全 文 :收稿日期:2011-09-22
1)基金项目:辽宁省高等教育教学改革资助项目(20090304);辽宁师范大学教学改革资助项目(LSJG20090108)
东风菜叶柄无性系建立研究1)
乔雪,姜宇,王巍,张冬艳,姜长阳*
(辽宁师范大学生命科学学院,辽宁 大连 116081)
摘 要:为保护野生资源,满足人工栽培的需要,以东风菜叶柄为材料,进行了愈伤组织诱导、分化培养,
不定芽生根培养,试管苗生根继代增殖培养、移栽、定植的研究,建立起变异植株的无性系。结果表明:
MS+2,4-D2.5mg/L是叶柄愈伤组织培养的理想培养基;MS+GA30.5mg/L+AgNO31.5mg/L+
NAA 0.1mg/L是愈伤组织分化培养的理想培养基;用NAA20mg/L的无菌溶液对不定芽切口进行处
理后,接种到 White+IAA0.1mg/L培养基上培养,是不定芽生根培养和试管苗生根继代培养的理想方
法;定植的试管苗保持了野生东风菜的所有植物学性状。
关键词:东风菜;愈伤组织;快速繁殖
The Study on Establishment of the Clone of Doellingeria scaber
Qiao Xue,Jiang Yu,Wang Wei,Zhang Dongyan,Jiang Changyang
(Colege of Life Science,Liaoning Normal University,Dalian 116081)
Abstract:The aim was to preserve the wild resources and meet the needs of false planting,stipes of Doelinge-
ria scaber were used as material to do the research on calus inducement and diferentiation,rooting of adventi-
tious buds and rooting multiplication of tube seedlings,transplantation of tube seedlings and established the
clone of variation plants.The results indicate that the best medium for calus induction of stipes was MS+2,4-
D2.5mg/L;MS+GA30.5mg/L+AgNO31.5mg/L+NAA 0.1mg/L was suitable for calus diferentiation;
the ideal method for rooting of adventitious buds and tube seedlings was cultivated in the medium White+IAA
0.1mg/L after the incisions were dealed with aseptic solution of NAA 20mg/L;the test tube seedlings trans-
planted maintained al botany characteristics of the wild Doelingeria scaber.
Key words:Doellingeria scaber;Calus;Rapid Propagation
东风菜(Doellingeria scaber)又称山蛤芦、仙白草、
盘龙草、白云草等,属于菊科东风菜属多年生直立草本
植物,在我国的北部、中部、东部、南部及东北有分布,
在辽宁省的沈阳、大连、鞍山、铁岭、丹东等地也有分
布。生长于阔叶林下、灌木丛中、林缘草地及路旁等环
境中[1-3]。东风菜根含有东风菜皂苷、东风菜苷、齐墩
果酸苷等药用成分。全草做中药用,具有化痰止咳、行
气止疼等功效,能治头疼目眩、肝热眼赤、风湿痹疼、跌
打肿痛、咳嗽、胃疼、疝气、蛇咬伤等疾病[4]。东风菜不
仅具有重要的药用价值,而且近年来辽宁南部地区的
农民还发现,把东风菜的干粉作为家禽饲料添加剂,能
明显降低家禽发病率和死亡率。因此,近年来,在辽宁
的南部地区,人们每年都多次采收东风菜作为草药出
售和家禽饲料添加剂。这使本来分布和数量就很少的
东风菜野生资源遭到了严重破坏。现在,在辽宁南部
地区已经很难采到野生东风菜。有人试图进行人工栽
培,但由于长期对此采收使其几乎不结种子。为保护
东风菜野生资源、实现栽培,从2006年开始,我们对东
风菜进行了组织培养及无性系建立的研究。虽然已多
有菊科植物组织培养及无性系建立的研究[5-10],但迄今
未见东风菜属植物组织培养和无性系建立研究的报道。
1 材料与方法
1.1 材料及来源
6月上旬,将旅顺山坡林缘生长旺盛的东风菜植株
地上部基生叶采回实验室后,剪下叶柄作为试验材料。
1.2 材料灭菌
参见李欢等侧金盏花的研究[11]。
1.3 培养条件
参见李欢等侧金盏花的研究[11]。
1.4 试验方法
1.4.1 愈伤组织诱导培养。把无菌叶柄切成长约
0.4cm的柄段后,接种到以LS、MS和 White 3种培养
4
第2期(总第117期) 中 国 林 副 特 产 No.2(GSNO.117)
2012年4月 Forest By-Product and Speciality in China Apr.2012
DOI:10.13268/j.cnki.fbsic.2012.02.014
基为基本培养基,附加浓度分别为1.5mg/L、2.0mg/
L、2.5mg/L的2,4-D、NAA的培养基上,进行叶柄愈
伤组织的诱导培养。叶柄愈伤组织诱导培养试验重复
3次,每种培养基接种培养100个茎段。
1.4.2 叶柄愈伤组织分化培养。把由叶柄诱导培养
的愈伤组织用镊子在无菌培养皿中将其分散为直径
1.0cm的块状后,接种到以 MS+GA30.5mg/L+Ag-
NO31.5mg/L为基本培养基,附加不同浓度6-BA和
NAA的培养基上,进行愈伤组织的分化培养。愈伤组
织分化培养试验重复3次,每种处理接种100块愈伤
组织。
1.4.3 不定芽的生根培养。把分化培养的不定芽从
基部切下后,把下部切口分别在IBA 20mg/L、NAA
20mg/L和2,4-D 20mg/L的无菌溶液中处理5min
后,接 种 到 White+IAA 0.1mg/L、1/2MS+IAA
0.1mg/L、N6+IAA 0.1mg/L 3种培养基上,进行不定
芽生根培养。生根培养试验重复3次,每种培养基接
种100个不定芽。
1.4.4 试管苗移栽与定植。3月下旬,把生长着生根
继代增殖培养的试管苗移到温室中,去掉瓶塞,在光照
下炼苗2d后,将试管苗取出,把根部在20mg/L的
IAA溶液中处理3min后,移栽到上半层为干净河沙、
下层为园土的温室营养钵中。移栽后前10d要保持
湿度90%左右、没有直射光的环境条件,之后按照温
室内正常条件管理。移栽试验重复2次,移栽试管苗
均为500株。
把在温室中移栽成活的试管苗于5月上旬定植到
大连郊区的山坡林缘上。定植试验重复2次,定植的
株数均为450株。定植后按照野生环境条件管理。
2 结果及分析
2.1 不同基本培养基、不同浓度生长素对叶柄愈伤组
织诱导培养的影响
培养到50d时观察统计,结果见表1。由表1可
见,培养基中添加NAA不能诱导形成愈伤组织;以LS
和 White为基本培养基,也几乎不能诱导培养出愈伤
组织。以 MS为基本培养基,诱导培养出愈伤组织的
效果较好。其中在 MS+2,4-D2.5mg/L的培养基上,
不仅愈伤组织的诱导率达到了85%,而且愈伤组织生
长旺盛。观察还表明,在 MS+2,4-D2.5mg/L的培养
基上,接种后10d左右,约30%培养材料的切口开始膨
大,随后愈伤组织开始迅速生长。培养到50d时,培养
材料就会生长为直径0.7~1.6cm、表面呈颗粒状、嫩
绿色的愈伤组织。前人研究认为,这样的愈伤组织为
具有分化力的愈伤组织[12-13]。把这种愈伤组织接种到
相同的培养基上进行愈伤组织的继代培养,经过45d
的培养,又会培养出一代外观不变、生长旺盛的愈伤组
织。2次重复试验的结果基本一致。以上结果说明:
MS+2,4-D2.5mg/L这一培养基是东风菜叶柄愈伤
组织培养的理想培养基。
表1 不同基本培养基、不同浓度生长素对
叶柄愈伤组织诱导培养的影响
培 养 基 愈伤组织诱导率/% 愈伤组织长势
LS+2,4-D1.5mg·L-1 0 -
LS+NAA1.5mg·L-1 0 -
MS+2,4-D1.5mg·L-1 44 +
MS+NAA1.5mg·L-1 0 -
White+2,4-D1.5mg·L-1 0 -
White+NAA1.5mg·L-1 0 -
LS+2,4-D2.0mg·L-1 6 +
LS+NAA2.0mg·L-1 0 -
MS+2,4-D2.0mg·L-1 76 ++
MS+NAA2.0mg·L-1 0 -
White+2,4-D2.0mg·L-1 0 -
White+NAA2.0mg·L-1 0 -
LS+2,4-D2.5mg·L-1 11 +
LS+NAA2.5mg·L-1 0 -
MS+2,4-D2.5mg·L-1 85 ++
MS+NAA2.5mg·L-1 0 -
White+2,4-D2.5mg·L-1 0 -
White+NAA2.5mg·L-1 0 -
注:++长势旺盛;+长势一般;-为不生长。下表同。
2.2 不同浓度生长调节剂对愈伤组织分化培养的影响
表2 不同浓度生长生长调节剂对愈伤组织分化培养的影响
6-BA/
(mg·L-1)
NAA/
(mg·L-1)
分化率/
%
分化不定芽数/
块
不定芽长势
0 0.1 0 0 -
0 0.3 0 0 -
0 0.6 0 0 -
0 0.9 0 0 -
0.3 0.1 91 4.6 ++
0.3 0.3 67 4.6 +
0.3 0.6 13 1.9 +
0.3 0.9 0 0 -
0.6 0.1 67 4.4 ++
0.6 0.3 50 4.2 +
0.6 0.6 16 2.3 +
0.6 0.9 0 0 -
1.2 0.1 0 0 -
1.2 0.3 0 0 -
1.2 0.6 0 0 -
1.2 0.9 0 0 -
培养到50d观察统计,结果见表2。由表2可见,
培养基中不加6-BA和添加的6-BA浓度达到1.2mg/
L时,培养的愈伤组织不能分化;培养基中加入的
NAA浓度达到0.9mg/L时,培养的愈伤组织也不能
分化;培养基中加NAA浓度为0.6mg/L时,愈伤组织
的分化效果也不理想;培养基中加入的 NAA浓度为
0.1mg/L时,愈伤组织的分化效果最理想,不仅分化率
为91%、每块培养的愈伤组织可分化出4.6个不定芽,
而且分化的不定芽长势旺盛。观察还表明,接种后5d
左右愈伤组织开始生长分化;培养到15d时,绿色的愈
伤组织上就会分化出许多不定芽;培养到50d时,就
会分化出高为0.5~1.1cm、具有4~7个叶片、呈丛生
状地不定芽。3次重复试验的结果基本一致。以上结
果证明:MS+GA30.5mg/L +AgNO31.5mg/L +
5
2012年 乔雪等:东风菜叶柄无性系建立研究 第2期
NAA 0.1mg/L这种培养基是东风菜愈伤组织分化培
养的理想培养基。
2.3 不同生长素、不同培养基对不定芽生根培养的影响
表3 不同生长素、不同培养基对不定芽生根培养的影响
培养基 生长素
生根率
%
生根条数
/株
试管苗
长势
White+IAA0.1mg·L-1 IBA20mg·L-1 23 1.9 -
1/2MS+IAA0.1mg·L-1 IBA20mg·L-1 0 0 -
N6+IAA0.1mg·L-1 IBA20mg·L-1 0 0 +
White+IAA0.1mg·L-1 NAA20mg·L-1 95 6.6 ++
1/2MS+IAA0.1mg·L-1 NAA20mg·L-1 81 4.3 +
N6+IAA0.1mg·L-1 NAA20mg·L-1 0 0 -
White+IAA0.1mg·L-1 2,4-D20mg·L-1 0 0 -
1/2MS+IAA0.1mg·L-1 2,4-D20mg·L-1 0 0 -
N6+IAA0.1mg·L-1 2,4-D20mg·L-1 0 0 -
接种后28d观察统计,结果见表3。由表3可见,
用2,4-D 20mg/L的无菌溶液对不定芽的基部切口进
行处理和在 N6+IAA 0.1mg/L的培养基上,不定芽
均不能生根;用IBA 20mg/L的无菌溶液对基部切口
进行处理,不定芽的生根效果也较差。把下部切口在
NAA20mg/L的无菌溶液中处理5min后,接种到以
White+IAA0.1mg/L、1/2MS+IAA0.1mg/L 2种培
养基上,生根效果较好。其中在 White+IAA0.1mg/L
培养基上的生根效果最好,不仅生根率达到了95%、
平均每株试管苗生根6.6条,而且试管苗外观上长势
好。观察也表明,把在 NAA20mg/L的无菌溶液中处
理5min后的不定芽接种到 White+IAA0.1mg/L培养
基上,培养4d可见下部切口处长出新根。接着,伴随
着根的生长,根数也在不断增加。培养到28d时,就会
培养生长为高3.5~5.1cm、具有4~8个叶片、茎粗
0.2cm左右、根为白色的旺盛试管苗。把上述培养的
旺盛试管苗剪成至少具有2个叶片(实际上是具有2
个生长点)的茎段后,接种到相同的生根培养基上,进
行试管苗的生根继代增殖培养。3次重复试验,每次继
代培养5代结果证明:经过26d的培养,就会培养出1
代平均生根率为96.6%、繁殖系数为2.8(按照这个速
度,一年能繁殖速度约170万)、其长势与不定芽生根培
养的试管苗一致的1代试管苗。以上结果证明:用
NAA20mg/L的无菌溶液对不定芽切口进行处理后,接
种到 White+IAA0.1mg/L培养基上培养是东风菜不定
芽生根培养和试管苗生根继代培养的理想方法。
2.4 试管苗移栽与定植的效果
观察表明,移栽后8d可见成活并开始生长新叶。
30d统计证明:2次移栽的平均成活率为94.5%。
定植后30d统计证明:2次定植共成活892株,平
均成活率为99.1%。这说明试管苗容易定植成活。
定植后观察表明,定植后前30d生长缓慢,随后生
长速度加快,植株生长旺盛。同时,试管苗保持了野生
东风菜所有的生物学性状。
3 讨论
目前已经报告的植物愈伤组织诱导材料,大多数
使用子叶和下胚轴[12]。这是因为这两种植物组织幼
嫩,分化的程度低,具有较强的分化能力。由于叶柄愈
伤组织诱导率很低[14],几乎不把叶柄作为愈伤组织的
诱导材料。而本研究以叶柄为材料,也获得了具有很
强分化力的愈伤组织。这证明高度分化的叶柄细胞也
具有全能性。
本研究所获得的试管苗保持了野生东风菜的所有生
物学性状说明,通过本研究所建立的无性系技术为实现
东风菜的人工栽培和野生资源的保护奠定了技术基础。
在试管苗的继代增殖培养中,出现了培养周期比
不定芽生根培养周期缩短的2d的现象。产生这种现
象主要是由以下原因引起的:试管苗的茎段粗壮旺盛、
自身抗性强、适应性强。
参 考 文 献
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作者简介:乔雪(1990-),女,辽宁大连人,在读本科生,
从事植物组织培养研究。*通讯作者:姜长阳(1953-),男,
辽宁大连人,教授,从事植物技术研究,E-mail:changy-
angjiang@126.com。
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2012年 中 国 林 副 特 产 第2期