全 文 ：第３５卷第７期　　　　　　　　　 西 南 大 学 学 报 （自然科学版）　　　　　　　　　　　２０１３年７月
Ｖｏｌ．３５　Ｎｏ．７ Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｓｏｕｔｈｗｅｓｔ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｎａｔｕｒａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　Ｅｄｉｔｉｏｎ） Ｊｕｌ．　２０１３
文章编号：１６７３－９８６８（２０１３）０７－００１４－０７
中国野生毛葡萄叶盘法遗传转化中
抗生素种类及体积质量分数的筛选
①
马孟增１，２，　甘　专１，２，　张文娥２，　潘学军１，２
１．贵州省果树工程技术研究中心，贵阳５５００２５；２．贵州大学 农学院，贵阳５５００２５
摘要：为获得毛葡萄遗传转化体系中合适的抗生素种类和体积质量分数，以毛葡萄单株“花溪－４”为试材，研究了选择
抗生素潮霉素（Ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ，Ｈｙｇ）、卡纳霉素（Ｋａｎａｍｙｃｉｎ，Ｋａｎ）和抑菌抗生素羧苄青霉素（Ｃａｒｂｅｎｉｃｉｌｉｎ，Ｃａｒｂ）及头孢
霉素（Ｃｅｆｏｔａｘｉｍｅ，Ｃｅｆ）对其离体叶片再生和再生芽成苗的影响．结果表明：０．１ｍｇ／Ｌ的 Ｈｙｇ和１０ｍｇ／Ｌ的Ｋａｎ可完
全抑制不定芽再生，适合遗传转化中转基因再生芽筛选；再生芽在添加５ｍｇ／Ｌ　Ｈｙｇ和４０ｍｇ／Ｌ　Ｋａｎ培养基中表现黄
化致死，不能成苗，可用于转基因苗选择．３００ｍｇ／Ｌ的Ｃｅｆ或４００ｍｇ／Ｌ的Ｃａｒｂ均可促进花溪－４不定芽再生，同时对
根癌农杆菌抑制效果良好，适宜于毛葡萄遗传转化中抑制农杆菌生长．
关　键　词：野生毛葡萄；遗传转化；农杆菌；抗生素
中图分类号：Ｓ６６３．１ 文献标志码：Ａ
在以根癌农杆菌介导的遗传转化中，准确地筛选出转化体和有效抑制农杆菌的过度生长是成功获得转
基因植株的关键因素．目前，在用于转基因植株筛选的多种遗传选择标记基因中，仍以新霉素磷酸转移酶
基因（ｎｐｔＩＩ）和潮霉素磷酸转移酶基因（ＨＰＴ）应用最为广泛，ｎｐｔＩＩ编码产物—氨基糖苷磷酸转移酶和
ＨＰＴ 编码产物—潮霉素磷酸转移酶可使转化细胞具有卡那霉素或潮霉素抗性，从而淘汰非转化细胞或植
株．而头孢霉素和羧苄青霉素（Ｃａｒｂｅｎｉｃｉｌｉｎ，Ｃａｒｂ）是农杆菌的有效抑制剂，可作为植物遗传转化中的抑菌
抗生素．自２０世纪９０年代初期前人采用根癌农杆菌介导法成功获得葡萄转基因植株以来，葡萄转基因工
程得到了较快的发展［１－６］．葡萄学者相继建立了欧洲葡萄Ｖｉｔｉｓ　ｖｉｎｉｆｒａ　Ｌ．［７－１０］、沙地葡萄Ｖｉｔｉｓ　ｒｕｐｅｓｔｒｉｓ
Ｓ．［１１－１３］及圆叶葡萄Ｖｉｔｉｓ　ｒｏｔｕｎｄｉｆｏｌｉａ　Ｍｉｃｈｘ．［１４－１５］的再生体系，并开展了选择抗生素和抑菌抗生素的敏感
性实验，研究一致表明葡萄离体再生体系的难易受基因型的影响，且不同基因型葡萄对选择抗生素和抑菌
抗生素种类及体积质量分数的敏感性不同．中国野生葡萄隶属东亚葡萄种群，蕴含了大量优异基因［１６－１７］．
目前，对中国野生葡萄的基因开发仅限于优异抗性基因的克隆［１８］和向模式植物烟草［１９］、拟南芥［２０］及欧洲
葡萄［２１］的转化．关于中国野生葡萄再生体系的研究报道较少［２２－２３］，中国野生葡萄再生体系和继代苗对抗
生素的敏感试验则未见报道．笔者以中国野生毛葡萄“花溪－４”为试材，研究选择抗生素Ｋａｎ和Ｈｙｇ对离体
叶盘再生和继代苗的影响，同时进行了离体叶盘再生对抑菌抗生素Ｃｅｆ和Ｃａｒｂ的敏感性试验，以期确定毛
葡萄叶盘遗传转化时适合的选择压和合适的抑菌抗生素种类及体积质量分数，为成功建立野生毛葡萄遗传
① 收稿日期：２０１２－０７－１７
基金项目：贵州省优秀青年科技人才培养对象专项资金资助项目“野生葡萄种质资源的离体保存与遗传变异”（黔科合人字（２００９）０２号）；
贵州喀斯特山区特异果树种质资源发掘与利用（黔科合农Ｇ字［２００９］４００３号）．
作者简介：马孟增（１９８４－），男，山东泰安人，硕士研究生，主要从事果树种质资源与生物技术育种研究．
通信作者：潘学军，教授，硕士生导师．
DOI:10.13718/j.cnki.xdzk.2013.07.024
转化体系提供依据．
１　材料和方法
１．１　供试材料
试材为原产于贵州的野生毛葡萄单株“花溪－４”（Ｖｉｔｉｓ　ｈｅｙｎｅａｎａ　Ｒｏｅｍ．ｅｔ　Ｓｃｈｕｌｔ“Ｈｕａｘｉ－４”）试管苗，
试验于２０１１年１０月至２０１２年５月在贵州省果树工程技术研究中心进行．
１．２　试验设计与方法
１．２．１　抗生素Ｋａｎ和 Ｈｙｇ对 “花溪－４”叶盘不定芽再生的影响
取生长健壮的“花溪－４”试管苗顶部１～３位幼嫩叶片，切成０．５ｃｍ×０．５ｃｍ叶盘，沿垂直主脉方向用
刀片划３刀，远轴面向下接种在再生芽培养基（ＭＳ＋ＢＡ　８．１２ｍｇ／Ｌ＋ＩＢＡ　０．３５ｍｇ／Ｌ＋ＩＡＡ　０．２３ｍｇ／Ｌ＋
蔗糖３２．００ｇ／Ｌ）上，培养基中分别附加０，１，２，４，６，８，１０，２０，３０，４０，５０，６０，１００和２００ｍｇ／Ｌ的Ｋａｎ或０．０，
０．１，０．２，０．４，０．６，０．８，１．０，２．０，３．０，５．０，１０．０，２０．０，３０．０，４０．０，５０．０ｍｇ／Ｌ的 Ｈｙｇ，完全随机试验设计，
每个培养皿接种９～１２个叶盘，重复３次．培养温度（２５±２）℃，暗培养２０ｄ后光培养，光照周期１４ｈ／１０ｈ
（光／暗），光照强度３６ｍｍｏｌ／（ｍ２·ｓ）．
１．２．２　抑菌抗生素Ｃｅｆ和Ｃａｒｂ对“花溪－４”叶盘不定芽再生的影响
取材、接种方法、再生培养基及培养条件同１．２．１，培养基中附加０，１００，２００，３００，５００和６００ｍｇ／Ｌ的
Ｃａｒｂ或０，１００，２００，３００，４００，５００和６００ｍｇ／Ｌ的Ｃｅｆ．每个培养皿接种９个叶盘，重复５次．
１．２．３　选择抗生素Ｋａｎ和 Ｈｙｇ对再生芽成苗的影响
取生长健壮的“花溪－４”再生试管苗，剪成单芽茎段，接种到附加不同体积质量分数的Ｋａｎ（０，１０，２０，
３０，４０，５０，７０和１００ｍｇ／Ｌ）或 Ｈｙｇ（０，１，２，３，５，１０，２０，３０，４０和５０ｍｇ／Ｌ）的继代培养基（１／２ＭＳ＋ＩＡＡ
０．１ｍｇ／Ｌ）上．完全随机试验设计，每瓶接种３个，重复５次．培养温度（２５±２）℃，光照周期１４ｈ／１０ｈ
（光／暗），光照强度３６ｍｍｏｌ／（ｍ２·ｓ）．
１．３　结果统计与数据分析
接种４５ｄ后调查叶片再生及继代苗生长情况，按下列方法计算再生叶片褐化率、再生率、再生芽数、
再生芽继代褐化率、出苗率、成苗数．
再生叶片褐化率＝褐化叶片／接种叶片数×１００％
不定芽再生率＝出芽叶片数／接种数×１００％
平均不定芽数＝不定芽数／接种数
再生芽继代苗出苗数＝出苗总数／接种数
再生芽继代苗褐化率＝褐化苗数／接种数
再生芽继代苗成苗数＝有效苗数（长度大于１．５ｃｍ的新梢）／接种数×１００％
　　试验数据采用 Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ　Ｅｘｃｅｌ和ＤＰＳ　７．０５软件进行处理和统计分析，数据运用新复极差法（Ｄｕｎｃａｎ
Ｔｅｓｔ，ｐ＜０．０５或ｐ＜０．０１）进行多重比较．
２　结果与分析
２．１　卡那霉素对毛葡萄“花溪－４”叶片离体再生不定芽的影响
葡萄对Ｋａｎ非常敏感［２４］，由表１可以看出，随着Ｋａｎ体积质量分数的升高，毛葡萄“花溪－４”不定芽再
生率和平均不定芽数都呈现出先上升后下降的变化趋势，当Ｋａｎ体积质量分数达到６ｍｇ／Ｌ时，再生率和
不定芽数均达到最高值．当Ｋａｎ达到８ｍｇ／Ｌ时，“花溪－４”离体叶片再生不定芽率和再生数受到严重抑制，
Ｋａｎ体积质量分数增至１０ｍｇ／Ｌ时，大部分叶盘褐化，再生率和褐化率明显低于对照，分别为４．７％和
５１％．体积质量分数继续增加，叶片褐化不断加重，不定芽再生困难．当Ｋａｎ体积质量分数达到１００～２００
ｍｇ／Ｌ时，叶片完全白化．由此得出，Ｋａｎ可用于毛葡萄“花溪－４”遗传转化子的筛选，筛选体积质量分数为
１０ｍｇ／Ｌ．
５１第７期　 　马孟增，等：中国野生毛葡萄叶盘法遗传转化中抗生素种类及体积质量分数的筛选
表１　那霉素对 “花溪－４”离体叶片再生及褐化的影响
Ｋａｎ／（ｍｇ·Ｌ－１） 再生率／％ 平均不定芽数／个 褐化率／％
０　 １７．７ｂｃ　 ２．６７ｂｃ　 １５ｄ
１　 １１．０ｃｄｅ　 １．６７ｃｄｅ　 １３ｄ
２　 １５．３ｂｃｄ　 ２．３３ｂｃｄ　 １３ｄ
４　 ２６．７ａｂ　 ４．００ａｂ　 ９ｄｅ
６　 ３５．３ａ ５．３３ａ ２ｅ
８　 １７．７ｂｃ　 ２．６７ｂｃ　 ９ｄｅ
１０　 ４．７ｄｅ　 ０．６７ｄｅ　 ５１ｃ
２０　 ０．０ｅ ０．００ｅ ８０ｂ
３０　 ０．０ｅ ０．００ｄｅ　 ８４ｂ
４０　 ０．０ｅ ０．００ｄｅ　 ９６ａ
５０　 ０．０ｅ ０．００ｄｅ　 １００ａ
６０　 ０．０ｅ ０．００ｄｅ　 １００ａ
１００　 ０．０ｅ ０．００ｄｅ　 １００ａ
２００　 ０．０ｅ ０．００ｄｅ　 １００ａ
　　注：不同小写字母表示抗生素不同体积质量分数处理间差异显著（ｐ＜０．０５），下同．
２．２　潮霉素对毛葡萄“花溪－４”叶片离体再生不定芽的影响
从图１可以看出，毛葡萄“花溪－４”对Ｈｙｇ的反应比Ｋａｎ还要敏感，０．１ｍｇ／Ｌ　Ｈｙｇ完全抑制了“花溪－４”叶
片不定芽再生；当Ｈｙｇ体积质量分数达到０．４ｍｇ／Ｌ时，“花溪－４”的叶盘和愈伤组织褐化严重，愈伤组织分
化严重受阻；当体积质量分数超过２ｍｇ／Ｌ时，“花溪－４”叶片不能分化出愈伤组织；体积质量分数升高到
２０～５０ｍｇ／Ｌ时叶片白化死亡．可见，较低体积质量分数的 Ｈｙｇ即可明显抑制毛葡萄“花溪－４”愈伤组织
和不定芽分化．０．１ｍｇ／Ｌ的 Ｈｙｇ能够有效地抑制不定芽分化再生，对叶盘伤害较小，可用于转基因不定
芽筛选．
１－１５分别代表０，０．１，０．２，０．４，０．６，０．８，１．０，２．０，３．０，５．０，１０．０，２０．０，３０．０，４０．０，５０．０ｍｇ／Ｌ的潮霉素体积质量分数．
图１　潮霉素对“花溪－４”叶片再生的影响
２．３　Ｃｅｆ和Ｃａｒｂ对“花溪－４”离体叶片不定芽再生的影响
植物遗传转化过程中，选择合适的抑菌抗生素十分关键，其选择的标准是既能完全抑制农杆菌的生
长，同时又对外植体的生长几乎没有影响．如表２所示，随着Ｃｅｆ体积质量分数的升高，“花溪－４”不定芽再
６１ 西南大学学报（自然科学版）　　　　　ｈｔｔｐ：／／ｘｂｂｊｂ．ｓｗｕ．ｃｎ　　　　　第３５卷
生率和平均出芽数均表现出先上升后下降的变化趋势．不定芽再生率和平均出芽数在Ｃｅｆ　３００ｍｇ／Ｌ时均
达到最高值，分别为１００％和９．００，体积质量分数继续升高，再生率和平均出芽数均显著降低．Ｃａｒｂ对
“花溪－４”叶盘再生体系的影响与Ｃｅｆ不同，在一定体积质量分数（３００ｍｇ／Ｌ）范围内，Ｃａｒｂ对“花溪－４”叶
盘再生率和平均出芽数无显著影响．高于４００ｍｇ／Ｌ的Ｃａｒｂ即可显著抑制 “花溪－４”不定芽再生．而３００
ｍｇ／Ｌ的Ｃｅｆ和４００ｍｇ／Ｌ的Ｃａｒｂ能够完全抑制农杆菌的生长［２５］，因此，毛葡萄“花溪－４”遗传转化体系
中适宜的抑菌抗生素为Ｃｅｆ，体积质量分数为３００ｍｇ／Ｌ．
表２　抑菌抗生素对 “花溪－４”离体叶片不定芽再生的影响
抗生素种类 体积质量分数／（ｍｇ·Ｌ－１） 再生率／％ 平均出芽数／个
Ｃｅｆ　 ０　 ５１．８５ｅ ４．６７ｅ
１００　 ９２．５９ａｂ　 ８．３３ａｂ
２００　 ９６．３０ａ ８．６７ａ
３００　 １００．００ａ ９．００ａ
４００　 ８５．１９ｂｃ　 ７．６７ｂｃ
５００　 ８１．４８ｃ ７．３３ｃ
６００　 ７０．３７ｄ ６．３３ｄ
Ｃａｒｂ　 ０　 ５１．８５ａ ４．６７ａ
１００　 ２９．６３ｃ ２．６７ｃ
２００　 ４８．１５ａｂ　 ４．３３ａｂ
３００　 ３７．０４ａｂｃ　 ３．３３ａｂｃ
４００　 ３３．３３ｂｃ　 ３．００ｂｃ
５００　 ２９．６３ｃ ２．６７ｃ
６００　 ２５．９３ｃ ２．３３ｃ
２．４　Ｋａｎ和Ｈｙｇ对毛葡萄“花溪－４”再生芽成苗的影响
获得再生植株后，通常需利用标记基因对再生植株进行筛选．选择抗生素Ｋａｎ和Ｈｙｇ对毛葡萄“花溪－４”
再生芽成苗的影响如表３所示，Ｋａｎ和Ｈｙｇ均抑制了“花溪－４”继代苗的生长，在１０ｍｇ／Ｌ　Ｋａｎ和１．０ｍｇ／Ｌ
Ｈｙｇ时，植株还可生长较好，但随着Ｋａｎ和Ｈｙｇ体积质量分数的升高，抑制作用越来越明显，当Ｋａｎ和Ｈｙｇ
分别达到４０ｍｇ／Ｌ和５ｍｇ／Ｌ时，“花溪－４”单芽茎段切口严重褐化，叶片黄化致死，生长点生长缓慢或停止生
长，难于生根．因此，４０ｍｇ／Ｌ的Ｋａｎ和５ｍｇ／Ｌ的Ｈｙｇ适宜转基因再生植株的筛选．
表３　卡那霉素和潮霉素对花溪－４”再生芽继代苗生长的影响
抗生素
种类
体积质量分数
／（ｍｇ·Ｌ－１）
出苗数
／个
有效苗数
／个
褐化率
／％
试管苗生长状态
Ｋａｎ　 ０　 ３．００ａ ３．００ａ ０．０ｄ 植株整齐，叶片呈均匀绿色，根系发达，须根量多
１０　 ３．００ａ ３．００ａ ０．０ｄ 植株生长较健壮，根系较发达，须根量少
２０　 ２．３３ａｂ　 １．３３ｂ ３３．３ｃ 植株矮小，部分叶片黄化，生根率低，须根量极少
３０　 ２．００ａｂｃ　 ０．６７ｃ ６６．７ｂ 叶片黄化，芽萎缩褐化，生根率极低，几乎无须根
４０　 １．００ｂｃｄ　 ０．００ｄ １００．０ａ 切口褐化，大部分叶片黄化，无根
５０　 ０．６７ｃｄ　 ０．００ｄ １００．０ａ 大部分叶片黄化，切口褐化，死亡
７０　 ０．３３ｄ ０．００ｄ １００．０ａ 黄化死亡
１００　 ０．３３ｄ ０．００ｄ １００．０ａ 黄化死亡
Ｈｙｇ　 ０　 ３．００ａ ３．００ａ ０ｃ 植株生长整齐健壮，叶片呈均匀绿色，根系发达，须根量多
１　 ３．００ａ ３．００ａ ０ｃ 植株生长整齐健壮，叶片呈均匀绿色，根系较发达，须根量较多
２　 ２．６７ａ １．３３ｂ ３３ｂ 植株矮小，叶片小部分黄化，主根量少，几无须根
３　 １．６７ｂ ０．３３ｃ ４４ｂ 叶片、叶柄均出现黄化，生根率极低，无须根
５　 ０．００ｃ ０．００ｃ １００ａ 黄化死亡
１０　 ０．００ｃ ０．００ｃ １００ａ 黄化死亡
２０　 ０．００ｃ ０．００ｃ １００ａ 黄化死亡
３０　 ０．００ｃ ０．００ｃ １００ａ 黄化死亡
４０　 ０．００ｃ ０．００ｃ １００ａ 黄化死亡
５０　 ０．００ｃ ０．００ｃ １００ａ 黄化死亡
７１第７期　 　马孟增，等：中国野生毛葡萄叶盘法遗传转化中抗生素种类及体积质量分数的筛选
３　结　论
众多研究表明，不同的抗生素种类和体积质量分数对植物的再生均有不同程度的影响，不同种类、品
种的植物对不同抗生素的敏感性不同，筛选所用的抗生素种类和体积质量分数也就有差别．卡那霉素对不
定芽再生起抑制作用，即使低体积质量分数也强烈地抑制不定芽的分化以及转化植株的生根［２６］．Ｄａｓ等［７］
报道，２０ｍｇ／Ｌ的Ｋａｎ适宜作为美丽无核葡萄转化子的筛选；Ｓｃｏｒｚａ等［２７］采用２０～４０ｍｇ／Ｌ的Ｋａｎ对欧
洲葡萄转化子进行筛选；Ｆａｎ等［２１］利用选择标记 ＨＰＴ在汤姆逊无核上获得转化子的适宜筛选种类及体积
质量分数为 Ｈｙｇ　１２ｍｇ／Ｌ．在本研究中，毛葡萄“花溪－４”在Ｋａｎ　１０ｍｇ／Ｌ的体积质量分数下不定芽受到严
重抑制，再生率仅有４．７％，０．１ｍｇ／Ｌ的 Ｈｙｇ就能完全抑制不定芽的再生，由此看出野生毛葡萄对Ｋａｎ
和 Ｈｙｇ较欧洲葡萄敏感性更强．前人研究表明，３００～４００ｍｇ／Ｌ的Ｃｅｆ或Ｃａｒｂ就能够完全控制农杆菌的
生长［２６－２８］，在本研究中，３００ｍｇ／Ｌ的Ｃｅｆ和４００ｍｇ／Ｌ的Ｃａｒｂ对毛葡萄“花溪－４”叶片再生的抑制作用均
较小，均适于作为抑制根癌农杆菌生长的抗生素，且Ｃｅｆ优于Ｃａｒｂ，研究结果与Ｄａｓ等［７］的结论相符，但
与Ｄｈｅｋｎｅｙ等［１４］和Ｃｏｌｂｙ等［２９］在抗生素的使用体积质量分数上稍有不同，可能是由于不同基因型对抗生
素的敏感性存在差异．在确定选择性抗生素的前提下，抗生素的体积质量分数直接影响到抗性芽的分化
率．抗生素体积质量分数过低会产生假阳性植株，进而影响后期转化子的检测；若体积质量分数过高则会
抑制组织的生长，导致抗性芽的分化受阻．因此，对试验材料进行抗生素敏感性试验，确定适宜的抗生素
种类和体积质量分数是成功获得转化子的关键．在本研究中，３００ｍｇ／Ｌ的Ｃｅｆ不仅没有对抗性芽的再生起
到抑制作用，反而提高了抗性芽的再生率，这可能是由于Ｃｅｆ和Ｃａｒｂ等抗生素与生长素有相似的化学结
构，因而在组织培养中具有激素效应，与细胞分裂素（如６－ＢＡ）混用时可改变植物体的激素平衡，影响外植
体的分化［３０］，本研究中Ｋａｎ对叶片不定芽再生的促进作用再次印证了这一结论．
试验表明野生毛葡萄叶片和再生芽继代苗对Ｈｙｇ的敏感性显著强于Ｋａｎ，０．１ｍｇ／Ｌ的Ｈｙｇ就能完全
抑制毛葡萄不定芽的再生，５ｍｇ／Ｌ的 Ｈｙｇ即能导致继代苗的黄化死亡，故单从筛选的目的来说，Ｈｙｇ更
适于作为毛葡萄基因转化的选择标记．本试验得出Ｃｅｆ和Ｃａｒｂ均可作为农杆菌的抑制剂，且３００ｍｇ／Ｌ的
Ｃｅｆ不定芽再生率为１００％，更适合作为毛葡萄农杆菌转化的抑菌抗生素．
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ｒｕｐｅｓｔｒｉｓ　Ｓ．）［Ｊ］．Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１９９４，８８（６－７）：６２１－６２８．
［１１］ＭＵＬＬＩＮＳ　Ｍ　Ｇ，ＡＲＣＨＩＥ　Ｔ　Ｆ　Ｃ，ＦＡＣＣＩＯＴＴＩ　Ｄ．Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ－Ｍｅｄｉａｔｅｄ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｇｒａｐｅｖｉｎｅｓ：
Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　Ｐｌａｎｔｓ　ｏｆ　Ｖｉｔｉｓ　ｒｕｐｅｓｔｒｉｓ　Ｓｃｈｅｅｌｅ　ａｎｄ　Ｂｕｄｓ　ｏｆ　Ｖｉｔｉｓ　ｖｉｎｉｆｅｒａ　Ｌ．［Ｊ］．Ｎａｔｕｒｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９９０（８）：
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［１２］ＪＩＮ　Ｗａｎ－ｍｅｉ，ＤＯＮＧ　Ｊｉｎｇ，ＨＵ　Ｙｕａｎ－ｌｅｉ，ｅｔ　ａｌ．Ｉｍｐｒｏｖｅｄ　Ｃｏｌｄ－Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ　Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ　ｉｎ　Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　Ｇｒａｐｅ（Ｖｉｔｉｓ　ｖｉｎｉｆ－
ｅｒａ　Ｌ．）Ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ　Ｃｏｌｄ－Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　Ｆａｃｔｏｒｓ　ＡｔＤＲＥＢ１ｂ［Ｊ］．Ｈｏｒｔ　Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００９，４４（１）：３５－３９．
［１３］ＭＡＲＴＩＮＥＬＬＩ　Ｌ，ＣＡＮＤＩＯＬＩ　Ｅ，ＣＯＳＴＡ　Ｄ，ｅｔ　ａｌ．Ｓｔａｂｌｅ　Ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｍｏｖｅｍｅｎｔ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｇｅｎｅ　ｏｆ
Ｇｒａｐｅｖｉｎｅ　Ｖｉｒｕｓ　Ａ（ＧＶＡ）ｉｎ　Ｇｒａｐｅ（Ｖｉｔｉｓ　ｒｕｐｅｓｔｒｉｓ　Ｓ．）［Ｊ］．Ｖｉｔｉｓ，２００２，４１（４）：１８９－１９３．
［１４］ＤＨＥＫＮＥＹ　Ｓ　Ａ，ＤＵＴＴ　Ｍ，ＧＡＲＹ　Ｄ　Ｊ，ｅｔ　ａｌ．Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ－Ｍｅｄｉａｔｅｄ　Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｉｃ　Ｃｕｌｔｕｒｅｓ　ａｎｄ
Ｐｌａｎｔ　Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　ｉｎ　Ｖｉｔｉｓ　ｒｏｔｕｎｄｉｆｏｌｉａ　Ｍｉｃｈｘ．（Ｍｕｓｃａｄｉｎｅ　Ｇｒａｐｅ）［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌ　Ｒｅｐｏｒｔｓ，２００８，２７（５）：８６５－８７２．
［１５］ＴＨＩＥＳ　Ｋ　Ｌ，ＧＲＡＶＥＳ　Ｃ　Ｌ．Ｍｅｒｉｓｔｅｍ　Ｍｉｃｒｏｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｆｏｒ　Ｖｉｔｉｓ　ｒｏｔｕｎｄｉｆｏｌｉａ　Ｍｉｃｈｘ［Ｊ］．ＨｏｒｔＳｃｉｅｎｃｅ，
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［１８］ＬＩＮ　Ｌｉｎｇ，ＷＡＮＧ　Ｘｉ－ｐｉｎｇ，ＷＡＮＧ　Ｙｕｅ－ｊｉｎ．ｃＤＮＡ　Ｃｌｏｎｅ，Ｆｕｓｉｏｎ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ａｎｄ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｎｏｖｅｌ　Ｇｅｎｅ　Ｒｅｌａｔｅｄ
ｔｏ　Ａｓｃｏｒｂａｔｅ　Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ　ｆｒｏｍ　Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｗｉｌｄ　Ｖｉｔｉｓ　ｐｓｅｕｄｏｒｅｔｉｃｕｌａｔａ　ｉｎ　Ｅ．ｃｏｌｉ ［Ｊ］．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　Ｒｅｐｏｒｔｓ，２００６，
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［２１］ＦＡＮ　Ｃｈａｏ－ｈｏｎｇ，ＰＵ　Ｎｉ，ＷＡＮＧ　Ｘｉ－ｐｉｎｇ，ｅｔ　ａｌ．Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ－Ｍｅｄｉａｔｅｄ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｇｒａｐｅｖｉｎｅ（Ｖｉｔｉｓ
ｖｉｎｉｆｅｒａ　Ｌ．）ｗｉｔｈ　ａ　Ｎｏｖｅｌ　Ｓｔｉｌｂｅｎｅ　Ｓｙｎｔｈａｓｅ　Ｇｅｎｅ　ｆｒｏｍ　Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｗｉｌｄ　Ｖｉｔｉｓ　ｐｓｅｕｄｏｒｅｔｉｃｕｌａｔａ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌ　Ｔｉｓｓｕｅ　Ｏｒｇａｎ
Ｃｕｌｔｕｒｅ，２００８，９２（２）：１９７－２０６．
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［２７］ＳＣＯＲＺＡ　Ｒ，ＣＯＲＤＴＳ　Ｊ　Ｍ，ＲＡＭＭＩＮＧ　Ｄ　Ｗ，ｅｔ　ａｌ．Ｔｒａｎｄｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｇｒａｐｅ（Ｖｉｔｉｓ　ｖｉｎｉｆｅｒａ　Ｌ．）Ｚｙｇｏｔｉｃ－Ｄｅｒｉｖｅｄ　Ｓｏ－
ｍａｔｉｃ　Ｅｍｂｒｙｏｓ　ａｎｄ　Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　Ｐｌａｎｔｓ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌ　Ｒｅｐｏｒｔｓ，１９９５，１４（９）：５８９－５９２．
［２８］ＭＵＬＷＡ　Ｒ　Ｍ　Ｓ，ＮＯＲＴＯＮ　Ｍ　Ａ，ＦＡＲＲＡＮＤ　Ｓ　Ｋ，ｅｔ　ａｌ．Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ－Ｍｅｄｉａｔｅｄ　Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ
ｏｆ　Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ‘Ｃｈａｎｃｅｌｏｒ’Ｗｉｎｅ　Ｇｒａｐｅ　Ｐｌａｎｔｓ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ　ｔｈｅ　ｔｆｄＡ Ｇｅｎｅ［Ｊ］．Ｖｉｔｉｓ，２００７，４６（３）：１１０－１１５．
９１第７期　 　马孟增，等：中国野生毛葡萄叶盘法遗传转化中抗生素种类及体积质量分数的筛选
［２９］ＣＯＬＢＹ　Ｓ　Ｍ，ＭＥＲＥＤＩＴＨ　Ｃ　Ｐ．Ｋａｎａｍｙｃｉｎ　Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ　ｏｆ　Ｃｕｌｔｕｒｅｄ　Ｔｉｓｓｕｅｓ　ｏｆ　Ｖｉｔｉｓ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌ　Ｒｅｐｏｒｔｓ，１９９０，
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［３０］ＬＩＮ　Ｊ　Ｊ，ＮＡＣＹＲＡ　Ａ　Ｇ，ＪＯＮＡＴＨＡＮ　Ｋ．Ｐｌａｎｔ　Ｈｏｒｍｏｎｅ　Ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ　ｏｎ　Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ　Ｆｆｉｃｉｅｎｔ　ｏｆ　Ｐｌａｎｔ　Ｔｉｓ－
ｓｕｅ　ｂｙ　Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ　Ｃｅｌｓ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ　Ｓｃｉｎｃｅ，１９９５，１０９（２）：１７１－１７７．
Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ　ａｎｄ　Ｔｈｅｉｒ　Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ
Ｄｕｒｉｎｇ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｖｉａ　ｔｈｅ　Ｌｅａｆ　Ｄｉｓｃ
Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ　ｉｎ　Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｗｉｌｄ　Ｇｒａｐｅ（Ｖｉｔｉｓ　ｈｅｙｎｅａｎａ）
ＭＡ　Ｍｅｎｇ－ｚｅｎｇ１，２，　ＧＡＮ　Ｚｈｕａｎ１，２，　ＺＨＡＮＧ　Ｗｅｎ－ｅ２，　ＰＡＮ　Ｘｕｅ－ｊｕｎ１，２
１．Ｇｕｉｚｈｏｕ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｆｒｕｉｔ　Ｃｒｏｐｓ，Ｇｕｉｙａｎｇ　５５００２５，Ｃｈｉｎａ；
２．Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｃｏｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｇｕｉｚｈｏｕ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｇｕｉｙａｎｇ　５５００２５，Ｃｈｉｎａ
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｉｎ　ｔｈｉｓ　ｐａｐｅｒ，ｔｈｅ　ｅｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ｋａｎａｍｙｃｉｎ（Ｋａｎ），ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ（Ｈｙｇ），ｃａｒｂｅｎｉｃｉｌｉｎ（Ｃａｒｂ）ａｎｄ　ｃｅｆｏｔａｘｉｍｅ
（Ｃｅｆ）ｏｎ　ｔｈｅ　ｅｆｉｃｉｅｎｃｙ　ｏｆ　ａｄｖｅｎｔｉｔｉｏｕｓ　ｂｕｄ　ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｅｆｅｃｔ　ｏｆ　Ｋａｎ　ａｎｄ　Ｈｙｇ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｇｒｏｗｔｈ　ｏｆ　ａｄｖｅｎｔｉ－
ｔｉｏｕｓ　ｂｕｄｓ　ｗｅｒｅ　ｓｔｕｄｉｅｄ，ｕｓｉｎｇ　ｔｈｅ　ｌｅａｆ　ｄｉｓｃｓ　ｏｆ　Ｖｉｔｉｓ　ｈｅｙｎｅａｎａｓｔｒａｉｎ“Ｈｕａｘｉ－４”ｃｕｌｔｕｒｅｄ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ，ｓｏ　ａｓ　ｔｏ　ｓｅｌｅｃｔ
ｔｈｅ　ｏｐｔｉｍａｌ　ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ　ｔｙｐｅｓ　ａｎｄ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　ｐｌａｎｔｓ．Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　０．１ｍｇ／Ｌ
Ｈｙｇ　ｏｒ　１０ｍｇ／Ｌ　Ｋａｎ　ｃｏｕｌｄ　ｆｕｌｙ　ｉｎｈｉｂｉｔ　ｔｈｅ　ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａｄｖｅｎｔｉｔｉｏｕｓ　ｂｕｄｓ　ａｎｄ，ｔｈｅｒｅｆｏｒｅ，ｃｏｕｌｄ　ｂｅ
ｕｓｅｄ　ｆｏｒ　ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　ｌｉｎｅ　ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ　ｉｎ　ａｄｖｅｎｔｉｔｉｏｕｓ　ｂｕｄ　ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｔｈａｔ　５．０ｍｇ／Ｌ　Ｈｙｇ　ｏｒ　４０ｍｇ／Ｌ　Ｋａｎ
ｌｅｄ　ｔｏ　ｔｈｅ　ａｅｔｉｏｌａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｄｅａｔｈ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｓｕｂ－ｃｕｌｔｕｒｅｄ　ｐｌａｎｔｌｅｔｓ　ａｎｄ，ｈｅｎｃｅ，ｃｏｕｌｄ　ｂｅ　ｕｓｅｄ　ｆｏｒ　ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　ｐｌａｎｔ
ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ　ａｔ　ｔｈｅ　ｔｕｂｅ－ｐｌａｎｔｌｅｔ　ｓｔａｇｅ．Ｓｕｐｐｌｙ　ｏｆ　３００ｍｇ／Ｌ　Ｃｅｆ　ｏｒ　４００ｍｇ／Ｌ　Ｃａｒｂ　ｐｒｏｍｏｔｅｄ　ａｄｖｅｎｔｉｔｉｏｕｓ　ｂｕｄ
ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｅｖｅｎｔｕａｌｙ　ｅｌｉｍｉｎａｔｅｄ　ｔｈｅ　ｇｒｏｗｔｈ　ｏｆ　Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉａ，ｓｏ　ｉｔ　ｗａｓ　ｐｒｏｐｅｒ　ｔｏ　ｂｅ　ｕｓｅｄ　ｆｏｒ　ｉｎｈｉｂｉ－
ｔｉｎｇ　ｔｈｅ　ｇｒｏｗｔｈ　ｏｆ　Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉａｉｎ　ｇｅｎｅｔｉｃ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｖ．ｈｅｙｎｅａｎａ．
Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：Ｖｉｔｉｓ　ｈｅｙｎｅａｎａ；ｇｅｎｅｔｉｃ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ；Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ；ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ
责任编辑　夏　娟　　　　
０２ 西南大学学报（自然科学版）　　　　　ｈｔｔｐ：／／ｘｂｂｊｂ．ｓｗｕ．ｃｎ　　　　　第３５卷