全 文 ：西 南 园 艺 So ut hws e t Hot r ie u lt ue 2 r( ) 0 6年 5月 第 4 3卷第 3期 : 1一4
红千层 I S S R反应体系的优化
李 伟 何 桥 赵新成 梁国鲁
(西南大学 园艺园林学院 , 重庆 4 00 7 16)
摘 要 : 以红千层 ( C日仿 s t e ln on ha d us R
.
Br
.
)的幼叶为材料 ,利用正 交试验设计 , 对 IS R 反应体系中的主要影 响因子进
行优化筛选 ,研究 了 M g+2 、 T aq DN A 聚合酶 、 dN T P s 、 引物 、模板 D N A 浓度 5 种 因素对扩 增结 果的影响 , 同时研究 了退火
温 度 和循 环 次数对 P C R 扩 增 结 果 的 影 响 。 实验结 果 表 明 , 在 25 林 L IS s R 反 应 体 系 中各 组 分 的 最 适 浓度 分 别
为 : l x P e R b u fe r , 2 . s m m o比 M g +2 , o . Z m m o u L d N即 S , 0 . 4 卜m o讥 引物 . 1 . 2 n g/ 林L 模板 o N A , o . s u r a qD N A 聚合酶 。 通过
梯度 P C R 测验 ,适宜的退火温度为 50 ℃ ,循环次数 45 次 。 并且在红千层 IS R 分析 中 , 带纹清晰 , 稳定性好 。
关键词 :红千层 ; sI s R ;正交设计 ;梯度 P CR
中图分类号 : 5 6 8 5 文献标识码 : A 文章编号 : 1 00 8一 14 8 8 (2 0 0 6 )03 一0 0 1一0 4 收稿 日期 : 2 0 0 6一 0 1一 1 8
O P it m i z a it o n o f ht e I nt e r 一s im P l e S e q u e n c e R e P e a t s R e a c t i o n S y s t e m i n
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红千层 (翻 isI et o on igr d us R . Br . ) , 原产 于澳大
利亚 , 为桃金娘科红千层 属常绿灌木或小乔木 l[] , 又
名红瓶刷 、 金宝树 、 刷毛祯 ,是非常优美 的观赏花木 。
株高为 3一 s m , 老枝银 白色 , 嫩枝红棕色 ,单 叶互生 ,
叶如披针 , 叶片寿命长 , 嫩枝和叶片披有 白色柔毛 。
每年春末夏初 , 火树红花 , 满枝吐焰 ,盛开时千百枝雄
蕊组成一支支艳红 的瓶刷子 ,花期长 ,花数多 。 红千
层为 阳性树种 ,喜温暖湿润气候 ,能耐烈 日酷暑 ,较耐
寒冷 , 萌芽力强 , 耐修剪 ,为高级庭院美化观花树 、 行
道树 、风景树 ,还可作防风林 、切花或大型盆栽 。
目前 ,对于红千层的研究大多集中在组织培养和
常规栽培方面 12 ,也报道 了从其叶中提取多酚 l3] 、 类黄
酮等有效成分 4[] , 但还没有分子标记方面的相关报
道 。 本实 验拟 采 用 I S SR I习 (xn te : S i m p l e S e q u e n e e
eR pe at
, 简单序列重复区间 )分子标记技术对其进行
研究 , 利用正交试验设计 , 从 M扩 、 aT q D N A 聚合酶 、
dN T P S
、 引物 、模板 D N A S 种因素不同水平 , 对红千层
IS S R 反应体 系进行优化分析 ,并对 P CR 反应程序中
的退火温度进行梯度测验 , 以期获得适合于红千层的
IS SR 反应体系 , 为今后红千层分子生物学的深入研
究奠定基础 。
1 材料与方法
1
.
1 材料 、 试剂及仪器
供试红千层由西南大学果树学重点实验室暨重
庆市 农业 综合开发科 技推广 中心提供 ; I S S R 引物 ,
dN T P
S 及 Taq D N A 聚合酶均购 自上海生工生物工程
有限公司 ; p CR 仪为 e p p e r d o f g r a n d ie n t 。
,
.
2 方法
幼叶基 因组 D N A 的提取参照邹喻苹等 门改 良的
C T AB 法 ,稍加改动 ,增加了氯仿 /异戊醇抽提次数 , 省
掉 了高盐去多糖的步骤 。
Is s R一P e R 的体系优化 , 针对 M g , ` 、 T a q DN A 聚
西 南 园 艺 李 伟 . 何 桥 . 赵新成 , 梁国鲁 :红千层 IS S R 反应体系的优化
衰 1 红千层幼叶 户C R 扩增 编 (的正交试验设计
* 。 、 二 M广 aT q 酶 d N Tp s 引物 模板 DN A * 。 ` 二 M广 aT q 酶 dN TP s 引物 模板 DN A大巡稍 勺 l(
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C K 1 2 3 4 5 6 7 8
图 ,
9 10 1 1 12 13 14 1 5 16 17 18 19 20 2 1 22 2 3 24 2 5
红千层幼叶 IS S R一户 C R正交试验结果
注 : C K 为对 照 , 1一 25 为处理代号 ;引物采用 80 8 。
合酶 、 d NT p s 、 引物 、 模板 D N A 浓度 5 种 因素 , 选 用
场 (5勺设 计 的 正 交 试 验 表 , P C R 各 反 应 成 分 的
因素一水平见表 1。
以上共 26 个处理 ,共计 78 个 PC R 管 ,按表 1 加
样 ,反应体系总体积为 20 林L ,除上述变化 因素外 ,每
管 中还 含有 l x P C R b u fe r , 并加人 dd H 20 使其总体
积达到 2 5 林L 。 反应程序为 : 9 4 ℃预变性 3 m i n ; 9 4 ℃
变性 3 0 5 , 5 3 ℃退火 1 m i n , 7 2 ℃延伸 9 0 5 , 循环 4 5
次 ; 7 2 ℃延伸 7 m i n , 4 ℃保存 。
根据正交试验结果 ,选择合适 的反应体系 ,设定
退火温度 (5 0 土 5 ℃ )自动形成 1一 12 个梯度 : 45 .0 ℃ ,
4 5
.
1 ℃ , 4 5 . 7 ℃ , 4 6 . 6 ℃ , 4 7 . 7 ℃ , 4 9 . 0 ℃ , 5 0 . 4 ℃ ,
5 1
.
5 ℃ , 5 3 . 0 ℃ , 5 4 . 1 ℃ , 5 5 . 0 ℃ , 5 5 . 4 ℃ , 以确定最佳
退火温度 。
2 结果与分析
2
.
1 M g +2 浓度对 户C R 反应的影响
从 图 1 中 , 可以看 出 , P c R 扩增结果受 M g Z+浓度
影响很大 , 随着 M广浓度的增加 ,扩增产物明显增多 。
当 M扩+浓度为 1 . 0 一 1 . 5 0 m m o比 时 ( l 一 10 号处理 ) ,特
异 性 强 , 但扩 增 谱 带 较 少 ; 当 M扩+ 浓 度 为 .2 0 -
2
.
5 0 m m o比 时 ( 1 1一2 0 号处理 )扩增谱带 明显增加 , 且
在 .2 5 0
~
F L 时谱带特异性强 ; 当 M g +2 浓度再增加
到 3 . 0 m m o巩 时 ,扩增产物更多 , 弱带及杂带的数量
亦明显增多 ,谱带不清晰 。 过低的 M扩浓度使得 hT q
酶活性不能有效发挥 ,而过高的 M扩浓度又使得 M扩
与底物竞争 aT q 酶 , 抑制了酶的活性 。 因此 ,确定合适
的 M犷反应浓度 ,对于 P c R 反应至关重要 。 根据实验
西 南 园 艺 李 伟 , 何 桥 , 赵新成 , 梁国鲁 :红千层 巧 SR 反应体系的优化
结果 ,确定 M扩浓度为 .2 5 0 ~ o此 。
2
.
2 下a q O N A 聚合酶浓度对 P C R 反应的影响
从图 1 中 ,可 以看出 , 当酶的用量为 .0 5 U 时 , 除
了 1 号处理 由于 M广过低而导致扩增产物少 ,扩增谱
带少 以外 ,其余 4 个处理 ( 6 , 1 1 , 16 , 2 1) 扩增谱带均较
多而且清 晰 。 而当酶量增 加为 1 . 0 , 1 . 5 , .2 0 和 .2 5 U
时 ,其扩增效果跟 .0 5 U 酶量相 比并没有特别显著的
差别 , 因此可以确定 aT q 浓度为 .0 5 u 。
2
.
3 d N T P s 浓度对 P C R 反应的影响
d N TP
, 是 PC R 反应的基本原料 , 浓度过低会导
致扩增带产率较低 ,而过高会导致错误掺人 。 从 图 1
可以看出 ,在各 d N T P s 浓度下 ,均能扩增出一定数量
的谱带 , d NT P S 在 .0 2 0 m m o流 时谱带最 多 6一 7 条 ,然
而浓度为 .0 2 5 m m o UL 时扩增谱带反而较少 , 这说明
高浓度的 d NT P s 会抑制相对分子质量较大的条带扩
增 。 因此 , dN T P s 适宜浓度为 0 . 2 0 m m o比。
.2 4 引物浓度对 P C R 的影响
引物浓度关系到扩增产物的质量 ,浓度太低不能
进行有效的扩增 , 浓度太高会增加引物二聚体 的形
成 ,导致条带不稳定及清晰度下降。 从图 1 中看出 ,虽
然引物浓度为 0 . 4 0 林m o F L 的 5 , 7 , 14 和 2 3 号 4 个处
理 的扩增条带不是特别清晰 , 数量也不太多 , 但是受
其余几个因素的影响 , 在 16 号处理的扩增效果 比较
突出 , 因此可以确定引物浓度为0 .4 0 卜m 0 F L 。
2 5 模板 O N A 浓度对 P C R 反应的影响
最佳的模板浓度范围取决于研究物种和模板纯
度 ,模板浓度过低会导致扩增结果差异较大 。 当模板
浓度适当增加时 ,扩增 的条带多而且稳定 。 结合图 1
的扩增结果 ,认 为红 千层适 宜的模板 D N A 浓度 为
1
.
2 0 n g/ 林L 。
综合以上 5 个因素的影响 , 确定 16 号处理为最
佳 , 即 : 在 2 5 林L 反 应 体 系 中 , 含 l x P e R b u fe r ,
2
.
5 0 m m o讥 M扩+ , 0 . 2 0 m m o ljL dN仰 s , 0 . 4 0 林m o l /L 弓I
物 , 1 . 2 0 n g/ 林L 模板 DN A , 0 . 5 U aT q D N A 聚合酶 。
.2 6 退火温度的确定
根据正交试验设计结果 ,选择 16 号处理组合 ,进
行退火温度的梯度测验 。 由图 2 可见 ,退火温度较低
时 (4 5 . 0一 4 .7 7 ℃) , 除主带外 , 杂带 较多 , 背景很高 ; 随
着退火温度升高件.9 0一5 . 4 ℃ ) ,引物与模板的特异性
结合增强 ,但是扩增条带减少 。 由于 IS SR 引物较长 ,
可适当提高退火温度 , 以提高反应的稳定性和重复
性 ,故认为 IS R 的退火温度在 50 ℃较适合 。
2 7 优化程序的验证
由图 3 可见 , 利用该体系对供试材料进行扩增 ,
供试材料均能扩增出清晰的条带 , 而且扩增产物多态
性很高 。 供试 16 种材料均能够完全区别开来 。
3 讨论
Taq D N A 聚合酶的用量是影响 IS s R 扩增结果的
重要因子 。 酶量过多不仅增加实验成本 , 而且可能导
致非特异性扩增带 的增加 , 反之又可能引起 P CR 扩
增量的不足 。 果树上 已建立的 R A P D网和 SJ SR阴反应
体系中 Taq D N A 聚合酶的用量多在 l u 左右 , 同科
植物莲雾 (勿 z绍 f u o s a o a ar 卿 n s e M e r . e t p e叮 ) IS SR反应体系的 Taq DN A 聚合酶用量为 1 . 5 1U 9] , 而本实
2 之 _ _ 昼 _ _ 3 4 4 5 5 6 6 7 7 $. .9 ?.- . .1 .2 一理山. 巴` 匕二二竺召二
图 2 退火温度对红千层幼叶 ls S R 反应的影响
注 : l一 12 对应温度为 45 .0 ℃ 、 45 . 1 ℃ 、 45 刀 ℃ 、 4 .6 6 ℃ 、 47 7 ℃ 、 4 9 .0 ℃ 、
5 0 4 ℃ 、 5 1 . 8 ℃ 、 5 3 . 0 ℃ 、 5 4 . 1 ℃ 、 5 5 0 ℃ 、 55 4 ℃ ; 引物采用 8 0 8 。
西 南 园 艺 李 伟 ,何 桥 ,赵新成 ,梁 国鲁 :红千层 IS s R 反应体系的优化
图 3 红千层幼叶采用引物 8 0 9 和 8 3 6 的扩增结果
验建立的 IS SR 体系用量仅为 .0 5 U 。 其减少的原因有
待于进一步研究 。
当 M扩+浓度较低时 , 特异性强 , 但扩增谱带较
少 ; 当 M g +2浓度较高时 ,扩增谱带明显增加 ,可能谱带
特异性更强 ; 当 M广浓度过高时 ,扩增产物更多 ,弱带
及杂带的数量亦明显增多 ,谱带不清晰 。 过低的 M广
浓度使得 T aq 酶活性不能有效发挥 , 而过高的 M g Z十浓
度又使得 M g +2与底物竞争 hT q 酶 , 抑制了酶的活性 。
dN TP s 是 P C R 反应的原料 , 浓度过低会导致扩增带
产率较低 ,而过高会导致错误掺人 。 引物浓度关系到
扩增产物的质量 , 浓度太低不能进行有效的扩增 ,浓
度太高会增加引物二聚体的形成 ,导致条带不稳定及
清晰度下降 。 模板浓度过低会导致扩增结果差异较
大 , 当模板浓度适 当增加时 , 扩增结果的条带稳定性
增加 。 因此 , 在扩增结果相差不明显时 ,应尽可能选
择药品用量少 、谱带清晰的反应体系 。
与以往的单因素 PC R 优化设计相比 , 利用正交
试验直观分析的方法 , 能够迅速获得满意的试验结
果 。 但是此方法亦存在一定 的局限性 , 如对实验结果
本身优劣的判断依据带有主观性 ,不能很好地估计试
验误差 ,也不能表明各个实验条件之间的交互作用 。
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m a n d iar
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[习. lP an t C e l l R e p , 2X() 2 , 20 ( 12 ) : 1 16 2 一 1 16 .
加工型优质草幕引种栽培试验
从 山东 、 江苏引人 12 个草每品种 , 种植在我县 的高大乡 (海拔 1 380 m , 年均温 17 .4 ℃ ) ,和九街镇 (海拔 1 75 0 m , 年均温 巧 .6 ℃ 》 。 高大 乡
采用露地种植 , 九街镇分别采用设施种植和露地 种植 。 株行距均 为 30 。 m x 35 c m , 6 7 耐 栽 5 0以〕株 。 试验园总面积 2 3 3 3耐 。 试验结果表明 ,
日本一号 、 星都 、 美杂四号 、 鬼怒甘 4 个品种产量较高 , 6 6 7 耐产量超过 2 以” k ;g 星都 、 美杂四 号 、新明星 、春旭 、 日本一号 、 鬼怒甘 、 宝交早生 7
个品 种的可 溶性 固形物较 高 。 认为产 量高 , 品质 优 , 适 合 加工要 求 的品种 为 日本一 号 、 星都 、 美杂 四号 、 鬼怒 甘 , 他们可 在我 县大 面积
推广 刘发伦(云南省通海县经作站 , 6 527 () )