全 文 ：中 国 宣 地
Gr a
s 日 a nd o f C l li n a
1 3 9 9
,
N o
.
4 , P P
.
4 4 ~ 4 9
四种优良牧草的快速繁殖
1
. 山 野豌豆的快速繁殖
王克平 l’g 日青 吴向荣
(吉林省生物研究所 ,长春 1 3。。 1 2 )
【提要】 本项研究以羊草等四种优良牧草为材料 , 以无性繁殖的组织培养方法为主要手段 ,
进行了优良牧草快速繁殖方法 、 手段的研究 。 经正交试验选择的山野碗豆的快速繁殖方法 : 以 2~ 4
叶期的胚轴 、 叶基为外植体 ,培养在 M S + 6一BA .O 5叱 / L 和 M S + 6一BA Zmg / L 的培养基上直接
形成再生苗 , 1 . 5 个月繁殖系数达到 23 3 . 08 %和 5 84 . 62 % 。
关键词 : 山野豌豆 ,快速繁殖
T i s s u e C u l t u r e o f F o u r E l i t e F o r a g e C u l t iv a sr
.
1
.
B r加 d l e a s V e t e h ( iV血硫况月口 ) .
W
a n g K e p im g e t a l
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( 刀`户a 以m耐 o f G 夕t呀曰犯云访 , J成九 介 st 众ut e of B匆fo g 夕 ,
C h a n g e h u n
, 1 3 0 0 1 2 )
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e s e le e t e d f o u r foar
g e e u l t i v a r s f or t h
e e x p er im e n t o f it s u e e u l t u r e i n o r d er t o g e t
m o r e s e e d l in g s a n d a v a i l a b le e h a r a e t e r s a s q u ie k l y a s p o s s ib le
.
B r oa d l e a f v e t e h w a s o玉 o f
t h e m
.
T h e m a t e r i a l s e u lt u r e d w e r e t h e l e a f b o s e a n d t h e h y P oc o t y l s
.
T h e y w e r e e u l t u r e d
in t h e m e d ia o f M S + 6一 B A 0 . s m g / L a n d M S + 6一 B A Zm g / L f o r n e w s e e d li n g s d i-
r e e t ly
.
A f t e r o n e m o n t h a n d a h a l f
,
t h e C oe f f i e ien t
o f p r o p a g a t io n r e a e h e d 2 3 3
.
8 % a n d
5 8 4
.
6 2%
, r e s p e e t iv e l y
.
1 研究 目的
栽培牧草和野生牧草蕴藏着丰富的遗传
基因 , 除了用现有的常规方法利用和改造外 ,
利用生物技术改造牧草是一个新的途径 , 通
过组织培养等生物工程技术 ,可以迅速扩大
优良牧草的繁殖 , 创造新的有用的突变体和
杂种 ,实 现基因 的重组合 , 扩大遗传变异谱
系 ,从而获得新类型 ,培育 出牧草新 品种 , 或
真接利用新技术产物 。 因而牧草生物技术的
研究和开发应用 ,也是植物生物技术的重要
研究领域 。 为此 ,本项研究选用羊草 、 山野豌
豆 、 扁着豆 、 硷茅四种优 良牧草为材料 , 以无
4 4
性繁殖的组织培养方法为主要手段 ,进行优
良牧草快速繁殖方法 、 手段的研究 ,为牧草育
种工作和野生资源保存探索一条加速繁殖的
新技术途径 。
2 研究材料和才法
作者简介 : 王克平 ,女 , 41 岁 , 研究室副主任 ,助理研
究员 , 从事牧草育种及细胞遗传研究 . 曾主持省 、部级重点
科研项 目 , 在省级以上学术刊物上发 表文章 25 篇 。
, 本项研 究工作曾得到 郝水先生 的指 导和 李云峰 、 周
东正同志及徐宗尧剧教授的帮助 , 一并致谢 。
收稿 日期 : 1 9 9 2一 0 5一 王7 , 修改稿 1 9 9 3一 0 3一 立。 收到 。
2
.
1 供试材料及来源 (见表 1) 。 表 2 山一正交 砚试验因素及水平
表 1 供试材料及来源
水 平试验因素—1 2 3 456分类 材料名称 种性 材料来源 染色体数2 n禾 羊草 An e uro l e p id i um“ 吉生一号 ” 本课题组 。 。. 击 1` 护 , 生 J心 .茫卜 , 几心 白 Uc n 一n e n s e 那 T如 刁甲 J百 耳 A ( 6一 B A , m g / L ) 2 1 0 . 5 0 一 一B ( 2 , 4一 D , m g / L ) 3 2 1 0 . 5 0 . 1 0C (外植体 ) 胚轴 叶 一 一 一 一朝鲜硷茅 P u e e i n e l l i ae h i n a m p o e ” 5 15 人工栽培优良牧草 表 3 山一正交 份试验因素及水平水 平山野豌豆 V i e i aa n 10 e n
科 誓 T ir go n e l肚aur t h e n i e a
野生优良牧草
野生优 良牧草
试验因素
本科豆
, 引自赵传孝的工作 .
2
.
2 试验方法
四种材料选择的基本培养基均为 M S 培
养基 。运用正交试验设计 ,对四种材料分别进
行了不同外植体 、 不同外源激素 、不同接种和
培养方法的综合筛选 。
2
.
3 培养条件
全部 培养基均为 0 . 5%琼脂 粉 固化 。
p H S
.
8
。 培养温度 25 + 3℃ 。 发芽培养基为琼
脂培养基十蔗糖 3 % 。 诱导和分化培养基为
M S + 外源激素+ 蔗糖 3% 。 生根培养基为 1/
2M (S 大量元素减半 ) + I A A o , s m g / L + 蔗糖
1
.
5 %
。外植体均接种在诱导培养基上进行暗
培养 ,愈伤组织出现后转入光照培养 ,光照强
度 Z0 0 0 L x , 每 日光照 1 0 小时 。
2
.
4 移栽方法
将根长 1一 cZ m 以上 的再生苗炼苗 7 ~
10 天后 、 用 自来水冲洗净根部培养基 , 直接
移栽入土 , 在花盆内培养 。 用玻璃杯或塑料袋
在弱光处保湿培养 7一 15 天 ,缓苗后揭去扣
膜 , 移入网室或移栽网室 , 在 自然条件下继续
培养 。 盆栽土为吉林农大生产的 JN 8 37 型花
卉培养土加黑土各 1 2/ , 并施入适量美国生
产的磷酸二按复合速效化肥 。
3 研究内容 和结果
3
.
1 山野豌豆的快速繁殖
1 2 3
A ( 6一 B A , m g / L ) 2 1 0 . 5
B ( N A A
,
m g / L ) 0
.
2 0
.
1 0
C (外植体 ) 胚轴 叶 一
供试材料为 2~ 4 叶期无菌苗 。 外植体及
试验设计见表 2 和表 3 。 种子处理方法为无
水 乙 醇 20 ’ ~ 1%升汞或 2纬安替福 民 20 ’ ~
蒸馏水洗五次 。 经表面消毒的种子接种在发
芽培养基上在 光下培养 , 发芽率 50 % 以上 。
将初展真叶后的无菌苗胚轴和叶基在超净工
作台上切取 。 . sc m 左右的切段 ,分别接种在
诱导培养基上进行暗培养 ,待 出现愈伤组织
后转入光照培养 。
培养基和外植体筛选 :
6 一 B A 十 2 , 4 一 D (正交 址 )和 (6 一 B A 十
N A A (正交 W )两组合试验结果表明 , 6一 B A
十 N A A 组合好于 6 一 B A十 2 , 4一 D 组合 。 接
种 1个月后 ,正交 皿 36 个处理中仅 8 个处理
分化出再生苗 , 最高繁殖系数为 92 . 31 % (表
4一 l ) 。 正交 W 18 个处理中有 13 个处理分化
出再生苗 ,最高繁殖系数为 1 60 . 0 写 (表 5一
1 )
。 统计分析结果表明 , 正交 N 试验中 A 因
素 (6 一 B A ) 的最优水平为 T ; (2 m g / L ) , 水平
之和 ( 3 2 6 . 6 6 ) 在 A 因素 中最高 。 B 因 素
( N A A ) 的最优水平为 T 。 (0 m g / L ) , 水平之和
( 3 1 3
.
3 3 )在 B 因素中最高 (表 5 一 l 一 l ) 。 在
正 交 班 试验 中 A 因 素的 T , 水 平 ( 6一 B A
Zm g / L )和 B 因素的 T 。 水平 ( 2 , 4 一 D o m g /
L ) 也表现较 优 , 水平之和 ( 70 . 0 , 92 . 3 1) 仅
次于 A 因素 T 、 水平 (6 一 B A Om g / L )和 B 因
素 T 3 、 T ; 水 平 ( 2 . 4 一 D I 、 0 . s m g / L ) 之 和
( 7 3
.
3 3
、
1 0 0
.
0 0 ) (表 4一 1一 1 ) 。
4 5
表 4一 1
备注
山野豌豆快繁正交 l 设计及试验结果
接种 成愈 成芽 成苗 繁殖幻数系研
棵 块 块 写 个 %棵 另
外植体培养基
MS
6一 B A Z, 4一D
( m g / L ) ( rn g / L )
002
0005
:
4
,1
0003 0一 1
3一 2
00
00
l .L0`1`
3一 3 0 。 5
胚轴
口十
胚轴
叶
胚轴
叶
胚轴
叶
胚轴
叶
胚轴
叶
胚轴
叶
胚轴
叶
胚轴
叶
胚轴
叶
胚轴
叶
胚轴
叶
5 9
.
2 1
5 7
.
5 8
1 0 0
.
0 0
9 4
。
1 2
7 7
.
5 3
9 6 7 7
0
6
。
2 5
。 接种
O 时间
0 1~ 2 月
0
0
3一 4
3一 5
3一 ` 。
5
.
2 6
3一 7 0 . 5
3一 8
3一 9
3一 1 0
3一 1 1 0 。 5
3一 12 】0 1
2 1
8?
。
9 5
1 0 0
。
0 0
7 9
.
7 8
1 0 0
。
0 0
9 2
.
3 9
1 0 0
。
0 0
1 0 0
,
0 0
1 0 0
.
0 0
0
0
0
2
。
7
0
0
0
0
0
0
0
0
0
4
.
7 6
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
5 0
。
0 0
0
1 6
。
67
0
0
0
3 3
.
3 3
0
0211
8174009朴“.94.6.81073
45197630朋829376918“045蛇10283397465497,9361
表 4一 2
备注培养基
山野豌豆快繁正交 I 设计及试验结果
接种 成愈 成芽 成苗
M S
6一 B A Z , 4一D
( m g / L ) (m g / L )
裸 块 块 片 个 纬 棵 — 策殖系数% (% )
外植体
3一 1 3 0 。 5 。
2
.
0 0 2 0
.
0 0
0
ù
1
2
。
0 0 2 0
.
0 0
01几3一 14 0 . 5
3一 1 5 0 . 5 0 。 5
3一 1 6 0 。 5
胚轴
叶
胚轴
叶
胚轴
口十
胚轴
叶
9 4
.
8 3
10 0
。
0 0
7 4
.
5 8
10 0
.
0 0
6 6
.
29
6 1
。
90
5 7
。
14
1 1
。
4 3
3一 16 0 . 5
3一 17 0 . 1
3一 18
胚轴
叶
胚轴
p十
胚轴
2 17
1 4 9
1 94
14 1
2 3 3
14 7
14 8
18 6
14 1
2 4
6 7
.
74
9 9
.
3 3
9 5
.
8 8
10 0
.
0 0
1 0
.
3
0 0 0
1 3
.
8 5 2 0
.
0 0 0
2 5 0
.
0 0 4 0
.
1 99 0 年 5 月
0 0 0
( ) 0 ( J
0 《 ) L)
0 0 0
1 2 5 ( )
.
f )〔) 9 2 .
0 0
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50492634
UO00甘0材,`气:J亡J匕dU口Oj任63ōb10`l匕O甘匕口一了已」
0
15 4
19 9 0
年补
充试
验 。
3 1 接种
时间
3 月份
0月J口几6舀nj1几,工l且止
叶
4 6
表 5一 l
培养荃
6一 A BZ , 4一 D
( m g几 ) ( m g / L )
山野婉豆快繁正交 VI 设计及试验结果
接种 成愈 成芽 成苗 铁殖
系数
备
M S 裸 块 块 % 个 % 裸 拓 (幼 注
外植体
4一 1
4一 2
3
·
3 3 3 3
.
3 5 接种
5
.
0 0 1 0 0
.
0 0时间
0 0 3 月
5
.
0 0 33
.
3 3 份 。
0 0
2 2
.
2 2 1 6 0
.
00
000
。
2
0
。
1
4一 3
.7
自山
63
,几
3
亡口
6.…4月I七曰2,且几」4一 4 0 。 2 1 4 。 1 7 16 。 6 75 0 。 0 041.103蕊西,口且n乙004一 5 0 。 1 5 0 。 0 0
2 5
。
0 0 0OCù0
00
040肠21,I3854706306548750的舀36ō七内才七Jùb.0一石49374门产3已口6
4一 6
4一 7 0 . 5 0。 2
4一 8 0。 5 0。 1
4一 9 .O 5
胚轴
叶
胚轴
叶
胚轴
叶
胚轴
叶
胚轴
叶
胚轴
叶
胚轴
叶
胚轴
叶
胚轴
叶
0
0
0
0
8 0
。
0 0
7 2
。
0 0
4 0
。
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8 2
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9 0
。
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9 5
。
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。
7 1
8 0
。
0 0
1 0 0
. 勺心
1 0 0
。
0 0
9 7
。
1 4
1 0 0
。
0 0
9 5
。
83
9 2
。
00
0 0
10
.
0 0 10 0
.
0 0
0 0
7
.
5 75
。
0 0
0 0
1 0
.
0 0 1 0 0
.
0 0
2
。
1 7 20
.
00
4
.
3 5 3 3
.
3 3
农 4一 1一 1 山一正交 I 统计分析结果 (接种 1个月 )
处 A B c T t 处 A B C tT
理 列 号 获殖系数 理 列 号 获殖系数 一 ,
号 1 2 5 (% ) 号 i 、 2 3 (% )
3一 1 1 1 1 0 3一 1 2 4 3 1 0
1 1 2 0 4 3 2 33
。
3 3
3一 2 2 1 1 0 3一 1 3 1 4 1 0
2 1 2 0 1 4 2 2 0
.
0 0
3一 3 3 1 1 0 3一 1 4 2 4 1 0
3 1 2 0 2 4 2 2 0
.
0 0
3一 4 4 1 1 0 3一 1 6 3 4 1 0
4 1 2 0 3
’
4 2
’
2 0
.
0 0
3一 5 1 2 1 0 3一 1 6 4 4 1 0
1 2 2 0 4 4 2 4 0
。
0 0
3一 6 2 2 1 0 补充试验
2 2 2 0 3一 1 7 4 5 1 0
3一 7 3 2 1 0 4 5 2 0
3 2 2 0 3一 1 8 4 6 1 9 2 。 3 1
3一 8 4 2 1 0 4 6 2 0
4 2 2 0 T 1 7 0
.
0 0 0 9 2
.
3 1 T
: .
2 9 2
.
3 1
3一 9 1 3 1 0 T Z 3 6 . 6 7 0 2 0 0 . 0 0
1 3 2 5 0
.
0 0 T 3 2 0
.
0 0 1 0 0
.
0 0
3一 10 2 3 1 0 T ` 7 3 . 3 3 1 0 0 . 0 0
2 3 2 1 6
.
6 7 T : o (参考值 )
3一 1 1 3 3 1 0 T ` 9 2 . 5 1 (参考值 )
3 3 2 0 R 5 3
.
3 3 1 0 0
.
0 0 1 0 7
.
6 9
4 7
表 5一 1一 1山 一 正交 I V统计
分析结果 (接种 1个月 )
A C T Bt
列 号 繁殖系数
(%)
4一 3 3 1 1 1 1. 3 3
12 1 1 0 0
.
0 0
4一 2 2 1 1 0
2 12 3 3
.
3 3
4一 3 3 1 1 0
13 2 16 0
.
0 0
4一 4 2 1 1 16 . 6 7
2 12 5 0
.
0 0
4一 2 52 1 5 0. ( 0 J
2 2 2 2 5
.
0 0
4一 6 2 3 1 0
2 3 2 1 0 0
。
0 0
4一 7 3 1 1 0
3 12 7 5
。
0 0
4一 8 3 2 1 0
3 2 2 1 0 0
。
0 0
4一 9 3 3 12 0. 0 0
3 3 2 3 3
。
33
T 13 26
.
6 6 27 5
.
002 1 0
.
00T
r:
7 9 6
.
66
T Z 24 1
.
6 7 2 08
.
3 3 6夕6 . 6 6
T 3 2 28
.
3 3 3 3 1
.
3 3
R 9 8
.
3 3 1 05
.
0 06 5 5
.
00
为此 , 将正交 皿 、 N 中的最优组合 继续
进行 了两次重复试验 。试验结果表明 , 正交 w
组合好于正交 l 组合 。 其 中最优处理均表现
为不含生长素的单因子启动式 , 诱导叶外植
体最优培养基为 M S + 6 一 B A Zm g / L , 最高
繁殖 系数达 58 4 . 62 % (2 个月 ) 。 诱导胚轴外
植体的最优培养基为 M S十 6 一 B A 0 . sm g /
L
, 最高繁殖系数达 2 23 . 08 % (2 个 月 )( 表 5
一 2 ) 。
以上四次试验中 , 两组合均 以叶基外植
体的分化率和繁殖系数最高 ,其最高繁殖 系
数为 5 84 . 62 % ,是胚轴外植体最高繁殖系数
( 2 2 3
.
0 8% ) 的 2 . 6 2 倍 (表 5一 2 ) 。 两次正交
试验的统计分析结果表明 , C 因素 (外植体 )
中 T Z (叶基 )水平之和 ( 2 0 0 . 0 0 , 6 7 6 . 6 6 )是 T l
(胚轴 ) 水平之和 ( 9 2 . 3 1 , 12 0 . 0 0 )的 2 , 1 7 、 5 ,
64 倍 , 叶基外植体的再生能力明显高于胚轴
外植体 (表 4一 l 一 1 , 5一 1一 l ) 。
两次正交试验 的统计分析结果表明 , 三
因素的互作效应完全一致 。 代表多元相关系
数的极差 ( R )均以 C 因素 (外植体 )为最大 ,
理处号
表 5一 2
接种
山野豌豆快繁正交 I 、 W重复试验结果
接种 成愈 成苗 篮殖
系数
备
M S
培养基
6一 B A N A A
( m g / L ) ( m g / L )
棵 块 块 肠 裸 % (% ) ( 日 /月 ) 注
外植体
0
0
0
0
1 9 2
.
3 1
5 8 4
.
6 2
2 2 3
.
0 8
4 5 0
.
0 0
2 1 / 3 19 90 年
2 1 / 3 补充 、
2 3 / 。 重复试验 ,
2 3 / 3 5 月调查 .
2 6 / 3
2 6 / 3
2 9 / 3
2 9 / 3
934
巴」14`U月,
0
。
1工0.1亡」24n乙
0n舀3CJ肠d几乃O1上1,峭.孟ù一月,ó4一 1 0 2 。 5
4一 1 1 3 . 0
亡J6Qù0,ó口.自OJ4一 9
4一 3
4一 9
4一 3
0
.
5
2
。
0
0
。
6
胚轴
叶
胚轴
叶
胚轴
口十
胚轴
叶
2 1 2
1 9 2
2 0 1
1 4 6
11 8
18 8
13 4
19 8
1 6 3
1 9 1
1 9 5
1 4 6
1 1 8
1 8 8
1 3 4
1 9 8
7 6
.
8 9
9 9
.
4 8
9 7 0 1
1 0 0
.
0 0
1 0 0
.
0 0
1 0 0
.
0 0
1 0 0
.
0 0
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是 A 、 B 因素的 5 .3 0一 5 .6 , 于音、表 4一 1一 l , 5
一 1一 1 ) 。 说明在外植体与外源激素的互作头
系中 , C 因素效应最大 , 即具有分化能力的外
殖体的选抒址垂要 。
图 1 山野豌豆的组织培养
1
. 愈伤组织 (芽原 墓 ) ; 2 . 颗 粒状 胚性愈 伤组织 ; 3 . 球形胚性愈伤组织 注 . 丛生芽沛 . 丛生苗 ; ` . 无根苗 ; 7 . 生根 , 8 . 移栽 ; 9 . 正
常再生植株 (左 ) , 变异再生植株 (右 ) ; 10 . 结荚成熟 ; 1 1 . 正常叶 ; 12 . 变异叶。
生 长与分化情 况 : 叶基 外 植体接种在 21 . 19 ~ 21 . 64 % , 繁殖系数为 19 2 . 31 一 2 2 3 .
M S十 6一 B A Zm g / L 、 胚轴外植体接种在 M S 08 % ; 叶基外殖体的 分化率为 40 . 43 ~ 45 .
+ 6 一 B A 0 . s m g / L 培养基上 , 暗培养一周左 45 % 。 繁殖系数为 4 50 . 0 一 58 4 . 能% (表 5一
右在胚轴外植体的两侧即产生白色致密的愈 2) 。 两种外植体均在同一种培养基上完成诱
伤组织 ,在 叶外植体的两侧产 生黄色透 明的 导和分化 ,直接形成再生苗 ;愈伤组织也在原
愈伤组织 ,随后愈伤组织向中段增殖 , 叶基外 培养基上继代培养 , 可不断分化出新的再生
植体逐渐 呈 U 型 , 胚轴外植体呈哑铃型 , 诱 苗 。 cZ m 以上的无根苗转移至生根培养基 , 15
导率为 72 一 10 0% (表 5 一 1 ) 。 愈伤组织移至 夭左右开始生根 , 生根率达 10 0% , 随后形成
光照下培养 20 夭左右 , 即由黄白色转变为黄 完整的再生植株 。 胚轴再生植株移栽成活率
绿 色 , 在较光滑而致密的浓绿色愈伤组织表 为 1 0 % , 叶基再生植株成活率为 60 % ,并出
面突出许多小米粒大小的白色颗粒组织 ,逐 现一株株型变异 , 即 由甸旬型变为直立矮化
渐形成丛芽体和丛生芽 , 30 天左右即可形成 型 , 叶片也增大 、 增厚 。胚轴 、 叶基再生植株均
2一 cs m 的无根苗 。 胚轴外植体的分化率为 能结荚成熟 。