮＡ在０．８％琼脂糖凝胶中表现出明亮清晰的条带，无拖尾现象，且无ＲＮＡ条带的出现，Ａ２６０／Ａ２８０
在１．８～２．０之间，证明提取的ＤＮＡ纯净、完整，可以用于后续实验。
２．２　ＩＳＳＲ扩增
１０条引物对来自１０个居群的１０４个单株进行ＩＳＳＲ扩增（图１），最终共扩增出１１５个ＩＳＳＲ片段，其中１１０
个多态性片段，多态性百分率高达９５．６５％，每条引物扩增出的片段数量在１０～１３之间（表２），平均每条引物扩
增出１１条多态性片段，扩增出的片段大小在１００～１５００ｂｐ之间。
２．３　歪头菜遗传多样性的ＩＳＳＲ扩增结果分析
ＩＳＳＲ扩增结果分析（表３）表明，居群水平平均多态位点百分率（ＰＢＢ）为３７．７５％，其中最高的为烟台
４９．７０％，最低的为官滩沟２４．３５％。居群内遗传多样性（Ｈｓ）在０．０９２６～０．１５８７之间，平均值为０．１２５４。Ｓｈａｎ－
ｎｏｎ’ｓ遗传多样性信息指数（Ｉ）在０．１３６８～０．２４１８之间，平均为０．１９１１。物种水平上多态位点百分率（ＰＢＢ）为
９５．６５％，总的遗传多样性（Ｈｔ）为０．２６３２，Ｓｈａｎｎｏｎ’ｓ（Ｉ）遗传多样性信息指数为０．４０４６。
图１　引物ＵＢＣ８５８对１０个居群１０４个歪头菜样本扩增图谱
Ｆｉｇ．１　Ｒｅｓｕｌｔ　ｏｆ　ＰＣＲ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｕｓｉｎｇ　ｐｒｉｍｅｒ　ＵＢＣ８５８ｏｆ　１０４　Ｖ．ｕｎｉｊｕｇａｓａｍｐｌｅｓ　ｆｒｏｍ　１０ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ
　
表３　１０个歪头菜居群内的遗传多样性分析
Ｔａｂｌｅ　３　Ｇｅｎｅｔｉｃ　ｄｉｖｅｒｓｉｔｉｅｓ　ｆｏｒ　ｔｅｎ　ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ　ｏｆ　Ｖ．ｕｎｉｊｕｇａ
居群
Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ
多态位点百分率
Ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ　ｏｆ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ
ｂａｎｄ（ＰＰＢ，％）
观测等位基因数
Ｏｂｓｅｒｖｅｄ　ｎｕｍｂｅｒ
ｏｆ　ａｌｅｌｅｓ（Ｎａ）
居群内遗传多样性
Ｇｅｎｅ　ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｉｎ　ｓｕｂｄｉｖｉｄｅｄ
ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ（Ｈｓ）
有效等位基因数
Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ　ｎｕｍｂｅｒ
ｏｆ　ａｌｅｌｅｓ（Ｎｅ）
Ｓｈａｎｎｏｎ’ｓ遗传多样性
信息指数Ｓｈａｎｎｏｎ’ｓ
ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｉｎｄｅｘ（Ｉ）
烟台Ｙａｎｔａｉ　 ４９．７０　 １．４８７０（０．５０２０） ０．１５８７（０．０３４９） １．２６０９（０．３３２４） ０．２４１８（０．２７２０）
文县 Ｗｅｎｘｉａｎ　 ４０．００　 １．４０００（０．４９２０） ０．１３６４（０．０３６８） １．２３５８（０．３５６９） ０．２０４５（０．２７５２）
榆中Ｙｕｚｈｏｎｇ　 ２４．３５　 １．２４３５（０．４３１１） ０．０９２６（０．０３０６） １．１６３８（０．３２３３） ０．１３６８（０．２５１８）
土门关Ｔｕｍｅｎｇｕａｎ　 ４０．００　 １．４０００（０．４９２０） ０．１１８９（０．０２９９） １．１９４６（０．３１０１） ０．１９３９（０．２５２５）
永登Ｙｏｎｇｄｅｎｇ　 ３４．８７　 １．３４７８（０．４７８４） ０．１２８８（０．０３７３） １．２２５５（０．３５６５） ０．１９０４（０．２７７３）
大通Ｄａｔｏｎｇ　 ３６．５２　 １．３６５２（０．４８３６） ０．１２５５（０．０３５４） １．２１７６（０．３５０７） ０．１８８０（０．２７０２）
和政 Ｈｅｚｈｅｎｇ　 ３１．３０　 １．３１３０（０．４６５８） ０．１０２７（０．０３０２） １．１７５３（０．３１９８） ０．１５５２（０．２５１５）
夏河Ｘｉａｈｅ　 ３３．０４　 １．３３０４（０．４７２４） ０．０９６０（０．０２５０） １．１５４１（０．２８００） ０．１４９８（０．２３４３）
卓尼Ｚｈｕｏｎｉ　 ４２．６１　 １．４２６１（０．４９６７） ０．１３９５（０．０３２３） １．２２６７（０．３１５８） ０．２１３３（０．２６４８）
西山坡Ｘｉｓｈａｎｐｏ　 ４６．０９　 １．４６０９（０．５００６） ０．１５５０（０．０３６７） １．２６１７（０．３５２６） ０．２３４４（０．２７６５）
平均Ａｖｅｒａｇｅ　 ３７．７５　 １．３７７４（０．４８２０） ０．１２５４（０．０３３２） １．２１２６（０．３３０１） ０．１９１１（０．２６３１）
物种水平Ｓｐｅｃｉｅｓ　ｌｅｖｅｌ　 ９５．６５　 １．９５６５（０．２０４８） ０．２６３２（０．１７５４） １．４３８２（０．３４８９） ０．４０４６（０．２３３５）
　注：括号内的为标准偏差。
　Ｎｏｔｅ：Ａｓ　ｔｈｅ　ｓｔａｎｄａｒｄ　ｄｅｖｉａｔｉｏｎ　ｉｎ　ｐａｒｅｎｔｈｅｓｅｓ．
９９第２５卷第９期 草业学报２０１６年
利用ＰＯＰＧＥＮＥ　Ｖｅｒｓｉｏｎ　１．３１计算各居群间的遗传距离和遗传一致度（表４），利用ＮＴｓｙｓ　２．０构建居群间
ＵＰＧＭＡ聚类图（图２），进一步分析居群间的遗传分化程度。１０个居群间的遗传距离变化范围从０．０７１４～
０．２８４５，和政和榆中的遗传距离最小，为０．０７１４，土门关和永登的遗传距离最大，为０．２８４５。１０个居群间遗传一
致度的变化范围为０．７５２４～０．９３１１，其中土门关和永登的遗传一致度最小，为０．７５２４，和政和榆中的遗传一致度
最大，为０．９３１１。在遗传距离为０．１９处分为５类，夏河、大通、西山坡、和政、土门关、永登聚为一类，卓尼／榆中／
烟台／文县各自归为一类，从遗传距离和聚类分析图谱可以看出居群间已经发生了较高程度的遗传分化。
分子方差变异ＡＭＯＶＡ分析结果（表５）表明，５０．５１％变异发生在居群间，与居群间分化度Ｇｓｔ为０．５２８３，
表明有５２．８３％的变异发生在居群间，两种方法分析结果相一致，同时，基因流Ｎｍ为０．４５５３，Ｎｍ＜１也进一步
表明了居群间的遗传分化。因此，多个数据均显示这１０个歪头菜自然居群间存在较高程度的遗传分化。
将不同环境因素进行主成分分析发现第一主成分占所有主成分的９８％，而海拔因素对第一主成分的贡献远
高于其他因素，因此，歪头菜遗传多样性与环境因素的关系可以降维为歪头菜遗传多样性与海拔因素的关系，因
表４　歪头菜１０个居群间的Ｎｅｉ’ｓ遗传一致度和遗传距离
Ｔａｂｌｅ　４　Ｎｅｉ’ｓ　ｇｅｎｅｔｉｃ　ｉｄｅｎｔｉｔｙ　ａｎｄ　ｇｅｎｅｔｉｃ　ｄｉｓｔａｎｃｅ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ｔｅｎ　ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ　ｏｆ　Ｖ．ｕｎｉｊｕｇａ
居群
Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ
夏河
Ｘｉａｈｅ
和政
Ｈｅｚｈｅｎｇ
榆中
Ｙｕｚｈｏｎｇ
卓尼
Ｚｈｕｏｎｉ
西山坡
Ｘｉｓｈａｎｐｏ
土门关
Ｔｕｍｅｎｇｕａｎ
文县
Ｗｅｎｘｉａｎ
永登
Ｙｏｎｇｄｅｎｇ
大通
Ｄａｔｏｎｇ
烟台
Ｙａｎｔａｉ
夏河Ｘｉａｈｅ ＊＊＊＊ ０．８７７２　 ０．８７９６　 ０．７９７７　 ０．７７６５　 ０．８１８９　 ０．７９１０　 ０．７７６６　 ０．７６２４　 ０．７８５０
和政 Ｈｅｚｈｅｎｇ　 ０．１３１０ ＊＊＊＊ ０．９３１１　 ０．８５３６　 ０．８２９４　 ０．８０９８　 ０．８７３３　 ０．８０２７　 ０．８１２３　 ０．８５５３
榆中Ｙｕｚｈｏｎｇ　 ０．１２８２　 ０．０７１４ ＊＊＊＊ ０．８４９１　 ０．８３３７　 ０．８２１１　 ０．８３９６　 ０．８２３２　 ０．８２４２　 ０．８３７６
卓尼Ｚｈｕｏｎｉ　 ０．２２６１　 ０．１５８３　 ０．１６３６ ＊＊＊＊ ０．８７６６　 ０．８８７１　 ０．８７４３　 ０．８０２８　 ０．８０８５　 ０．８４２４
西山坡Ｘｉｓｈａｎｐｏ　 ０．２５３０　 ０．１８７１　 ０．１８１８　 ０．１３１７ ＊＊＊＊ ０．８５５５　 ０．８６１７　 ０．７９１５　 ０．８１７９　 ０．８５１３
土门关Ｔｕｍｅｎｇｕａｎ　 ０．１９９８　 ０．２１１０　 ０．１９７１　 ０．１１９８　 ０．１５６１ ＊＊＊＊ ０．８３６５　 ０．７５２４　 ０．７７６２　 ０．８１０９
文县 Ｗｅｎｘｉａｎ　 ０．２３４５　 ０．１３５４　 ０．１７４９　 ０．１３４４　 ０．１４８８　 ０．１７８６ ＊＊＊＊ ０．８３４５　 ０．８６９９　 ０．８９８０
永登Ｙｏｎｇｄｅｎｇ　 ０．２５２９　 ０．２１９７　 ０．１９４５　 ０．２１９７　 ０．２３３８　 ０．２８４５　 ０．１８１０ ＊＊＊＊ ０．８４８６　 ０．８８６６
大通Ｄａｔｏｎｇ　 ０．２７１３　 ０．２０７９　 ０．１９３４　 ０．２１２６　 ０．２０１０　 ０．２５３３　 ０．１３９４　 ０．１６４２ ＊＊＊＊ ０．８４９９
烟台Ｙａｎｔａｉ　 ０．２４２１　 ０．１５６４　 ０．１７７２　 ０．１７１４　 ０．１６１０　 ０．２０９６　 ０．１０７６　 ０．１２０３　 ０．１６２７ ＊＊＊＊
　注：对角线上方是遗传一致度，对角线下方是遗传距离。
　Ｎｏｔｅ：Ｎｅｉ’ｓ　ｇｅｎｅｔｉｃ　ｉｄｅｎｔｉｔｙ（ａｂｏｖｅ　ｄｉａｇｏｎａｌ）ａｎｄ　ｇｅｎｅｔｉｃ　ｄｉｓｔａｎｃｅ（ｂｅｌｏｗ　ｄｉａｇｏｎａｌ）．
图２　歪头菜１０个居群间基于Ｎｅｉ’ｓ遗传距离的ＵＰＧＭＡ聚类图
Ｆｉｇ．２　ＵＰＧＭＡ　ｄｅｎｄｒｏｇｒａｍ　ｆｏｒ　ｔｅｎ　ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ　ｏｆ　Ｖ．ｕｎｉｊｕｇａｂａｓｅｄ　ｏｎ　Ｎｅｉ’ｓ　ｇｅｎｅｔｉｃ　ｄｉｓｔａｎｃｅ
００１ ＡＣＴＡ　ＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥ　ＳＩＮＩＣＡ（２０１６） Ｖｏｌ．２５，Ｎｏ．９
此按海拔因素将１０个采样点分为３个类型：低环境压力地区（烟台、文县），中等环境压力地区（榆中、土门关、永
登、大通、和政、夏河）和高环境压力地区（西山坡、卓尼）。基于不同环境压力下遗传多样性的方差分析（表６）结
果显示０．０１＜Ｐ＜０．０５，并且Ｆ＞Ｆ－ｃｒｉｔ说明不同地区间的遗传多样性随环境压力的不同具有显著的差异性。
表５　歪头菜居群内和居群之间分子方差变异的ＡＭＯＶＡ分析
Ｔａｂｌｅ　５　Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｖａｒｉａｎｃｅ（ＡＭＯＶＡ）ｗｉｔｈｉｎ／ａｍｏｎｇ　Ｖ．ｕｎｉｊｕｇａｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ
变异来源
Ｓｏｕｒｃｅ　ｏｆ　ｖａｒｉａｔｉｏｎ
自由度
ｄｆ
总方差
Ｓｕｍ　ｏｆ　ｓｑｕａｒｅｓ
平均方差
Ｍｅａｎ　ｓｑｕａｒｅｓ
变异组分
Ｖａｒｉａｎｃｅ　ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ
总变异百分率
Ｔｏｔａｌ　ｖａｒｉａｎｃｅ（％）
Ｐ－值
Ｐ－ｖａｌｕｅ
居群内变异Ｖａｒｉａｎｃｅ　ｗｉｔｈｉｎ　ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ　 ７０　 ６４１．０００　 ９．１５７　 ９．１５７　 ４９．４９ ＜０．００１０
居群间变异Ｖａｒｉａｎｃｅ　ａｍｏｎｇ　ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ　 ９　 ７５５．２７５　 ８３．９１９　 ９．３４５　 ５０．５１ ＜０．００１０
表６　不同环境压力下遗传多样性的方差分析
Ｔａｂｌｅ　６　Ｇｅｎｅｔｉｃ　ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｖａｒｉａｎｃｅ　ｕｎｄｅｒ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ　ｐｒｅｓｓｕｒｅ
差异源
Ｓｏｕｒｃｅ　ｏｆ　ｖａｒｉａｔｉｏｎ
总方差
Ｓｕｍ　ｏｆ　ｓｑｕａｒｅｓ
自由度
ｄｆ
平均方差
Ｍｅａｎ　ｓｑｕａｒｅｓ
Ｆ－值
Ｆ－ｖａｌｕｅ
Ｐ－值
Ｐ－ｖａｌｕｅ
Ｆ－临界值
Ｃｒｉｔｉｃａｌ　ｖａｌｕｅｓ　ｏｆ　Ｆ（Ｆ－ｃｒｉｔ）
组间Ａｍｏｎｇ　ｇｒｏｕｐｓ　 ３０４．１８　 ２　 １５２．０９　 ５．４６０１８７　 ０．０３７２５　 ４．７３７４１４
组内Ｉｎｔｒａ－ｇｒｏｕｐ　 １９４．９８０５　 ７　 ２７．８５４３６
总计Ｔｏｔａｌ　 ４９９．１６０６　 ９
３　讨论
本研究表明，虽然歪头菜在物种水平上具有较高的遗传多样性，但在居群内其遗传多样性较低。歪头菜居群
分布呈片段化，居群规模比较小，居群内的随机遗传漂变可对等位基因频率产生重大影响，进而对等位基因的随
机固定或丢失产生影响［２１－２２］。由于歪头菜是近交占优势的物种，靠近交维持的种群由于近交衰退也导致繁殖适
合度下降［２３］，抵抗外来入侵和环境变化的能力大大降低，又会引起居群遗传多样性的丧失［２４］。各居群间的基因
分化程度（Ｇｓｔ）和分子方差变异ＡＭＯＶＡ分析均表明歪头菜各居群间的遗传分化大于居群内的遗传分化，Ｎｅｉ’ｓ
遗传距离ＵＰＧＭＡ聚类图中也表明１０个居群间已经发生了较高度的遗传分化。这是因为歪头菜是近交为主的
物种，其遗传多样性主要存在于居群之间［２５］，同时，克隆繁殖作为歪头菜的主要繁殖方式之一，也是导致居群间
发生遗传分化的重要原因［２６］，Ｅｌｓｔｒ等［２７］指出，克隆植物居群，特别是当居群间基因流存在较大障碍时，其居群
间遗传变异占总遗传变异的比例会大为增加。
不同环境压力下遗传多样性结果显示，歪头菜在较大环境压力下（如合作）或温和环境条件下（如烟台）都具
有较高的遗传多样性，而处于二者之间的环境条件下，其遗传多样性则处于较低水平，表明环境压力差异对歪头
菜的遗传多样性具有较大的影响。因此，推测在不同的环境压力下歪头菜可能发生了进化分异，但驱动其进化的
模式或有不同。自然界中的多数分子突变是中性或近中性的［２８］，而烟台和文县的气候温和，降水较多，对歪头菜
的生长十分有利，居群数量较多，因环境的选择压力小，歪头菜居群在世代交替过程中产生的遗传变异大多被保
留了下来，从而使这一地区遗传多样性保存丰富。正如Ｔａｋａｈａｔａ［２９］的研究同样指出，有效个体数量越多、自然选
择压力越小的居群其遗传多样性越高。而西山坡和卓尼地区海拔高、气候寒冷，紫外线辐射强，环境压力非常大，
居群数量较小。然而，强的选择压力可能会导致歪头菜产生适应性的变异，使歪头菜的居群维持较高的遗传多样
性。这符合Ｌｅｖｉｎｓ［３０］建立的生态位宽度变异假设模型（环境幅度模型）的解释，即分子遗传变异与环境变异相
关，高水平的遗传变异是植物响应显著异质环境的适应策略。Ｎｅｖｏ［３１］通过论证植物种群分子水平的变异与环境
的关系，支持了生态位宽度变异假说。强维亚等［７］提出的高寒植物经过长期自然选择和适应形成的对当地极端
环境的应激响应机制，同样得到该理论支持。本研究中，生活在环境压力大和小的地区的歪头菜虽然都表现出了
相对较高的遗传多样性，但它们可能是出自于不同的选择机制。低环境压力下保留了更多的中性变异，而高环境
１０１第２５卷第９期 草业学报２０１６年
压力则产生更多的适应性变异，中等环境压力一方面对中性变异具有一定选择性，同时由于不属于显著异质环
境，环境压力不足以使歪头菜产生适应性的突变。
４　结论
研究显示，歪头菜在物种水平上具有较高的遗传多样性，但多发生在居群间，而在居群内其遗传多样性相对
较低。分析表明居群间已经发生了较高程度的遗传分化。将１０个歪头菜自然居群按生境的环境压力分为低、
中、高３个层次，不同生境下歪头菜的遗传多样性结果显示，随着环境压力的增加，歪头菜遗传多样性呈高－低－
高的趋势，推测这种变化是缘于不同环境压力的选择机制，使得歪头菜不同居群间可能发生了进化分异。
Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓ：
［１］　Ｂｏｏｙ　Ｇ，Ｈｅｎｄｒｉｋｓ　Ｒ　Ｊ　Ｊ，Ｓｍｕｌｄｅｒｓ　Ｍ　Ｊ　Ｍ，ｅｔ　ａｌ．Ｇｅｎｅｔｉｃ　ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｓｕｒｖｉｖａｌ　ｏｆ　ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ．Ｐｌａｎｔ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，２０００，
２（４）：３７９－３９５．
［２］　Ｒｅｅｄ　Ｄ　Ｈ，Ｂｒｉｓｃｏｅ　Ｄ　Ａ，Ｆｒａｎｋｈａｍ　Ｒ．Ｉｎｂｒｅｅｄｉｎｇ　ａｎｄ　ｅｘｔｉｎｃｔｉｏｎ：Ｔｈｅ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ　ｓｔｒｅｓｓ　ａｎｄ　ｌｉｎｅａｇｅ．Ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎ
Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２００２，３（３）：３０１－３０７．
［３］　Ｋａｈｉｌａｉｎｅｎ　Ａ，Ｐｕｕｒｔｉｎｅｎ　Ｍ，Ｋｏｔｉａｈｏ　Ｊ　Ｓ．Ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎ　ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ　ｏｆ　ｓｐｅｃｉｅｓ－ｇｅｎｅｔｉｃ　ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎｓ．Ｇｌｏｂａｌ　Ｅｃｏｌｏｇｙ　＆
Ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎ，２０１４，２：３１５－３２３．
［４］　Ｚｈａｎｇ　Ｃ　Ｑ，Ｇｕ　Ｍ．Ａ　ｓｕｐｅｒｉｏｒ　ｑｕａｌｉｔｙ　ｗｉｌｄ　ｆｏｒａｇｅ　ｓｐｅｃｉｅｓ　ｉｎ　Ｇｕｉｚｈｏｕ－Ｖｉｃｉａ　ｕｎｉｊｕｇａ．Ｇｕｉｚｈｏｕ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１９９８，
２６（３）：６３．
［５］　Ｓｈｅｎ　Ｚ　Ｗ，Ｎａｎ　Ｚ　Ｂ．Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ　ａｌｏｃａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ　ｙｉｅｌｄ　ｏｆ　Ｖｉｃｉａ　ｕｎｉｊｕｇａａｔ　Ｇａｎｎａｎ　Ｔｉｂｅｔａｎ　ｒｅｇｉｏｎ．Ａｃｔａ　Ｐｒａｔａｃｕｌ－
ｔｕｒａｅ　Ｓｉｎｉｃａ，２０１５，２４（４）：１３２－１３９．
［６］　Ｈａｎ　Ｙ，Ｑｉａｎｇ　Ｗ　Ｙ．Ｕｓｉｎｇ　ＳＭＡＲＴ　ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　ｂｕｉｌｄ　Ｖｉｃｉａ　ｕｎｉｊｕｇａｆｕｌ　ｌｅｎｇｔｈ　ｃＤＮＡ　ｌｉｂｒａｒｙ．Ｐｒａｔａｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１４，
３１（１）：８３－８８．
［７］　Ｑｉａｎｇ　Ｗ　Ｙ，Ｃａｉ　Ｌ　Ｈ，Ｈａｎ　Ｙ，ｅｔ　ａｌ．Ｃｈａｎｇｅｓ　ｏｆ　ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ　ｈｏｒｍｏｎｅｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｓｔｒｅｓｓ－ｒｅｓｐｏｎｓｅ　ｏｆ　ａｌｐｉｎｅ　ｐｌａｎｔ　Ｖｉｃｉａ　ｕｎｉｊｕｇａＡ．
Ｂｒ．ｔｏ　ｅｎｈａｎｃｅｄ　ＵＶ－Ｂ　ｒａｄｉａｔｉｏｎ．Ａｃｔａ　Ｂｏｔａｎｉｃａ　Ｂｏｒｅａｌｉ－Ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉａ　Ｓｉｎｉｃａ，２０１３，３３（１１）：２２４１－２２４８．
［８］　Ｑｉａｎｇ　Ｈ　Ｐ，Ｙｕ　Ｇ　Ｈ，Ｌｉｕ　Ｈ　Ｑ，ｅｔ　ａｌ．Ｇｅｎｅｔｉｃ　ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ　ａｎｄ　ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ　ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ　ｏｆ　Ｃｈｉｎｅｓｅ　ａｎｄ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　ａｌｆａｌｆａ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ
ｓａｔｉｖａ　Ｌ）ｇｅｒｍｐｌａｓｍ　ａｓｓｅｓｓｅｄ　ｂｙ　ＳＳＲ　ｍａｒｋｅｒｓ．Ｓｃｉｅｎｔｉａ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａ　Ｓｉｎｉｃａ，２０１４，４７（１４）：２８５３－２８６２．
［９］　Ｎａｖａｓｃｕéｓ　Ｍ，Ｅｍｅｒｓｏｎ　Ｂ　Ｃ．Ｎａｔｕｒａｌ　ｒｅｃｏｖｅｒｙ　ｏｆ　ｇｅｎｅｔｉｃ　ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｂｙ　ｇｅｎｅ　ｆｌｏｗ　ｉｎ　ｒｅｆｏｒｅｓｔｅｄ　ａｒｅａｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｅｎｄｅｍｉｃ　Ｃａｎａｒｙ　Ｉｓ－
ｌａｎｄ　ｐｉｎｅ，Ｐｉｎｕｓ　ｃａｎａｒｉｅｎｓｉｓ．Ｆｏｒｅｓｔ　Ｅｃｏｌｏｇｙ　＆ Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ，２００８，２４４（１－３）：１２２－１２８．
［１０］　Ｓｉｖａｋｕｍａｒ　Ｔ，Ｈａｙａｓｈｉｄａ　Ｋ，Ｓｕｇｉｍｏｔｏ　Ｃ，ｅｔ　ａｌ．Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｇｅｎｅｔｉｃ　ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｔｈｅｉｌｅｒｉａ．Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　＆Ｅｖｏｌｕ－
ｔｉｏｎ，２０１４，２７：２５０－２６３．
［１１］　Ｚｉｅｔｋｉｅｗｉｃｚ　Ｅ，Ｒａｆａｌｓｋｉ　Ａ，Ｌａｂｕｄａ　Ｄ．Ｇｅｎｏｍｅ　ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔｉｎｇ　ｂｙ　ｓｉｍｐｌｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｒｅｐｅａｔ（ＳＳＲ）ａｎｃｈｏｒｅｄ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　ｃｈａｉｎ　ｒｅ－
ａｃｔｉｏｎ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，１９９４，２０：１７６．
［１２］　Ｗａｎｇ　Ｊ　Ｂ．ＩＳＳＲ　ｍａｒｋｅｒｓ　ａｎｄ　ｔｈｅｉｒ　ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ　ｉｎ　ｐｌａｎｔ　ｇｅｎｅｔｉｃｓ．Ｈｅｒｅｄｉｔａｓ，２００２，２４（５）：６１３－６１６．
［１３］　Ｈａｏ　Ｇ，Ｌｅｅ　Ｄ　Ｈ，Ｌｅｅ　Ｊ　Ｓ，ｅｔ　ａｌ．Ａ　ｓｔｕｄｙ　ｏｆ　ｔａｘｏｎｏｍｉｃａｌ　ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ　ａｍｏｎｇ　ｓｐｅｃｉｅｓ　ｏｆ　Ｋｏｒｅａｎ　Ａｌｉｕｍ　ｓｅｃｔ．Ｓａｃｃｕ－ｌｉｆｅ　ｒｕｍ
（Ａｌｌｉａｃｅａｅ）ａｎｄ　ｒｅｌａｔｅｄ　ｓｐｅｃｉｅｓ　ｕｓｉｎｇ　ｉｎｔｅｒ　ｓｉｍｐｌｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｒｅｐｅａｔ（ＩＳＳＲ）ｍａｒｋｅｒｓ．Ｂｏｔａｎｉｃａｌ　Ｂｕｌｅｔｉｎ　ｏｆ　Ａｃａｄｅｍｉａ　Ｓｉｎｉｃａ，
２００２，４３：６３－６８．
［１４］　Ｐａｎａｕｄ　Ｏ，Ｃｈｅｎ　Ｘ，Ｍｃｃｏｕｃｈ　Ｓ　Ｒ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ｏｆ　ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｉｔｅ　ｍａｒｋｅｒｓ　ａｎｄ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｓｉｍｐｌｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｌｅｎｇｔｈ　ｐｏｌｙ－
ｍｏｒｐｈｉｓｍ（ＳＳＬＰ）ｉｎ　ｒｉｃｅ（Ｏｒｙｚａ　ｓａｔｉｖａ　Ｌ．）．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　＆ｇｅｎｅｒａｌ　ｇｅｎｅｔｉｃｓ：ＭＧＧ，１９９６，２５２（５）：５９７－６０７．
［１５］　Ｌｉｕ　Ｈ，Ｍｕ　Ｐ，Ｚｈａｏ　Ｇ　Ｑ．Ａ　ｓｔｕｄｙ　ｏｎ　ｇｅｎｅｔｉｃ　ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ａｖｅｎａｇｅｒｍｐｌａｓｍ　ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ　ｄｅｔｅｃｔｅｄ　ｂｙ　ＩＳＳＲ．Ａｃｔａ　Ｐｒａｔａｃｕｌｔｕｒａｅ
Ｓｉｎｉｃａ，２０１２，２１（４）：１１６－１２４．
［１６］　Ｌｉ　Ｘ　Ｐ，Ｇｕｏ　Ｓ，Ｘｉｏｎｇ　Ｊ　Ｆ，ｅｔ　ａｌ．Ｇｅｎｅｔｉｃ　ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｅｎｄａｎｇｅｒｅｄ　Ｈａｎｄｅｌｉｏｄｅｎｄｒｏｎ　ｂｏｄｉｎｉｅｒｉ　ｉｎ　Ｇｕａｎｇｘｉ　Ｐｒｏｖｉｎｃｅ　ｂｙ　ＩＳ－
ＳＲ　ａｎｄ　ＳＲＡＰ　ａｎａｌｙｓｉｓ．Ａｃｔａ　Ｈｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒａｅ　Ｓｉｎｉｃａ，２０１５，４２（２）：３８６－３９４．
［１７］　Ｄｏｎｇ　Ｙ，Ｄｏｎｇ　Ｋ，Ｔａｎｇ　Ｌ，ｅｔ　ａｌ．Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ｒｈｉｚｏｓｐｈｅｒｅ　ｍｉｃｒｏｂｉａｌ　ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ　ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ　ａｎｄ　ｆａｂａ　ｂｅａｎ
ｆｕｓａｒｉｕｍ　ｗｉｌｔ　ｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅ　ｉｎ　ｗｈｅａｔ　ａｎｄ　ｆａｂａ　ｂｅａｎ　ｉｎｔｅｒｃｒｏｐｐｉｎｇ　ｓｙｓｔｅｍ．Ａｃｔａ　Ｅｃｏｌｏｇｉｃａ　Ｓｉｎｉｃａ，２０１３，３３（２３）：７４４５－７４５４．
［１８］　Ｌｉｎ　Ｌ，Ｈｕ　Ｚ　Ｙ，Ｎｉ　Ｓ，ｅｔ　ａｌ．Ｇｅｎｅｔｉｃ　ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｃａｍｅｌｌｉａ　ｊａｐｏｎｉｃａ（Ｔｈｅａｃｅａｅ），ａ　ｓｐｅｃｉｅｓ　ｅｎｄａｎｇｅｒｅｄ　ｔｏ　Ｅａｓｔ　Ａｓｉａ，ｄｅｔｅｃｔｅｄ
ｂｙ　ｉｎｔｅｒ－ｓｉｍｐｌｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｒｅｐｅａｔ（ＩＳＳＲ）．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃｓ　＆Ｅｃｏｌｏｇｙ，２０１３，５０（２）：１９９－２０６．
［１９］　Ｊａｂｂａｒｚａｄｅｈ　Ｚ，Ｋｈｏｓｈ－Ｋｈｕｉ　Ｍ，Ｓａｌｅｈｉ　Ｈ，ｅｔ　ａｌ．Ｉｎｔｅｒ　ｓｉｍｐｌｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｒｅｐｅａｔ（ＩＳＳＲ）ｍａｒｋｅｒｓ　ａｓ　ｒｅｐｒｏｄｕｃｉｂｌｅ　ａｎｄ　ｓｐｅｃｉｆｉｃ
ｔｏｏｌｓ　ｆｏｒ　ｇｅｎｅｔｉｃ　ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｒｏｓｅ　ｓｐｅｃｉｅｓ．Ａｆｒｉｃａｎ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１０，９（３７）：６０９１－６０９５．
［２０］　Ｖｏｌｋｏｖ　Ｙ　Ｇ，Ｋａｋａｒｅｋａ　Ｎ　Ｎ，Ｋｏｚｌｏｖｓｋａｙａ　Ｚ　Ｎ，ｅｔ　ａｌ．Ｎｅｗ　ｓｔｒａｉｎ　ｏｆ　Ｖｉｃｉａ　ｕｎｉｊｕｇａｍｏｓａｉｃ　ｖｉｒｕｓ　ｒｅｖｅａｌｅｄ　ｉｎ　ｔｈｅ　Ａｍｕｒ　ｏｂｌａｓｔ．
Ｒｕｓｓｉａｎ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，２００９，３５（１）：３２－３６．
２０１ ＡＣＴＡ　ＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥ　ＳＩＮＩＣＡ（２０１６） Ｖｏｌ．２５，Ｎｏ．９
［２１］　Ｆｒａｎｋｈａｍ，Ｒｉｃｈａｒｄ．Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ　ｏｆ　ｇｅｎｅｔｉｃ　ｖａｒｉａｔｉｏｎ　ｔｏ　ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ　ｓｉｚｅ　ｉｎ　ｗｉｌｄｌｉｆｅ．Ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９９６，１０（６）：
１５００－１５０８．
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３０１第２５卷第９期 草业学报２０１６年