全 文 ：火棘原花青素制备及抗氧化功效研究
鄢又玉1，2，沈丹华2，王红娟2，吴平2，赵春芳1，余龙江1，*
（1.华中科技大学生命科学与技术学院，湖北武汉 430074；2.武汉轻工大学生物与制药工程学院，
湖北武汉 430023）
摘 要：以原花青素为评价指标，在单因素实验的基础上，利用中心组合设计和响应面分析优化了火棘果原花青素
的提取工艺。结果表明：提取温度，乙醇体积分数和酸醇比对原花青素提取制备影响显著，火棘果原花青素最佳制备
工艺为：提取时间 80 min，料液比 1 ∶ 10（W ∶ V，g/mL），提取温度 90℃，乙醇体积分数 66 %，酸醇比 1 ∶ 50，提取次数
为 2次，依照此工艺，原花青素提取率为 18.32 %，与理论响应值 18.55 %基本吻合。在此基础上进一步考察了火棘果
原花青素与抗氧化能力的相关性，结果表明火棘果原花青素对其抗氧化功效贡献显著。
关键词：火棘果；原花青素；响应面优化；抗氧化
Pyracantha Fortuneana Procyanidins Preparation and Their Correlation Research with Antioxidant
Activity
YAN You-yu1，2，SHEN Dan-hua2，WANG Hong-juan2，WU Ping2，ZHAO Chun-fang1，YU Long-jiang1，*
（1. School of Life Science & Technology，Huazhong University of Science & Technology，Wuhan 430074，
Hubei，China 2. School of Biological & Pharmaceutical Engineering，Wuhan Polytechnic University，Wuhan
430023，Hubei，China）
Abstract：Take proanthocyanidins as the evaluation target， on the basis of single factor experiments， the
central composite design and response surface analysis are adopted to optimize the extraction technology of
proanthocyandins from pyracantha fortuneana fruits. The results show that the extraction temperature， ethanol
concentration （V/V） and the ratio of acid to alcohol are factors that affect proanthocyanidins significantly. The
optimizing extraction process is： extraction time of 80 min， material-solvent ratio of 1 ∶ 10 （W ∶ V， g/mL ），
temperature of 90 ℃ ， ethanol concentration of 66 % ， acid-ethanol ratio of 1 ∶ 50 and extraction times of 2.
Under these conditions the extraction rate of proanthocyanidins is 18.32 % and fits well with the predicted value
18.55 % . Further， correlations of the proanthocyanidin with the total antioxidant capacity of pyracantha
fortuneana are compared， and the results show that pyracantha fortuneana Proanthocyanidins have strong
antioxidant activity.
Key words：pyracantha fortuneana； proanthocyanidins； optimization of response surface analysis； antioxidant
activity.
作者简介：鄢又玉（1975—），女（汉），博士，研究方向：天然药物。
*通信作者
食品研究与开发
Food Research And Development
2015年 2月
第 36卷第 4期
DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2015.04.010
火棘（Pyracantha fortuneana（Maxim）Li.）又名赤
阳子、红子、火把果、救军粮等，是蔷薇科苹果亚科火棘
属常绿野生灌木，广泛分布于我国东南和西南各省的
广大地区[1]，我国共有 16个省盛产火棘，如贵州省火棘
鲜果年产量在 2 500万千克以上[2]，湖北省鄂西南及神
农架年均产果近 1亿千克[3]，资源极为丰富。
火棘果为药食同源植物，含丰富的营养物质和生
物活性物质[3-4]。近年来对火棘果中维生素、多糖、黄酮
类及微量元素等研究较多[5-6]，而对其中原花青素提取
及相关报道相对较少。原花青素（Proanthoyanidins）是
由不同数量的儿茶素或表儿茶素结合而成的黄烷 3-
醇衍生物的总称，是目前国际上公认的清除人体内自
由基最有效的天然抗氧化剂 [7]，具有非常强的体内抗
氧化活性[7]。可广泛应用于改善血液循环、降血压、降
基础研究
35
血脂、抗脂质过氧化、抗辐射、抗肿瘤、预防白内障、滋
润及美白皮肤等[8-10]，火棘果原花青素的开发极具市场
前景。
响应面法是采用多元二次回归法作为函数估计
的工具，结合数学和统计学建立曲面模型[11]，通过对回
归方程的分析找出最优工艺，在工程应用中可缩减工
作量并提高准确性[12-13]。目前已广泛用于农业、生物、
食品、化学等领域。现通过单因素实验结合 Box-
Benhnken（BBD）设计对火棘果原花青素提取制备进行
优化，得出火棘果原花青素最佳制备工艺，并在此基
础上进一步考察其与抗氧化功效的相关性，以此为火
棘果未来的精深开发提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
材料：火棘果于 2012年 11月中旬采摘湖北恩施
来凤地区，干燥粉碎后过 20目筛备用。
试剂：实验用水均为去离子水，香草醛、甲醇、无
水乙醇、浓盐酸均为分析纯，儿茶素标准品购自上海
金穗生物科技有限公司，总抗氧化能力（T-AOC）试剂
盒购自南京建成生物工程研究所。
1.2 仪器
UV-5100型紫外可见光分光光度计：上海元析仪
器有限公司；DF-101B集热式磁力加热搅拌器：金坛
市医疗仪器厂；Centrifuge 5424R型台式高速冷冻离心
机：德国 Elmendorf公司。
1.3 方法
1.3.1 儿茶素标准曲线制作
以无水乙醇配制儿茶素母液 1 mg/mL。分别稀释
成浓度梯度为 0.05、0.1、0.2、0.3、0.4 mg/mL的溶液，依
照“0.5 mL样品+3 mL 4 %香草醛甲醇溶液+1.5 mL浓
盐酸”反应体系，摇匀，30 ℃下反应 20 min，于 500 nm
处测定吸光度[14]，以浓度（C）与吸光度（A）进行线性回
归，得到标准曲线方程：A = 2.087 2C + 0.045 1（R2 =
0.999 8），表明在儿茶素浓度 0.05 mg/mL~0.4 mg/mL范
围内，吸光度与浓度线性关系良好。
1.3.2 火棘果原花青素最佳提取条件的确定
分别考察乙醇浓度，料液比，加酸量，提取时间、
温度及提取次数等因素对原花青素提取的影响，并从
中拟选影响显著的 3个因素：乙醇浓度、提取温度、盐
酸体积，应用 Design-Expert Software8.0.6软件，进行
BBD设计，以期确定火棘果原花青素的最优提取工艺。
1.3.3 火棘果原花青素含量计算
将测定出的吸光度值按标准曲线方程：A =
2.087 2 C+0.045 1（R2 = 0.999 8）换算成浓度值，按下面
公式计算出提取物中原花青素含量
原花青素质量分数 = C·n·V·10
-3
m ·100 %
式中：C为提取液浓度，（mg/mL）；n为提取液测试
前总稀释倍数；V为提取液总体积，mL；m为秤取的火
棘果皮渣质量，g。
1.3.4 提取物总抗氧化能力测定
测定方法：取一定量提取液高速冷冻离心，用 pH
6.86的缓冲溶液稀释一定倍数，参照总抗氧化能力
（T—AOC）试剂盒操作说明书操作，并记录相关数据。
单位定义：在 37 ℃时，每分钟每克火棘果皮肉粉
提取后的提取液使反应体系的吸光度（OD）每增加
0.01时，为一个总抗氧化能力单位，单位为 unit/g。
总抗氧化能力 =（ODu - ODC）k0.01 × 30 ·
nV
m
式中：ODu为测定管吸光度；ODc为对照管吸光
度；k为反应体系稀释倍数（=反应液总体积/取样量）；
n样品测试前稀释倍数；V为提取液的总体积，mL；m
为提取的火棘果皮渣粉质量，g。
2 结果分析
2.1 6种单因素对火棘果原花青素提取率的影响
称取火棘果皮渣粉 20 g，以乙醇为提取溶剂，一
定料液比及提取温度，回流提取一定时间后，趁热过
滤，冷却后乙醇定容至一定体积，适当稀释后按 1.3.1
中操作，测吸光度值。分别依次考察了提取时间，提取
温度，乙醇浓度，料液比，盐酸加入量及提取次数对原
花青素提取得率的影响，结果分别见图 1~图 6。
0.8
0.6
0.4
0.2
0
吸
光
度
值
50 60 100
温度/℃
70 80 90
0.8
0.6
0.4
0.2
0
吸
光
度
值
0 20 120
时间/min
40 60 80 100
图 1 提取时间对火棘果原花青素提取率的影响
Fig.1 Effect of time on yield of proanthocyanidins
图 2 提取温度对火棘果原花青素提取率的影响
Fig.2 Effect of temperature on yield of proanthocyanidins
鄢又玉，等：火棘原花青素制备及抗氧化功效研究 基础研究
36
表 1 响应面实验因素与水平
Table 1 Factors and levels of response surface analysis
experiment
由图 1可知：随着提取时间的延长，提取液中原
花青素溶出量最初快速增加，至 80 min后增幅减小，
并且，随加热提取时间延长，有可能导致溶出的原花
青素降解而影响其活性，综合考虑能耗及提取效率，
提取时间选为 80 min较适。
由图 2可知：随着提取温度的逐步升高，提取液
中原花青素的浓度逐步增加。当温度上升至 90℃左右
时，随着温度进一步上升，原花青素浓度增加不明显，
甚至略有下降趋势。由此说明随着温度升高，溶剂分
子运动速度加快，从而使其渗透、扩散、溶解速度加快；
另一方面，高温也使细胞膜流动性增强，有利于原花
青素从细胞内转移到提取溶剂中。但是，温度过高也
同时加快了溶出原花青素的氧化分解，从而使原花青
素浓度下降。综合考虑能耗及经济成本等因素，提取
温度选为 90℃时较合适。
由图 3可知：随着乙醇浓度的增加，提取液中原
花青素的浓度先逐渐增大，然后逐步减小，当乙醇浓
度达到 50 %左右时，原花青素提取率相对最高，这表
明此时原花青素溶出量达到最大，此后随着乙醇浓度
进一步增加，醇溶性杂质及疏水性强的成分溶出量相
对增加，原花青素溶出量相对减少，因此，提取所用乙
醇的最适浓度选为 50 %。
由图 4可知：随着料液比的增加，原花青素溶出
量（以同一容积中原花青素浓度表示）先快速增加，随
后增幅减缓。这表明，提取溶剂量大时，火棘果皮渣细
胞膜在短时间内急剧膨胀破裂，原花青素被迅速萃取
进入溶剂；而料液比较小时，一方面无法使原料达到
有效浸泡，另一方面溶剂中的原花青素也极易达到饱
和，从而抑制其进一步溶出。当料液比为 1 ∶ 10时，原
花青素几乎被最大限度提取出来了。综合考虑成本及
后续浓缩处理，料液比选取 1 ∶ 10左右较为合适。
由图 5可知：酸性条件更有利于原花青素的提
取，其主要是因为酸可抑制酚类物质与金属离子的沉
淀反应，增强了溶剂破坏结合键的能力，破坏酚类物
质与蛋白质、多糖、及自身之间的氢键和疏水键作用，
从而提高原花青素的溶出量。但酸量达到 3 mL后酸
的增加量对原花青素的提取率影响减小甚至使原花
青素酸解。因此考虑到后期工业化生产，酸度过高将
导致设备易腐蚀等，选取加酸量为 3 mL左右较合适。
由图 6可知，随着提取次数的增加，原花青素提
出量逐渐减少，综合考虑工作量、生产成本、工作效率
及后续处理等因素，选取提取 2次较为合理，能较大程
度提取出原花青素。
2.2 响应面法优化火棘果原花青素提取工艺
2.2.1 响应面分析因素水平的选取
根据 Box-Benhnken 中心组合实验设计原理，在
单因素试验基础上选取对火棘果原花青素影响显著
的 3个因素：提取温度，乙醇浓度，盐酸加入量进行进
一步优化考察。实验因素与水平设计见表 1。
1.2
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0
吸
光
度
值
0 20 100
乙醇浓度/%
40 60 80
0.4
0.3
0.2
0.1
0
吸
光
度
值
0 5 30
料液比/（1∶x）
10 15 20 25
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0
吸
光
度
值
0 1 6
盐酸体积/mL
2 3 4 5
0.9
0.8
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
吸
光
度
值
0 1
提取次数
2 3 4 5
图 3 乙醇浓度对火棘果原花青素提取率的影响
Fig.3 Effect of ethanol concentration on yield of
proanthocyanidins
图 4 料液比对火棘果原花青素提取率的影响
Fig.4 Effect of solid-liquid ratio on yield of proanthocyanidins
图 5 浓盐酸的量对火棘果原花青素提取率的影响
Fig.5 Effect of hydrochloric acid volume on yield of
proanthocyanidins
图 6 提取次数对火棘果原花青素提取率的影响
Fig.6 Effect of extraction frequency on yield of proanthocyanidins
-1 30 80 0
0 50 90 3
1 70 100 6
A乙醇浓度/% B提取温度/℃ C盐酸体积/mL
水平
因素
基础研究 鄢又玉，等：火棘原花青素制备及抗氧化功效研究
37
表 3 二次响应面回归模型方差分析
Table 3 Mean square analysis of response surface regression
model
2.2.2 响应面优化设计方案
以乙醇浓度 A、提取温度 B、盐酸体积 C为自变
量，以火棘果原花青素提取率为响应值（Y），进行响应
面优化实验，实验方案及结果见表 2。
2.2.3 多元二次响应面回归模型的建立与分析
对表 2实验结果通过 RSA软件程序进行二次回
归响应面分析，建立多元二次响应面回归模型：
Y=17.53 +1.52A+0.18B +4.48C +0.73AB+1.19AC-
0.77BC-2.22A2-1.58B2-5.91C2，各因素的方差分析见
表3。
表 3 中，失拟项 0.526 7>0.05 不显著，模型项
（Prob>F）<0.000 1高度显著，模型的相关系数 R2（模型
平方和/总差=381.39/386.20=98.75 %）较大，表明该模
型拟合度好。
从表 3还可以看出，影响火棘果原花青素提取率
的 3个因素按影响大小排序依次是 C（盐酸体积）＞A
（乙醇浓度）＞B（提取温度），其中盐酸体积影响极显
著，乙醇浓度为影响显著因素。进一步考察三个因素
中交互作用对提取率的影响，对其曲面图和等高线图
进行分析，结果见图 7，图 8及图 9。
曲面图直观地反映了各因素对响应值的影响，图
7，图 8和图 9表明乙醇体积分数，提取温度和盐酸积
与提取液原花青素含量均呈二次方程关系。等高线的
形状可反映出交互效应的强弱，椭圆形表示两因素交
互作用显著，而圆形则交互作用不显著。图 7，图 8，图
9等高线图表明，乙醇体积分数，提取温度，和酸醇比
三者之间均有交互作用，交互作用的影响可能导致响
应面预测最佳值与单因素最佳值相对偏移。
2.3 模型的验证性实验
通过二次回归方程，软件分析预测得到的各影响
因素最佳值为：乙醇浓度 65.68 %，提取温度 91.98℃，
加酸量 4.01 mL，料液比 1 ∶ 10（W/V ∶ g/mL），提取时间
表 2 响应面实验优化方案及结果
Table 2 The optimization scheme and results of response surface
experimental design
实验号
因素
原花青素含量/%
A B C
1 0 1 -1 6.61
2 0 0 0 16.54
3 0 -1 -1 5.28
4 0 -1 1 15
5 1 1 0 16.41
6 0 1 1 13.25
7 1 0 1 17.03
8 1 0 -1 4.9
9 0 0 0 17.9
10 -1 -1 0 12.51
11 -1 0 1 11.5
12 0 0 0 16.74
13 0 0 0 18.54
14 0 0 0 17.92
15 1 -1 0 14
16 -1 1 0 11.99
17 -1 0 -1 4.15
方差来源 平方和 SS 自由度 DF 均方 MS F值 Prob>F
Model 381.39 9 42.38 61.62 <0.000 1
A-A 18.57 1 18.57 27.01 0.001 3
B-B 0.27 1 0.27 0.39 0.550 7
C-C 160.56 1 160.56 233.46 <0.000 1
AB 2.15 1 2.15 3.12 0.120 6
AC 5.71 1 5.71 8.3 0.023 6
BC 2.37 1 2.37 35 0.105 7
A2 20.76 1 20.76 0.18 0.000 9
B2 10.51 1 10.51 15.29 0.005 8
C2 147.20 1 147.20 214.0 <0.000 1
Residual 4.81 7 0.69
Lack of Fit 1.09 3 0.63 0.87 0.5267
Pure Error 2.91 4 0.73
Cor Total 386.20 16
图 7 乙醇浓度和提取温度对火棘果原花青素提取率的影响
Fig.7 Effect of ethanol concentration and extraction temperature
on yield of proanthocyanidins
70.00
62.00
54.00
46.00
38.00
30.0080.00
85.00
90.00
95.00
100.00
10
12
14
16
18
20
原
花
青
素
含
量
A：乙醇浓度B：提取温度
100.00
95.00
90.00
85.00
80.00
B：
提
取
温
度
30.00 38.00 70.00
A：乙醇浓度
46.00 54.00 62.00
15
1716
15
14
13
5
原花青素含量
鄢又玉，等：火棘原花青素制备及抗氧化功效研究 基础研究
38
图 8 乙醇浓度和盐酸体积对火棘果原花青素提取率的影响
Fig.8 Effect of ethanol concentration and hydrochloric acid
volume on yield of proanthocyanidins
图 9 提取时间和盐酸体积对火棘果原花青素提取率的影响
Fig.9 Effect of extraction temperature and hydrochloric acid
volume on yield of proanthocyanidins
100.00
95.00
90.00
85.00
80.000.00
3.004.00
5.00
6.00
0
5
10
15
20
原
花
青
素
含
量
B：提取温度C：盐酸体积/mL
1.002.00
6.00
5.00
4.00
3.00
2.00
1.00
0.00
C：
盐
酸
体
积
/m
L
80.00 85.00 100.00
B：提取温度
90.00 95.00
6 8
10
16
18
5
原花青素含量
12
14
16
16
70.00
62.00
54.00
46.00
38.00
30.000.00
3.004.00
5.00
6.00
0
5
10
15
20
原
花
青
素
含
量
A：乙醇浓度C：盐酸体积/mL
1.002.00
80 min，提取 2次。此时火棘果原花青素理论预估提取
率为 18.55 %。调整该工艺为：乙醇浓度 66 %，提取温
度 90 ℃，加酸量 4 mL，料液比 1 ∶ 10（W/V ∶ g/mL），提
取时间 80 min。同时提取 3组，实际测得的平均提取率
为 18.32 %，与理论预测值 18.55 %基本吻合，因此，
采用 RSA法优化得到的提取条件准确可靠，具有实用
价值。
说明：为更加清楚的反映火棘果原花青素提取工
艺参数，现将加酸量与提取液体积综合考虑，得最优
工艺下的酸醇比为 1 ∶ 50（4 mL/200 mL）。
2.4 火棘果原花青素抗氧化与其最优工艺下的总抗
氧化能力的对比
参照本实验室得到的火棘果抗氧化成分优化工
艺，用 68 %的乙醇，按料液比 1 ∶ 10（W/V ∶ g/mL），酸
醇比 1 ∶ 25，在 90 ℃下提取 60 min，提取 2次，合并提
取液，定容至 200 mL，测定提取液的总抗氧化能力；根
据本实验得到的火棘果原花青素优化工艺，用 66 %
的乙醇，按料液比 1 ∶ 10（m/v），酸醇比 1 ∶ 50，在 90 ℃
下提取 80 min，提取 2次，合并提取液，定容至 200 mL，
测定原花青素的抗氧化能力。每组实验各重复提取
3 次，结果见表 4。
从表 4数据分析得出：火棘果中原花青素所贡献
的抗氧化能力在火棘果抗氧化提取物总抗氧化能力
中占了很大比例，火棘果原花青素的提取具有很高的
应用价值。
3 结论
以火棘果原花青素提取率为量化指标，在单因素
实验的基础上，利用中心组合设计和响应面分析优化
了火棘果原花青素的提取制备工艺。确定了火棘果原
花青素最佳提取工艺为乙醇浓度 66 %，提取温度
90 ℃，酸醇比 1 ∶ 50（V/V），料液比 1 ∶ 10（W/V ∶ g/mL），
提取时间 80 min，提取 2次。在此条件下，原花青素提
取率为 18.32 %，与理论响应值 18.55 %基本吻合。进
一步考察火棘果原花青素与其抗氧化能力的相关性，
6.00
5.00
4.00
3.00
2.00
1.00
0.00
C：
盐
酸
体
积
/m
L
30.00 38.00 70.00
A：乙醇浓度
46.00 54.00 62.00
68
10
16
18
14
5
原花青素含量
12
14
6
实验序号
总抗氧化能力/
（unit/g）
原花青素抗氧化能力/
（unit/g）
1 22 705.7 20 806.3
2 23 354.4 21 400.8
3 23 030 21 312
平均值 23 030 21 173
表 4 火棘果抗氧化成分的抗氧化能力与原花青素抗氧化能力比较
Table 4 Comparison of antioxidant capacity between
proanthocyanidins with antioxidant ingredients
（下转第 148页）
基础研究 鄢又玉，等：火棘原花青素制备及抗氧化功效研究
39
结果表明火棘果原花青素对火棘果抗氧化能力贡献
显著。
参考文献：
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收稿日期：2013-11-26
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检测分析徐红颖，等：蛋及蛋制品中重金属铅、镉的含量测定
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