全 文 ：肿瘤药学 2014 年 6 月第 4 卷第 3 期　Anti-tumor Pharmacy, June 2014, Vol. 4, No. 3- 176 -
作者简介：白军，男，主治医师，研究方向：妇科肿瘤，E-mail：shushuanlao@163.com。
●基础研究●
金粉蕨素体外诱导人宫颈癌 HeLa 细胞凋亡的机制
白　军1，杨　春2，唐　敏3，陈文增1，陈　丽1
（1杭州市红十字会医院妇产科，浙江　杭州，310003；2浙江省立同德医院急诊科，浙江　杭州，310012；
3湖南省马王堆医院妇产科，湖南　长沙，410016）
摘要：目的　探讨金粉蕨素（ONY）体外诱导人宫颈癌 HeLa 细胞凋亡的作用及其分子机制。方法　体外培养
人宫颈癌 HeLa、CaSki、SiHa、ME180 细胞，采用 MTT 法检测 ONY 对人宫颈癌 HeLa、CaSki、SiHa、ME180 细胞生
长抑制率的影响；Hoechst33258 染色检测 ONY 对人宫颈癌 HeLa 细胞凋亡的形态学变化；流式细胞术（FCM）检测
ONY 对 HeLa 细胞凋亡率的影响；DNA 琼脂糖电泳检测 HeLa 细胞凋亡的 DNA 条带；Western blot 分析凋亡相关
蛋白表达变化。结果　ONY 对人宫颈癌 HeLa、CaSki、SiHa、ME180 细胞生长有较强的抑制作用，呈剂量和时间
依赖性，以 HeLa 细胞对 ONY 最为敏感，作用 24 h 的 IC50 值为 10.48 μg·mL-1。经 ONY 作用于 HeLa 细胞 24 h 后，
细胞出现典型的凋亡形态学改变，表现出典型的凋亡特征的亚二倍体峰，且呈剂量依赖性，同时出现典型的凋亡
DNA 条带；同时，cytochrome c、caspase-9 和 caspase-3 蛋白表达增加，bcl-2 蛋白表达下调，而 bax 蛋白表达不变，
Bcl-2/Bax 比值下调（P<0.05）。结论　ONY 可能通过调控线粒体途径相关蛋白抑制宫颈癌 HeLa 细胞增殖并诱导
其凋亡。
关键词：宫颈癌；金粉蕨素；凋亡；增殖；线粒体凋亡途径
中图分类号：R737.33　文献标识码：A　文章编号：2095-1264（2014）03-0176-06
doi：10.3969/j.issn.2095-1264.2014.035
Mechanisms of Onychin Induced Apoptosis in Human Cervical Cancer
HeLa Cell line in vitro
BAI Jun1, YANG Chun2, TANG Min3, CHEN Wenzeng1, CHEN Li1
(1Department of Gynecology and Obstetrics, Hangzhou Red Cross Hospital, Hangzhou, Zhejiang, 310003, China;
2Department of Emergency, Tongde Hospital of Zhejiang Province, Hangzhou, Zhejiang, 310012, China; 3Depart-
ment of Gynecology and Obstetrics, Mawangdui Hospital, Changsha, Hunan, 410016, China)
Abstract: Objective To investigate the effects and mechanisms of Onychin (ONY) on the apoptosis in human cervical can-
cer HeLa cell line in vitro. Methods Human cervical cancer lines HeLa, CaSki, SiHa, ME180 were cultured in vitro. The effects
of ONY on the growth inhibition ratio of HeLa, CaSki, SiHa, ME180 cells were evaluated by the MTT assay. The effects of ONY
on the apoptosis of HeLa cells were detected through morphological observation by Hoechst33258 staining, flow cytometric
analysis (FCM), and agarose gel electrophoresis. The expressions of proteins related to apoptosis were analyzed by western blot.
Results ONY significantly inhibited the growth and proliferation of human cervical cancer cell lines HeLa, CaSki, SiHa, ME180
in a dose- and time-dependent manner. HeLa cell was the most sensitive one among the four kinds of cells, and its IC50 was
10.48 μg·mL-1 for 24 h. The cells treated with ONY for 24 h showed typical morphological change of apoptosis, increased cells
of sub-G1 population in dose-dependent manner and typical DNA ladder of agarose gel electrophoresis. Western blot showed
the expressions of cytochrome-c, caspase-9 and caspase-3 protein were up-regulated, and protein expression of Bcl-2 was
depressed, while Bax protein expression level had not changed. The ratio of Bcl-2/Bax was down-regulated after treatment with
ONY in a concentration dependent manner. Conclusion ONY may inhibit the proliferation and induce the apoptosis of human
cervical cancer HeLa cells through mitochondrial apoptosis pathway in vitro.
Key words: Cervical cancer; Onychin; Apoptosis; Proliferation; Mitochondrial apoptosis pathway
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前言
　　金粉蕨素（5-hydroxy-7-rhamnosylglucosyl fla-
vone，Onychin，ONY）是从中国蕨科（Sinopteridaceae）
金粉蕨属（Onychium Ching）栗柄金粉蕨（Onychium
lucidum）中提取获得的一种二氢黄酮苷，具有抗肿
瘤［1］、抗氧化、保护内皮细胞的作用［2］，但是对抗肿
瘤作用的机制尚不清楚。本研究观察了 ONY 对体
外培养的人宫颈癌 HeLa、CaSki、SiHa、ME180 细胞
生长增殖和凋亡的影响，并选取 HeLa 细胞进一步
探讨了 ONY 在体外诱导 HeLa 细胞凋亡的可能的
分子机制。
1　材料和方法
1.1　实验材料　ONY 由南华大学肿瘤研究所提
取、分离、纯化获得，人宫颈癌 HeLa、CaSki、SiHa、
ME180 细胞株购自中国典型培养物保藏中心（武
汉），RPMI-1640（美国 Gibco 公司），新生小牛血清
（杭州四季青公司），DMSO（美国 Amresco 公司），
MTT、琼脂糖（美国 Sigma 公司），Hoechst33258 染
色试剂盒（海门 Beyotime 公司），兔抗 Bax 单克隆抗
体、鼠抗 bcl-2 单克隆抗体、鼠抗 cytochrome-c 单克
隆抗体、鼠抗 caspase-9 和 caspase-3 多克隆抗体、
actin 抗体（海门 Beyotime 公司）。
1.2　实验方法
1.2.1　细胞培养　用含 10 ％小牛血清的 RPMI-
1640 培养基，置 37℃、CO2 体积分数为 5％的饱和
湿度条件下培养。细胞贴壁生长，取对数生长期细
胞用于实验［3］。
1.2.2　MTT 比色测定　将 HeLa、CaSki、SiHa、
ME180 细胞以每孔 180 μL（含 5×103 细胞）接种于 96
孔培养板。培养细胞至对数生长期，加入 20 μL 含不
同浓度 ONY 的培养基。每组设 5 个复孔，分别作用
24 h 和 48 h，然后每孔加入 MTT（5 mg·mL-1）20 μL 继
续培养 6 h，吸弃培养基，加入 100 μL DMSO，振荡 10
min 使紫蓝色沉淀充分溶解，用酶标仪（ELX-800）以
570 nm 波长检测吸光度（A）值，计算相对细胞活性抑
制率（IR）：IR=（1-A 实验组均值 /A 空白对照组均值）×100％，按
改良寇氏法求出 IC50 值［4］。以上实验重复 3 次。
1.2.3　Hoechst33258 染色　HeLa 细胞以每孔
900 μL（含 5×103 细胞）接种于 24 孔培养板培养
6 h，待细胞贴壁后加入 100 μL 不同处理因素，使
ONY 终浓度为 3、10、30 μg·mL-1；阳性药物对照组
终浓度为 DDP 0.3 ng·nL-1；溶媒对照组终浓度为
1％ DMSO；空白对照组为 NS（用含 10％小牛血清
的培养基培养细胞）。培养 24 h 后 Hoechst33258 染
色，以紫外光 340 nm 波长激发，荧光显微镜下观
察、摄片［5］。以上实验重复 3 次。
1.2.4　碘化丙啶染色 FCM 分析　取 1％小牛血清
同步化处理 24 h 的 HeLa 细胞，用含不同受试物的
10％小牛血清的培养基继续培养 24 h（实验分组同
Hoechst33258 染色），收集细胞，用冰 PBS 洗 2 遍，用
4℃、70％的乙醇固定 24 h 后，碘化丙啶 4℃避光染
色［6］，流式细胞仪检测。以上实验重复 3 次。
1.2.5　DNA 琼脂糖电泳　用含不同受试物的 10％
小牛血清（实验分组同 Hoechst33258 染色）分别处
理 HeLa 细胞 24 h 后，用冰 PBS 洗 3 次，加入细胞
裂解液［3］，37℃过夜，加入 1.5 mol·L-1 NaCl，离心除
去沉淀。向上清液中加 75％无水乙醇，-20℃静置
2 h，离心 30 min 除去上清液，将沉淀空气干燥后，
用适量 TE（10 mmol·L-1 Tris, 0.1 mmol·L-1 EDTA，pH
8.0）溶解，并加入 200 μg·mL-1 RNA 酶，37 ℃反应
2 h，与适量加样缓冲液混匀后，用 1.5 ％琼脂糖凝
胶在 50 V 恒压下电泳，EB 染色，紫外透射反射仪
下检测，并用自动成像系统（Polaroid）拍照［7］。以上
实验重复 3 次。
1.2.6　Western blot 印迹检测　用含不同受试物
的 10％小牛血清（实验分组同 Hoechst33258 染色）
分别处理 HeLa 细胞 24 h 后，用冰 PBS 洗 3 次，加
入细胞裂解液提取蛋白［8］，用 BCA 蛋白定量试剂盒
测定蛋白浓度，取 30 μg 样品用 SDS-PAGE 电泳分
离，然后将蛋白转移至 PVDF 膜上，再用 5％脱脂牛
奶 -TBST 室温摇床封闭 2 h，一抗于 37℃温育 3 h，
二抗于 37 ℃温育 1 h，ECL 发光剂激发荧光，压片
显影定影，结果用灰度扫描仪处理分析［8］。以上实
验重复 3 次。
1.3　统计学处理　采用 SPSS 13.0 软件行 One-Way
ANOVA 分析，实验数据用均数±标准差（x±s）表
示，两组间比较采用 q 检验，以 P<0.05 为差异有统
计学意义。
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2　结果
2.1　ONY 对多种人宫颈癌细胞株生长增殖的影
响　不同浓度（0.1, 0.3, 1.0, 3, 10, 30 μg·mL-1）的
ONY 处理 HeLa、CaSki、SiHa、ME180 细胞 24 h 后，
ONY 对各种宫颈癌细胞呈现不同程度的抑制作
用，与 CaSki、SiHa、ME180 组相比，ONY 对 HeLa 细
胞的抑制作用更明显（P<0.05）；将不同浓度 ONY
对 4 种宫颈癌细胞的作用时间延长至 48 h，抑制
率均增强，与 CaSki、SiHa、ME180 组相比，ONY 对
HeLa 细胞的抑制作用仍然最为明显（P<0.05）；用
0.30 ng·mL-1 DDP 处理 HeLa、CaSki、SiHa、ME180
细胞 24 h、48 h、72 h 后，随着作用时间的延长，DDP
对 HeLa 细胞的抑制作用渐趋增强，作用 48 h 后，其
抑制率与 CaSki、SiHa、ME180 组相比，差异有统计
学意义（P<0.05）。因此，选用 HeLa 细胞作为研究
对象，进一步探讨 ONY 抑制宫颈癌细胞生长增殖
的机制（见图 1，表 1）。

注：A：ONY作用24 h对宫颈癌细胞的抑制率；B：ONY作用48 h对宫颈癌细胞的抑制率；C：DDP0.30 ng·mL-1在不同时间段对
宫颈癌细胞的抑制率；与CaSki、SiHa、ME180组比较，*P< 0.05。
Note: A: Different concentrations of ONY inhibited proliferation of human cervical cancer cells at 24 h; B: Different concentrations
of ONY inhibited proliferation of human cervical cancer cells at 48 h; C: Inhibiting effects of 0.30 ng·mL-1 DDP on the proliferation of
human cervical cancer cells at different times; Compared with CaSki, SiHa, ME180 groups, *P< 0.05.
图1　不同浓度ONY对不同人宫颈癌细胞株生长增殖的抑制作用
Fig. 1　Inhibitive effects of different concentrations of ONY on the proliferation of different kinds of human cervical cancer cell lines
表1　不同浓度ONY对不同宫颈癌细胞系的细胞毒性
Tab. 1　Cytotoxicity of different concentrations of ONY on the
different kinds of human cervical cancer cell lines.
Cell line
IC50( μg·mL-1)
24 h 48 h
HeLa 10.56±2.28 -
CaSki >100 10.56±2.28
SiHa >100 10.56±2.28
ME180 >100 10.56±2.28
2 . 2 　 O N Y 对 H e L a 细 胞 凋 亡 的 影 响 　 采 用
Hoechst33258 染色检测 ONY 对 HeLa 细胞凋亡的影
响，结果显示，经 3、10、30 μg·mL-1 的 ONY 作用于
HeLa 细胞 24 h 后，空白对照组和溶媒对照组细胞
核大小较均一，呈圆形或椭圆形，染色质分布均匀，
在紫外线下呈均一的蓝色荧光；而 ONY 处理组和
DDP 组出现典型的凋亡形态学改变，胞体缩小，核
染色质浓缩，部分核染色体碎裂，且随 ONY 浓度的
增加，凋亡细胞数逐渐增多。见图 2。


注：A：NS组，B：1％ DMSO组C：DDP 0.30 ng·mL-1组，D：
ONY 3 μg·mL-1组，E：ONY 10 μg·mL-1组，F：ONY 30 μg·mL-1组。
Note: A: NS group, B: 1％ DMSO group, C: DDP 0.30
ng·mL-1 group, D: ONY 3 μg·mL-1 group, E: ONY 10 μg·mL-1
group, F: ONY 30 μg·ml-1 group.
图2　不同浓度的ONY对HeLa细胞凋亡的影响（×400）
Fig.2　Effects of different concentrations of ONY on the
apoptosis of human cervical cancer HeLa cells (×400)
　　采用 FCM 检测 ONY 对 HeLa 细胞凋亡的影响，
结果显示，经 3、10、30 μg·mL-1 ONY 和 0.3 ng·mL-1
DDP 作用于 HeLa 细胞 24 h 后，细胞出现典型凋亡
特征的亚二倍体峰，与 0.1 ％ DMSO 组之间比较，
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差异有统计学意义（P<0.01），ONY 各处理组之间比
较，差异亦有统计学意义（P<0.05），1％ DMSO 组与
NS 对照组之间比较，差异无统计学意义（P>0.05），
DDP 组诱导细胞凋亡与 30 μg·mL-1 ONY 组相当，两
组的差异无统计学意义（P>0.05），见图 3。


注：1：NS组，2：1％ DMSO组，3：DDP 0.30 ng·ml-1组，4：
ONY 3 μg·ml-1组，5：ONY 10 μg·ml-1组，6：ONY 30 μg·mL-1组；
与NS组比较，aP< 0.01；与ONY 3 μg·mL-1组比较，bP< 0.05。
Note: 1: NS group, 2: 1％DMSO group, 3：DDP 0.0.3
ng·mL-1 group, 4：ONY 3 μg·mL-1 group, 5：ONY 10 μg·mL-1
group, 6：ONY 30 μg·mL-1 group; Compared with 1％
DMSO group, aP< 0.01; compared with DDP 0.30 ng·mL-1
group, aP< 0.05.
图3　不同浓度ONY对HeLa细胞凋亡率的影响
Fig. 3　Effects of different concentrations of ONY on the
apoptosis rate of human cervical cancer HeLa cells
　　经 ONY 3、10、30 μg·mL-1 作用于 HeLa 细胞 24
h 后，行 DNA 琼脂糖凝胶电泳分析，结果显示，经
ONY 处理的 HeLa 细胞出现了典型凋亡的梯状条
带，进一步证实 ONY 能够诱导 HeLa 细胞凋亡（见
图 4）。
2.3　ONY 对 HeLa 细胞线粒体凋亡途径相关
蛋白表达的影响　 经 不 同 浓 度 的 O N Y（3 , 1 0 ,
30 μg·mL-1）处理 HeLa 细胞 24 h 后，Bcl-2 蛋白表
达下调，呈剂量依赖性，与空白对照组相比，差异
有统计学意义（P<0.05）；Cytochrome-c、Caspase-9
和 Caspase-3 表达上调，呈剂量依赖性，与空白对照
组比较，差异有统计学意义（P<0.05），而 Bax 蛋白
表达不变，与空白对照组比较，差异无统计学意义
（P>0.05）；Bcl-2/Bax 比值与空白对照组比较，差异
有统计学意义（P<0.05），见图 5。
3　讨论
　　宫颈癌是妇科最常见的恶性肿瘤之一，近年来
研究发现宫颈癌细胞对化疗敏感，新型化疗药物的
产生和新辅助化疗的应用，极大地提高了宫颈癌患
者的生存率和生存质量，开发新型肿瘤化疗药物仍
是肿瘤研发的首要任务之一［9］。凋亡是机体内个
别细胞程序性死亡的表现形式，由体内外因素触发
细胞内预存的死亡程序而导致细胞主动性死亡，在
生物胚胎发生发育、成熟细胞新旧交替、激素依赖
性生理退化、萎缩和老化以及自身免疫性疾病和肿
瘤发生发展中，都发挥着不可替代的重要作用［10］。
ONY 是从传统中药栗柄金粉蕨中提取获得的一种
二氢黄酮苷，具有抗肿瘤、抗氧化和保护内皮细胞
等作用。唐华贵等报道 ONY 可体外诱导人卵巢癌
COC1 细胞和 COC1/DDP 细胞凋亡，而对中国仓鼠
宫颈细胞株 CHO-K1 细胞的生长抑制作用不明显，
但 ONY 诱导细胞凋亡的机制至今尚未见报道［1］。
　　Bcl-2 蛋白是细胞凋亡的抑制成分，能够抑制
注：A：Mark组，B：NS组，C：1％ DMSO组，D：DDP 0.30
ng·mL-1组，E：ONY 3 μg·mL-1组，E：ONY 10 μg·mL-1组，G：
ONY 30 μg·mL-1组。
Note: A: Mark group, B: NS group, C: 1％ DMSO group,
D: DDP 0.30 ng·mL-1 group, E: ONY 3 μg·mL-1 group, F: ONY
10 μg·mL-1 group, G: ONY 30 μg·mL-1 group.
图4　不同浓度ONY对HeLa细胞凋亡生化特征的影响
Fig. 4　Effects of different concentrations of ONY on the
typical biochemistry characteristics of apoptosis in human cervi-
cal cancer HeLa cells
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线粒体外膜的通透性和阻止细胞色素 c 的释放，
调控内源性凋亡途径［11, 12］。Bax 蛋白是线粒体外
膜上的促凋亡蛋白，在线粒体外膜上形成通道，促
进细胞色素 c 释放，而线粒体通透性的转变是细
胞色素 c 释放的关键［13］。Bax 同源二聚体在线粒
体外膜上构成完整的细胞色素 c 释放通道，Bax 同
源二聚体的形成是线粒体凋亡途径的必要因素之
一［14］。Bcl-2 必须与 Bax 形成异源二聚体才能发
挥其抗凋亡作用，因此，两蛋白的相对表达水平是
调节凋亡进程的关键［15, 16］。细胞色素 c 进入胞浆
后，与 Apaf-1、ATP/dATP 结合成凋亡体复合物［17］，
可以激活 caspase-9［18, 19］，进一步水解 caspase-3 前
体蛋白，激活 caspase-3。而 caspase-3 是细胞凋亡
的执行者，可直接降解细胞内的结构蛋白和功能
蛋白，从而导致细胞凋亡，使细胞质、细胞核、细
胞骨架的重要蛋白降解失活，是执行细胞凋亡最
关键的酶，也是导致凋亡的蛋白酶级联反应中的
核心蛋白酶［20, 21］。本研究结果表明，ONY 作用于
人宫颈癌 HeLa 细胞，可显著抑制细胞增殖，促进
细胞凋亡；同时，调控内源性凋亡的线粒体途径
的关键蛋白 bcl-2 的表达随 ONY 浓度的增加而降
低，cytochrome c、caspase-9、caspase-3 蛋白表达增
高，而 Bax 蛋白的表达不变，Bcl-2/Bax 比值表达降
低，这提示 ONY 抑制宫颈癌 HeLa 细胞生长增殖
及诱导其凋亡可能与其调控线粒体凋亡途径的作
用有关。
　　综上所述，ONY 可能通过诱导细胞凋亡的线粒
体内源性途径抑制人宫颈癌 HeLa 细胞的生长增殖
并诱导其凋亡，可能作为治疗宫颈癌的新型化疗药
物，但目前的研究还仅限于体外实验，其在体内对
宫颈癌的作用尚有待于进一步研究。
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注：1：NS组，2：1％ DMSO组，3：DDP 0.30 ng·mL-1组，4：ONY 3 μg·mL-1组，5：ONY 10 μg·mL-1组，6：ONY 30 μg·mL-1组；A:不同
浓度的ONY对HeLa细胞凋亡相关蛋白表达的影响；B: Bcl-2蛋白相对灰度值；C: Bax蛋白相对灰度值；D: Bcl-2/Bax蛋白相对灰
度比值；E: Cytochrome-c 蛋白相对灰度值；F: caspase-9蛋白相对灰度值；G: caspase-3蛋白相对灰度值。
Note: 1: NS group, 2: 1％DMSO group, 3：DDP 0.0.3 ng·ml-1 group, 4：ONY 3 μg·mL-1 group, 5：ONY 10 μg·mL-1 group, 6：ONY
30 μg·mL-1 group; A: Effects of different concentrations of ONY on the expression of proteins related to apoptosis of human cervical can-
cer HeLa cells; B: Bcl-2 protein relative mean density; C: Bax protein relative mean density; D: Bcl-2/Bax protein relative mean density;
E: Cytochrome-c relative mean density; F: caspase-9 protein relative mean density; G: caspase-3 relative mean density.
图5　不同浓度的ONY对宫颈癌HeLa细胞凋亡相关蛋白表达的影响
Fig. 5　Effects of different concentrations of ONY on the expression of proteins related to apoptosis in human cervical cancer HeLa cells
肿瘤药学 2014 年 6 月第 4 卷第 3 期　Anti-tumor Pharmacy, June 2014, Vol. 4, No. 3 - 181 -
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　　　　收稿日期：2013-12-28　校稿：王娟　李征
Cite this article as: Bai J, Yang C, Tang M, et al. Mechanisms of Onychin Induced Apoptosis in
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