全 文 ：［收稿日期］ 20130713(004)
［基金项目］ 赵永恒，硕士，从事药物新剂型与新技术研究，Tel:13751764885，E-mail:yonghengzhao@ 126． com
［通讯作者］ * 周毅生，教授，从事药物新剂型与新技术研究，Tel:020-39352168，E-mail:yishzhou@ aliyun． com
星点设计-效应面法优化龙须藤提取工艺
赵永恒，周毅生* ，王嵩，林丽微
(广东药学院，广州 510006)
［摘要］ 目的:优选龙须藤的提取工艺。方法:以乙醇体积分数、液料比、提取时间为自变量，浸膏得率、3，4，5，5，7-五
甲氧基黄酮(黄酮 1)和 3，4-亚甲二氧基-5，5，6，7-四甲氧基黄酮(黄酮 2)含量的总评“归一值”为因变量，通过 Design-Expert
7. 0. 0 软件对自变量各水平进行多元线性回归和二项式拟合，利用效应面法优选提取工艺并进行预测分析。采用 HPLC测定
黄酮 1 和黄酮 2 含量，色谱条件为流动相乙腈(A)-水(B)洗脱梯度(0 ～ 20 min，30% ～40% A;20 ～ 36 min，40% ～48% A)，检
测波长 324 nm。结果:二项式拟合的复合相关系数较高，总评“归一值”达 0. 995 6;最佳提取工艺为加 14 倍量 45%乙醇提取 2
次，每次 116 min;黄酮 1 和黄酮 2 的质量分数依次为 0. 046%，0. 027%，浸膏得率 21. 21%。结论:利用星点设计-效应面法优
化的龙须藤提取工艺稳定简便，具有良好的预测性。
［关键词］ 龙须藤;提取工艺;星点设计-效应面法;浸膏得率;3，4，5，5，7-五甲氧基黄酮;3，4-亚甲二氧
基-5，5，6，7-四甲氧基黄酮
［中图分类号］ Ｒ283. 6 ［文献标识码］ A ［文章编号］ 1005-9903(2014)06-0036-04
［doi］ 10． 11653 /syfj2014060036
Optimization of Extraction Technology for Bauhinia championi by
Central Composite Design-Ｒesponse Surface Methodology
ZHAO Yong-heng，ZHOU Yi-sheng* ，WANG Song，LIN Li-wei
(Guangdong Pharmaceutical University，Guangzhou 510006，China)
［Abstract］ Objective:To optimize extraction process of Bauhinia championi． Method:Taking ethanol
concentration，ratio of material to liquid and reflux time as independent variables，overall desirability of dry extract
yield，contents of 3，4，5，5，7-pentamethoxyflavone (flavonoids 1)and 3，4-methylenedioxy-5，5，6，
7-tetramethoxyflavone (flavonoids 2)as dependent variable，data of overall desirabilities were fitted to a second-
order polynomial equation and regressed by multiple linear，response surface methodology was used to optimize
extraction technology and predictive analyze． HPLC was adopted to determine contents of flavonoids 1 and
flavonoids 2 with mobile phase of acetonitrile (A)-water (B)gradient elution (0-20 min，30% -40%A;20-36
min，40% -48%A)and detection wavelength of 324 nm． Ｒesult:Complex correlation coefficient of binomial
fitting was higher with overall desirability of 0. 995 6;Optimal extraction technology was as following:extracted 2
times with 14-fold the amount of 45% ethanol，116 min per time;The mass fractions of flavonoids 1 and
flavonoids 2 were 0. 046% and 0. 027%，dry extract yield was 21. 21% ． Conclusion:Central composite design-
response surface methodology was convenient and highly predictive for optimizing extraction technology of B．
championi．
［Key words］ Bauhinia championi;extraction technology;central composite design-response surface
methodology;dry extract yield;3，4，5，5，7-pentamethoxyflavone;3，4-methylenedioxy-5，5，6，
7-tetramethoxyflavone
·63·
第 20 卷第 6 期
2014 年 3 月
中国实验方剂学杂志
Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae
Vol． 20，No． 6
Mar．，2014
龙须藤别名九龙藤［1］、蝴蝶藤等，性平，味苦
辛，无毒，具有祛风除湿、活血止痛、健脾理气的功
效，临床用于治疗风湿性关节炎、腰腿疼、跌打损伤、
胃痛、小儿疳积等症［2］，主要含有黄酮类、原花青素
类、糖类、挥发油及没食子酸等成分［3-6］。现代药理
研究表明黄酮类化合物具有较强的镇痛抗炎［7-9］、
抗血小板凝集［10］等活性。前期研究证实 3，4，5，
5，7-五甲氧基黄酮和 3，4-亚甲二氧基-5，5，6，7-四
甲氧基黄酮具有较好的抗炎镇痛作用，故本实验选
择二者提取率和浸膏得率为综合评价指标，采用星
点设计-效应面法优化龙须藤的提取工艺，为龙须藤
的合理利用与制剂开发提供参考。
1 材料
2695-2996 型高效液相色谱仪(美国 Waters 公
司) ，AY120 型电子天平(日本岛津) ，LG-04 型中药
粉碎机(瑞安市百信药机器械厂) ，GZX-9240 型数
显鼓风干燥箱(上海博迅实业有限公司医疗设备
厂)。
龙须藤药材购于广东清平药材市场，经广东药
学院生药教研室李书渊教授鉴定为豆科羊蹄甲属植
物龙须藤 Bauhinia championi (Benth．)Benth． 的干
燥藤茎;3，4，5，5，7-五甲氧基黄酮和 3，4-亚甲二
氧基-5，5，6，7-四甲氧基黄酮对照品(自制，面积归
一化法计算纯度均为 98. 0%) ，水为屈臣氏蒸馏水，
乙腈为色谱纯，其他试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2. 1 2 种黄酮类成分的含量测定
2. 1. 1 色谱条件 Phenomenex Luna C18色谱柱
(4. 6 mm ×150 mm，5 μm) ，流动相乙腈(A)-水(B)
洗脱梯度(0 ～ 20 min，30% ～ 40% A;20 ～ 36 min，
40% ～48% A) ，流速 1. 0 mL·min －1，检测波长 324
nm，柱温 30 ℃，进样量 10 μL。
2. 1. 2 对照品溶液的制备 精密称定 3，4，5，5，
7-五甲氧基黄酮(黄酮 1)11. 16 mg 和 3，4-亚甲二
氧基-5，5，6，7-四甲氧基黄酮(黄酮 2)9. 84 mg，分
别加甲醇定容至 10 mL 量瓶中。精密量取前者
3 mL和后者 1. 5 mL置于 100 mL 量瓶中，加甲醇定
容，制成 33. 48，14. 76 mg·L －1的混合对照品溶液。
2. 1. 3 龙须藤浸膏的制备 称取龙须藤药材适量，
置圆底烧瓶中，加入一定体积分数乙醇回流提取一
定时间，过滤，减压回收乙醇，于 105 ℃干燥至恒重，
即得。
2. 1. 4 供试品溶液的制备 精密称取龙须藤浸膏
0. 5 g置于 50 mL量瓶中，加适量甲醇超声溶解并定
容至刻度，摇匀，过 0. 45 μm 微孔滤膜，取续滤液，
即得。
2. 1. 5 线性关系的考察 精密量取混合对照品溶
液 2，5，10，15，20，25 μL，分别按 2. 1. 1 项下色谱条
件测定，以进样量为横坐标，峰面积为纵坐标，得黄
酮 1 和黄酮 2 的回归方程依次为 Y = 3 184. 5X －
99 744(Ｒ2 = 0. 999 9) ，Y = 3 521. 2X － 23 071(Ｒ2 =
0. 999 9) ，线性范围分别为 66. 96 ～ 837，29. 52 ～
369 ng。
2. 1. 6 精密度试验 取混合对照品溶液 10 μL，按
2. 1. 1 项下色谱条件重复进样 6 次，结果黄酮 1 和
黄酮 2 峰面积的 ＲSD 分别为 0. 95%，2. 28%，表明
仪器精密度良好。
2. 1. 7 稳定性考察 精密吸取同一供试品溶液，分
别于制备后 0，4，8，12，16，24 h 按 2. 1. 1 项下色谱
条件测定，结果黄酮 1 和黄酮 2 峰面积的 ＲSD 分别
为 1. 70%，2. 40%，表明供试品溶液于 24 h 内基本
稳定。
2. 1. 8 重复性试验 取同一样品，按 2. 1. 4 项下方
法平行制备 6 份供试品溶液，按 2. 1. 1 项下色谱条
件测定，结果黄酮 1 和黄酮 2 峰面积的 ＲSD 分别为
2. 06%，1. 93%，表明该方法重复性良好。
2. 1. 9 加样回收率试验 分别精密称取同一批龙
须藤浸膏 0. 20，0. 25，0. 30 g，各 3 份，精确加入与药
材中质量相同的黄酮 1 和黄酮 2 对照品，按 2. 1. 4
项下方法制备供试品溶液，按 2. 1. 1 项下色谱条件
测定，结果平均加样回收率分别为 100. 18%(ＲSD
2. 06%) ，99. 62%(ＲSD 1. 91%)。
2. 2 提取工艺优选
2. 2. 1 星点试验设计 提取次数为非连续变量，单
因素试验发现黄酮 1 和黄酮 2 提取 2 次的提取率分
别占总提取率的 95. 38%，95. 50%，从节约成本及
生产实际考虑，确定提取数为 2 次。选择乙醇体积
分数、液料比、提取时间为自变量，以黄酮 1 和黄酮
2 质量分数、浸膏得率为综合评价指标，数据处理采
用“归一化法”，利用 Hassan 法［11］分别对各考察指
标进行数学转换求“归一值”dmin和 dmax，计算公式为
dmin =(Ymax － Yi)/(Ymax － Ymin) ，dmax = (Yi － Ymin)/
(Ymax － Ymin) ，计算各指标的 d值后，对各指标“归一
值”进行处理，得“总评归一值(OD)”，计算公式为
OD =(d1·d2…dn)
1 /n，n为指标数。根据星点设计原
理安排试验，因素水平见表 1，试验安排及结果见
表 2。
2. 2. 2 模型拟合及方差分析 以 OD 为因变量，使
·73·
赵永恒，等:星点设计-效应面法优化龙须藤提取工艺
用 Design-Expert 7. 0. 0 软件对各因素进行多元线性
回归和二项式拟合，拟合得多元线性回归方程 Y =
1. 034 － 0. 019 93 X1 + 0. 039 55 X2 + 0. 001 970 X3
(r = 0. 696 4，P = 0. 012 2) ，相关系数过小且 P 值不
显著，不能通过检验，模型拟合度不高，预测性较差;
二项式拟合模型为 Y = － 0. 330 + 2. 640X1 + 0. 055
X2 + 0. 004 515 X3 + 0. 021X1X2 + 0. 032X1X3 +
0. 001 317 X2X3 － 7. 243X1
2 － 0. 007 780 X2
2 －
0. 000 156X3
2(r = 0. 985 9，P ＜ 0. 000 1) ，方程显著，
具有较高的可信度，可用此模型对龙须藤的提取工
艺进行分析和预测，除交互项 X1X2 不显著外，其余
各项均具有显著性，说明各自变量对响应值的影响
不是简单的线性关系。
表 1 龙须藤提取工艺星点试验因素水平
水平 X1乙醇体积分数 /% X2 液料比 /倍 X3提取时间 /min
－ 1. 682 40 6 60
－ 1 48. 11 8. 43 84. 32
0 60 12 120
1 71. 89 15. 57 155. 68
1. 682 80 18 180
表 2 龙须藤提取工艺星点试验安排
No． X1 X2 X3 黄酮 1 /% 黄酮 2 /% 浸膏得率 /% OD
1 － 1 － 1 － 1 0. 047 0. 023 20. 283 0. 813
2 1 － 1 － 1 0. 031 0. 019 17. 753 0. 073
3 － 1 1 － 1 0. 047 0. 023 20. 033 0. 777
4 1 1 － 1 0. 036 0. 018 18. 835 0. 000
5 － 1 － 1 1 0. 038 0. 019 20. 188 0. 275
6 1 － 1 1 0. 031 0. 019 18. 135 0. 000
7 － 1 1 1 0. 043 0. 025 20. 510 0. 837
8 1 1 1 0. 041 0. 023 20. 098 0. 670
9 － 1. 682 0 0 0. 046 0. 023 21. 323 0. 900
10 1. 682 0 0 0. 039 0. 021 17. 648 0. 140
11 0 － 1. 682 0 0. 038 0. 021 18. 145 0. 291
12 0 1. 682 0 0. 045 0. 023 20. 353 0. 769
13 0 0 － 1. 682 0. 035 0. 021 17. 603 0. 000
14 0 O 1. 682 0. 038 0. 021 20. 413 0. 499
15 ～ 20 0 0 0 0. 046 0. 022 20. 948 0. 822
注:15 ～ 20 号为重复试验，该行数据均为平均值。
2. 2. 3 工艺参数优化和预测 根据回归方程作相
应曲面图(图 1 ～ 3) ，根据拟合的响应曲面形状，分
析各自变量对龙须藤中黄酮 1 和黄酮 2 含量的影
响，基于已建立的数学模型，得最佳提取条件为加
14 倍量 45%乙醇提取 2 次，每次 116 min。
图 1 乙醇体积分数、液料比及其相互作用对龙须藤提取工艺影响的响应面和等高线
2. 2. 4 验证试验 称取龙须藤药材约 20 g，共 3
份，按最佳工艺条件进行 3 次验证试验，结果黄酮 1
和黄酮 2 的质量分数依次为 0. 046%，0. 027%，浸
膏得率 21. 21%，OD 实测值 0. 969 6，与预测值
(0. 995 6)的偏差率仅 3. 02%［12］，说明建立的数学
模型可靠，具有良好的预测性。
·83·
第 20 卷第 6 期
2014 年 3 月
中国实验方剂学杂志
Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae
Vol． 20，No． 6
Mar．，2014
图 2 乙醇体积分数、提取时间及其相互作用
对龙须藤提取工艺影响的响应面和等高线
图 3 液料比、提取时间及其相互作用
对龙须藤提取工艺影响的响应面和等高线
3 讨论
龙须藤制剂为闽南验方，临床证实其具有较好
的抗炎、镇痛作用［13］，目前关于其提取工艺的报道
较少。与正交试验和均匀设计相比，星点设计-效应
面法采用非线性数学模型拟合，预测值与真实值更
接近且试验次数少。前期研究已从龙须藤中分离得
到了 3，4，5，5，7-五甲氧基黄酮和 3，4-亚甲二氧
基-5，5，6，7-四甲氧基黄酮，通过药效学试验证实二
者均具有较好的抗炎、镇痛作用，目前尚无二者含量
测定的报道，本文采用 HPLC测定二者含量，建立的
方法简便、准确。
［参考文献］
［1］ 国家中医药管理局《中华本草》编委会．中华本草．第
4 册［M］．上海:上海科学技术出版社，1999:361.
［2］ 福建省医药研究所．福建药物志．第 1 册［M］．福州:
福建人民出版社，1979:194.
［3］ 白海云，詹庆丰，夏增华，等． 九龙藤化学成分研究
(Ⅱ) ［J］．天然产物研究与开发，2004，16(4) :312.
［4］ 徐伟，郑海音，洪振丰． ＲP-HPLC 测定龙须藤中 4 种
黄酮类成分的含量［J］． 中国现代应用药学杂志，
2009，26(9) :763.
［5］ 叶蕻芝，郑春松，林薇，等．气相色谱质谱联用技术分
析梅花入骨丹挥发油的化学成分［J］．福建中医学院
学报，2009，19(5) :20.
［6］ 白海云，詹庆丰，劳爱娜，等． 九龙藤化学成分研究
(I) ［J］．中国中药杂志，2005，30(1) :42.
［7］ 郑海音，洪振丰，朱洪民，等．康美肤烧伤膏对烫伤创
面 IL-6、IL-8 表达的影响及疗效观察［J］． 中国医药
导报，2008，5(26) :40.
［8］ 易荆丽，张嘉家，周毅生，等．龙须藤提取物的镇痛抗
炎作用［J］．广东药学院学报，2012，28(6) :647.
［9］ 高杰，林炜鑫，卢少欢，等．九龙藤乙酸乙酯提取物清
除自由基、镇痛抗炎作用研究［J］． 安徽农业科学，
2011，39(36) :22305.
［10］ 胡娟，叶蕻芝，冯亚，等． 3 种闽产中药体外对大鼠血
小板凝集的影响［J］． 福建中医学院学报，2007，17
(3) :23.
［11］ 吴伟，崔光华，陆彬．实验设计中多指标的优化:星点
设计和总评“归一值”的应用［J］． 中国药学杂志，
2000，35(8) :530.
［12］ 孟江，许舒娅，卢国勇，等．星点设计-效应面法优化姜
炭炮制工艺［J］． 中国实验方剂学杂志，2012，18
(2) :8.
［13］ 洪振丰，郑海音，徐伟，等． 康美肤烧伤膏抗炎、镇痛
作用的实验研究［J］． 中国中医药科技，2007，14
(6) :410.
［责任编辑 仝燕］
·93·
赵永恒，等:星点设计-效应面法优化龙须藤提取工艺