全 文 ：湖南林业科技　2010年第 37卷第 1期 研究报告
收稿日期:2009— 12 — 15
修订日期:2010— 01 — 26
响应面法优化野生毛葡萄中原花青素
醇提工艺的试验
涂　佳 , 邓学良 , 李忠海 , 薛敏敏
(中南林业科技大学食品科学与工程学院 , 湖南 长沙　410004)
摘　要:依据响应面试验设计法 , 选取乙醇浓度 (A)、 料液比 (B)、 反应温度 (C)为考察因素 , 对野生毛葡萄
籽中原花青素醇提工艺进行优化试验。经对各因素的显著性和交互作用的分析 , 得出野生毛葡萄籽中原花青素醇
提的最佳工艺条件为:乙醇浓度为 64%、 料液比为 1∶7、 提取温度为 35℃。建立的原花青素醇提数学模型为:Y=
0.61-0.058A+0.029B-0.12C+0.025AC-0.013BC-0.091A2 -0.095B2 -0.17C2 , 原花青素得率的预测值为
86.95 mg· g-1、 验证值为 85.54 mg· g-1。证明此模型是合理可靠的 , 可用于实际预测。
关键词:野生毛葡萄籽;原花青素;醇提;响应面法;优化
中图分类号:R284.2　　　文献标识码:A　　　文章编号:1003— 5710 (2010)01— 0001— 06
Optimizationforethanolextractionofproanthocyanidinsfrom
Vitisquinquangularisusingresponsesurfacemethod
TUJia, DENGXueliang, LIZhonghai, XUEMinmin
(ColegeofFoodScience＆ ProjectEngineering, CentralSouthUniversityofForestryandTechnology,
Changsha410004, China)
Abstract:TheethanolextractiontechnologyofproanthocyanidinsfromseedsofVitisquinquangulariswasstudiedusingresponsesurface
method, andethanolconcentration(A), solid-liquidratio(B)andtemperature(C)wereselectedasexperimentalfactors.Based
onanalysisofsignificanceandinteractionamongdiferentfactors, theoptimumconditionofethanolextractiontechnologywasobtained
asfollowed:ethanolconcentrationwas64%, solid-liquidratiowas1∶7andtemperaturewas35 ℃。 Themathematicalmodelofproan-
thocyanidinsextractionwasY=0.61-0.058A+0.029B-0.12C+0.025AC-0.013BC-0.091A2 -0.095B2 -0.17C2.Andthe
predictedvalueandmeasuredvalueofproanthocyanidinsyieldwere86.95 mg· g-1 and85.54mg· g-1 , respectively.Sotheob-
tainedmodeliscredibleandcouldbeusedforactualprediction.
Keywords:seedsofVitisquinquangularis;proanthocyanidins;ethanolextraction;responsesurfacemethod;optimization
　　野生毛葡萄 (VitisquinquangularisRehd.)是葡萄
科 (Vitaceae)葡萄属 (VitisL)真葡萄亚属 (E-uvi-
tis)东亚种群中的一个种 , 是我国葡萄属东亚种群中
分布最广的一个野生种 , 生长在山区林缘和灌木丛中 ,
主要分布于秦岭、 泰山以南 17个省份的广大地区 。野
生葡萄分布范围广 , 资源储量大 , 因而促进湖南地区
的野生葡萄资源开发利用与产业化生产有重要意义 。
原花青素 (Proanthocynadin, 简称 PC)是存在于葡萄
中的一种天然植物多酚[ 1] , 在葡萄皮 、 籽中含量很丰
富 。目前已报道的不同原料中原花青素的提取方法主
要有溶剂法及仪器辅助提取法 。本试验采用溶剂提取
法 , 常用的提取溶剂包括热水 、 甲醇 、 乙醇 、 丙酮、
乙酸乙酯及其水溶液等 。考虑到食用安全性 , 本试验
用乙醇作为提取溶剂 , 并采用响应面分析法对影响原
花青素醇提的关键因素进行优化 , 以期为科学利用野
生毛葡萄籽中的原花青素提供参考。
1　仪器及材料
1.1　主要仪器
紫外可见分光光度计 (UV— 1700), 日本岛津公
司;操作软件 (UV—PROBE), 日本岛津公司;旋转蒸
发仪 (R201D—Ⅱ), 郑州长城科工贸有限公司;真空
涂　佳 , 等:响应面法优化野生毛葡萄中原花青素醇提工艺的试验
冷冻干燥仪 (FD—IA), 北京博医康实验仪器有限公司 。
1.2　主要试剂及配置
原花青素 (含量 >95%), 天津尖峰天然产物研究
开发有限公司;乙醇 , 国产工业级 , 其它试剂为分析
纯 。
2　试验方法
2.1　样品处理
将完整野生毛葡萄鲜果洗净 , 手工剥皮 , 取籽 。
毛葡萄籽洗净晾干后研磨 , 过 40目筛 , 立即置入
30 ℃石油醚中脱脂 8 h, 晾干 , 冷冻保存备用;毛葡
萄皮经真空冷冻干燥后研磨 , 立即置入 30 ℃石油醚中
脱脂 8 h, 晾干 , 冷冻保存备用 。
2.2　原花青素测定原理
原花青素和儿茶素类单体的 A环的化学活性较高 ,
在酸性条件下 , 其上的间苯二酚或间苯三酚与香草醛
发生缩和 , 产物在浓酸作用下形成红色的正碳离子 ,
样品的浓度与产生的颜色呈正相关 , 500 nm波长下测
定其吸收光值 [ 2] 。利用紫外可见分光光度计在较大稳
定吸收波长处测定吸光值 , 对照原花青素曲线 , 测得
原花青素的含量。
2.3　检测条件及波长的确定
将制备好的原花青素提取液 0.5 mL与 2.5 mL30 g
· L-1香草醛和 2.5 mL30%硫酸于 30 ℃避光反应
15 min后 , 利用紫外可见分光光度计在 200 ～ 800 nm
波长范围内扫描 , 确定测定原花青素的检测波长 。原
花青素与香草醛的酚醛缩合反应生成的红色物质在
500 nm波长处有最大吸收 , 据此 , 试验中采用分光光
度法于在 500 nm处测定原花青素含量 [ 3] 。
2.4　原花青素标准曲线的绘制
准确称量预先烘干的原花青素 0.05 g, 用甲醇溶
解 , 并用甲醇定溶至 50 mL, 得到浓度为 1 g·L-1的原
花青素标准溶液 。将上述标准溶液分别配制成浓度为
0.01mg· mL-1、 0.05 mg· mL-1、 0.1 mg· mL-1、
0.15mg· mL-1、 0.2 mg· mL-1 、 0.25 mg· mL-1 、
0.3 mg· mL-1、 0.35 mg· mL-1、 0.4 mg· mL-1的原
花青素标准溶液。于试管中依次加入 0.5 mL不同浓度
的标准水溶液、 2.5 mL30 g· L-1香草醛的甲醇溶液及
2.5 mL30%H2SO4的甲醇溶液 , 混匀后于 30 ℃水浴保
温 20 min后测定 A500nm, 绘制原花青素的标准曲线 。根
据标准溶液的吸光值 , 可以求出原花青素浓度与其吸
光值的数学关系 。用 sps软件进行数据处理 , 所得到
的回归方程为 A=2.08C-0.016 (C:浓度 mg· mL-1;
A:吸光值;相关系数:r=0.998)。结果表明原花青
素含量在 0.010 ～ 0.400 mg· mL-1范围内与吸光值线性
关系良好 。
2.5　原花青素提取工艺优化
2.5.1　原花青素提取单因素试验
(1)最佳提取剂的选择 。称取 1 g40目脱脂葡萄
籽 , 按 1∶7的料液比 , 在 50%、 70%、 90%的乙醇中
于 40 ℃提取 40 min(2次)后离心过滤 , 用相对应的
浸提剂定容至 25 mL, 取 0.5 mL加入 2.5 mL30 g·
L-1香草醛的甲醇溶液及 2.5 mL30%H2SO4 的甲醇溶
液 , 混匀后于 30 ℃水浴保温 20 min后 , 利用紫外可见
光分光光度计在 500 nm处测其吸光度。
(2)料液比对原花青素提取效果的影响。称取 1 g
40目脱脂葡萄籽 , 按料液比为 1∶5、 1∶6、 1∶7、 1∶8、
1∶9的比例加入 70%乙醇浸提剂于 40 ℃提取 40 min
(2次)后离心过滤 , 用相对应的浸提剂定容至 25 mL,
取 0.5 mL加入 2.5 mL30 g· L-1香草醛的甲醇溶液及
2.5 mL30%H2SO4的甲醇溶液 , 混匀后于 30℃水浴保
温 20 min后 , 利用紫外可见光分光光度计在 500 nm处
测其吸光度。
(3)温度对原花青素提取效果的影响 。称取 1 g
40目脱脂葡萄籽 , 按 1∶7的料液比加入 70%乙醇浸提
剂 , 分别于 20 ℃、 30 ℃、 40 ℃、 50 ℃提取 40 min
(2次)后离心过滤 , 用相对应的浸提剂定容至 25 mL,
取 0.5 mL加入 2.5 mL30 g· L-1香草醛的甲醇溶液及
2.5 mL30%H2SO4的甲醇溶液 , 混匀后于 30 ℃水浴保
温 20 min后 , 利用紫外可见光分光光度计在 500 nm处
测其吸光度。
(4)提取时间对原花青素提取效果的影响 。称取
1 g40目脱脂葡萄籽 , 按 1∶7的料液比加入 70%乙醇
浸提剂 , 于 40 ℃分别提取 20 min、 40 min、 60 min、
80 min(2次)后离心过滤 , 用相对应的浸提剂定容至
25 mL, 取 0.5 mL加入 2.5 mL30 g· L-1香草醛的甲
醇溶液及 2.5 mL30%H2SO4 的甲醇溶液 , 混匀后于
30 ℃水浴保温 20 min, 后利用紫外可见光分光光度计
在 500 nm处测其吸光度 。
2.5.2　原花青素提取率的计算
葡萄籽原花青素提取率 =(C1 ×V)(C0×m)×100%
式中:C1———提取液的原花青素含量
(mg· mL-1);
V———提取液的体积 (mL);
C0———原花青素含量 (mg· mL-1);
m———原料质量 。
2.5.3　响应面优化原花青素提取方法　在单因素试验
的基础上 , 筛选出影响原花青素提取效果的因素:溶
液浓度 、 料液比 、反应温度。以不同提取浓度 A、 不同
料液比 B和不同的提取温度 C3因素 3水平 , 以 +1、
0、 -1分别代表自变量的高、 中 、 低水平 , 按方程 xi
=(Xi-X0)X0/ΔX对自变量进行编码 , 共设立了 20
个处理组 。其中 , xi为自变量的编码值 , Xi为自变量
·2·
研究报告　　　
的真实值 , X0为试验中心点处自变量的真实值 , ΔX
为自变量的变化步长 , 因子编码及水平见表 1, 响应设
计见表 2。
表 1　原花青素提取因素水平表
水平
(xi)
浸提液浓度(A)
(%)
料液比(B)
(固∶液)
提取温度(C)
(℃)
1 50 1∶6 30
2 70 1∶7 40
3 90 1∶8 50
注:x1=(A-70)/20;x2=(B-6)/2;x3=(C-40)/10
2.5.4　葡萄皮原花青素与葡萄籽原花青素的比较　利
用葡萄籽最优提取条件 , 提取葡萄皮中原花青素 , 比
较两者原花青素含量 。
3　结果与分析
3.1　乙醇浓度对原花青素提取效果的影响
从图 1可以看出 , 在 70%乙醇中原花青素提取率
最高 。
图 1　乙醇浓度对原花青素提取率的影响
3.2　料液比对原花青素提取效果的影响
以 70%乙醇为提取剂。不同的料液比对原花青素
提取效果的影响见图 2。提取效果随料液比增大而增
大 , 当料液比达到一定程度时 , 再增大料液比提取效
果基本稳定 , 但若料液比增大到一定值后再继续增大 ,
提取率反而降低 。说明适宜的料液比能达到最好的提
取效果 , 这时有效成分基本溶出 , 没必要再增大料液
比 。由图 2可知 , 最适料液比为 1∶7。
图 2　不同料液比对原花青素提取率的影响
3.3　提取温度对原花青素提取效果的影响
不同的提取温度对原花青素提取效果的影响见图
3。由图 3可知 , 提取温度在 20 ～ 50 ℃之间时 , 提取
物中原花青素含量随温度的增加而迅速增加 , 在 50 ℃
时开始下降 。当温度大于 50 ℃时 , 提取物中原花青素
会分解 。因此 , 为了尽量减小有用成分的损失 , 提高
产品活性成分的含量 , 降低生产成本 , 宜选择提取温
度为 40 ℃较适合。
图 3　不同提取温度对原花青素提取率的影响
3.4　提取时间对原花青素提取效果的影响
不同提取时间对原花青素提取效果的影响见图 4。
由图 4可知 , 提取时间在 40 min内 , 提取物中原花青
素的含量随时间的延长明显增加 , 但 40 min之后 , 原
花青素含量不再增加 。这可能是由于在一定范围内 ,
提取时间越长 , 提取液与被提取物质相互作用的时间
越长 , 因而提取率就越高 , 但当两者达到平衡后 , 提
取率将不再增加 , 如果再延长提取时间其它杂质也可
能被提取出来 , 从而可能使产品的有效成分含量相对
减少 , 因此提取时间应控制在 40 min左右 。
图 4　不同提取时间对原花青素提取率的影响
3.5　响应面优化法提取原花青素
3.5.1　响应面法优化原花青素提取条件 　以乙醇浓
度 、料液比、 反应温度为自变量。根据单因素试验结
果并综合考虑生产工艺易行性 , 固定提取温度为
40 ℃, 用响应面法 , 以紫外吸光度值为响应值 (因变
量 Y), 对乙醇浓度 (A)、 料液比 (B)和反应温度
(C)3因素的 3水平进行原花青素提取条件优化 , 试
验设计及结果见表 2。
如表 2所示 , 试验点共有 20个 。可分为 2类:即
14个析因点和零点 , 零点为区域的中心点。零点试验
重复 6次 , 以估计误差 。按照 DesignExpert软件中的
CentralCompositeDesign模型 , 对试验获得的原花青素
得率响应值进行回归 , 建立二次回归模型 。初步回归
方程为:
Y=0.61-0.058A+0.029B-0.12C+0.025AC-
0.013BC-0.091A2 -0.095B2 -0.17C2
3.5.2　回归分析 　利用 DesignExpert7.1软件进行二
次多元回归拟合 , 由软件失拟项测试推荐的二次模型
拟合试验数据 , 采用二次模型进行变异分析 (Analysis
·3·
涂　佳 , 等:响应面法优化野生毛葡萄中原花青素醇提工艺的试验
ofvariance, ANOVA)。表 3中 , 模型 P项 <0.000 1,
表明吸光度值高度显著;相关系数 R2为 0.997 8, 表明
表 2　响应面法设计
试验
组号
浸提液浓度(A)
(%)
料液比(B)
(固∶液)
提取温度(C)
(℃)
吸光
度值
x1 x2 x3
1 -1 -1 -1 0.43
2 1 -1 -1 0.23
3 -1 1 -1 0.48
4 1 1 -1 0.35
5 -1 -1 1 0.15
6 1 -1 1 0.08
7 -1 1 1 0.18
8 1 1 1 0.12
9 -1 0 0 0.57
10 1 0 0 0.45
11 0 -1 0 0.48
12 0 1 0 0.53
13 0 0 -1 0.56
14 0 0 1 0.3
15 0 0 0 0.619
16 0 0 0 0.613
17 0 0 0 0.605
18 0 0 0 0.62
19 0 0 0 0.597
20 0 0 0 0.43
模型拟合度较好;离散系数为 2.85, 表明模型的精度
高 , 适用性好;A、 B、 C、 AB、 BC、 AC、 A2、 B2、 C2
的 P值均在 0.05以下 , 说明乙醇浓度、 料液比 、 反应
温度的交互作用对吸光度值有显著影响 。模型的 P失拟
为 0.156 5不显著 , 说明模型可靠 , 可以用于原花青素
的测定 。依据系数估计值 A=-0.058、 B=0.029、 C
=-0.12可知 , 因素的主次效应关系为乙醇浓度 >料
液比 >浸提温度 。
在 α=0.05显著水平下剔除不显著项后 , 对方程
进行优化可得:
Y=0.61-0.058A+0.029B-0.12C+0.025AC-
0.013BC-0.091A2 -0.095B2 -0.17C2
根据回归分析结果 , 作出模型响应面和等高线图 , 如
图 5 ～ 7所示 。
由图 5可以看出 , 在料液比较少时 , 随着乙醇浓
度的增大 , 原花青素提取率先增大到浓度 70%后逐渐
减小;料液比增加后 , 当乙醇浓度增大到 70%左右时 ,
总提取率达到最大 , 再增大乙醇浓度 , 提取率反而下
降 , 这与单因素试验结果相符 。从图 6可以看出 , 在
提取温度较低时 , 随着乙醇浓度的增大 , 原花青素提
取率先增大后减小 ;温度增高后 ,当乙醇浓度增大到
表 3　模型与方差分析
来源 平方和 自由度 均方 F值 P-值 显著性
模型 0.67 1 0.075 498.86 <0.000 1 显著
A—浸提液浓度 0.034 1 0.034 224.76 <0.000 1
B—料液比 8.410E— 0.03 1 8.410E— 003 56.19 <0.000 1
C—温度 0.15 1 0.15 994.45 <0.000 1
AB 8.000E— 004 1 8.000E— 004 5.53 0.043 4
AC 5.000E— 003 1 5.000E— 003 33.41 0.000 2
BC 1.250E— 003 1 1.25E— 003 8.35 0.016 1
A2 0.023 1 0.023 150.49 <0.000 1
B2 0.025 1 0.025 167.57 <0.000 1
C2 0.08 1 0.080 534.13 <0.000 1
残差 1.497E— 0.03 10 1.498E— 004
失拟项 1.084E— 003 5 2.168E— 004 2.63 0.156 5 不显著
纯误差 4.128E— 004 5 3.577E— 003
　　　复相关系数 R2 =0.997 8
离散系数为 2.85
图 5　乙醇浓度和料液比对原花青素提取的影响
·4·
研究报告　　　
图 6　乙醇浓度和反应温度对原花青素提取的影响图
图 7　料液比和反应温度对原花青素提取的影响
62% ～ 65%时 , 总提取率达到最大 , 再增大乙醇浓度 ,
提取率反而下降 , 这与单因素试验结果相符 , 分析原
因可能是在高温高浓度乙醇条件下 , 葡萄液中一些醇
溶性杂质溶解量增大 , 这些物质与原花青素竞争同乙
醇 —水分子的结合 , 从而导致原花青素提取率降低 。从
图 7可以看出 , 在反应温度低时 , 提取率随着料液比
先增加后减少;但当反应温度达到一定程度时 (40 ℃
左右时)料液比在 1∶7左右提取效果最好 , 再增大料
液比提取效果反而下降。
进一步用 DesignExpert软件对试验模型进行典型
性分析 , 以获得最优的提取条件。经分析得 , 在 A=
64、 B=7、 C=35, 即在乙醇浓度为 64%、 料液比为
1∶7、提取温度为 35 ℃时得到理论最大值 (A500 nm)
为 0.641。
3.5.3　验证试验　为了验证响应面法的可行性 , 采用
得到的最佳提取条件进行野生毛葡萄籽原花青素提取
试验 , 乙醇浓度 64%、 料液比 1∶7、 温度 35 ℃。 3次
平行试验得到的实际平均值 (A500 nm)为 0.631, 与
方程模拟值相吻合 。在此条件下 , 野生毛葡萄籽原花
青素的提取率为 85.54 mg· g-1。因此响应面法对野生
毛葡萄籽原花青素提取条件的优化是可行的 , 得到的
野生毛葡萄籽原花青素提取条件具有实际应用价值。
4　结论与讨论
本研究先对野生毛葡萄籽进行提取预处理 , 以野
生毛葡萄籽提取液吸光度 A500 nm为量化指标 , 在单
因素试验的基础上将响应面法应用到野生毛葡萄籽原
花青素的提取 。结果表明乙醇浓度 、 料液比和提取温
度对原花青素提取率的影响显著 , 且不是简单的线形
关系。通过回归分析和验证试验结果表明 , 此方法是
合理可行的。得到原花青素最佳的提取条件为乙醇浓
度 64%、 料液比 1∶7、 提取温度 35 ℃, 最终试验值与
理论预测值很接近 , 在此条件下 , 野生毛葡萄籽原花
青素提取量为 85.54 mg· g-1 , 提取率为 8.55%。
传统的数理统计方法一般采用正交设计 , 可同时
考虑多种因素 , 寻求最佳因素组合 , 但不能在给出的
整个区域上找到因素和响应值之间的一个明确的函数
表达式 , 从而无法找到整个区域上因素的最佳组合和
响应值的最优值 。响应面分析方法是通过中心组合试
验研究几种试验因素间交互作用的一种回归分析方法 ,
具有试验次数少、 周期短 , 求得的回归方程精度高等
优点 , 随着计算机技术的发展 , 这种方法已经成为精
·5·
涂　佳 , 等:响应面法优化野生毛葡萄中原花青素醇提工艺的试验
度高 、应用广 , 并具有实用价值的技术 。由试验结果
可知 , 响应面优化的提取率为 8.55%, 高于各个单因
素法提取率 。因此可以考虑采用响应面优化法得到理
论上的提取最高值 。
参考文献:
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(责任编辑:唐效蓉)
(英文编译:张　珉)
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