全 文 ：·生物技术· 北方园艺２０１６（２２）：１０４～１０６
第一作者简介：周瑞金（１９７７－），女，博士，副教授，研究方向为果树
种质资源与生物技术。Ｅ－ｍａｉｌ：ｐｅｒｓｉｍｍｏｎｚｈｏｕ＠１６３．ｃｏｍ．
基金项目：河南省教育厅自然科学研究计划资助项目（２０１０Ａ２１０００８）；
河南省科技厅基础与前沿技术研究计划资助项目（１２２３００４１０１３３）；
河南科技学院大学生创新训练资助项目（２０１４ＣＸ０４７）。
收稿日期：２０１６－０８－１２
ＤＯＩ：１０．１１９３７／ｂｆｙｙ．２０１６２２０２６
无核君迁子离体叶片的植株再生
周 瑞 金，张 晓 娜，扈 惠 灵，李 桂 荣，宋 如 慧
（河南科技学院 园艺园林学院，河南 新乡４５３００３）
　　摘　要：以“赞圆无核”君迁子组培苗叶片为试材，研究了基本培养基类型、植物生长调节物
质浓度和暗期处理对离体叶片不定芽再生的影响，并获得了完整的再生植株。结果表明：最适宜
的基本培养基为ＭＳ（１／２Ｎ），最佳的生长调节剂组合为５．０ｍｇ·Ｌ－１　ＺＴ＋０．１０ｍｇ·Ｌ－１　ＩＡＡ，其
愈伤组织诱导率、不定芽形成率及平均出芽数分别达到９９．１％、８７．３％和５．４个；暗培养４周，再
转为光下培养２周效果最佳；将叶片再生植物转入（１／２Ｎ）ＭＳ＋０．５ｍｇ·Ｌ－１　ＺＴ＋０．０１ｍｇ·Ｌ－１　ＩＡＡ
培养基中继代培养，以１／２ＭＳ＋１．０ｍｇ·Ｌ－１　ＩＡＡ＋２０ｇ·Ｌ－１蔗糖＋７ｇ·Ｌ－１琼脂培养基诱导生
根，生根率６０．５％；生根苗大田移栽成活率６３％。
关键词：君迁子；叶片培养；植株再生
中图分类号：Ｓ　６６５．１０３．６　文献标识码：Ａ　文章编号：１００１－０００９（２０１６）２２－０１０４－０３
　　君迁子（Ｄｉｏｓｐｙｒｏｓ　ｌｏｔｕｓ　Ｌｉｎｎ．）属柿树科（Ｅｂｅｎａｃｅａｅ）
柿树属（Ｄｉｏｐｙｒｏｓ　ｋａｋｉ）植物［１］，又名黑枣、软枣，原产于
中国。君迁子根系发达，生活力强，寿命长，是中国北方
常用的柿树砧木。君迁子分为有核和无核２种类型，其
中无核类型以其营养价值高、可食部分多而成为研发食
品、饮料、保健品的理想原料［２］。君迁子多采用播种繁
育，但无核君迁子没有种子，自然繁殖较慢。近年来柿
属植物研究多集中于其功能成分分析，叶片再生体系研
究较少，但也取得一定进展［３－６］，但不同基因型之间再生
体系存在较大差异，而关于无核君迁子类型的研究尚鲜
见报道。该试验在甜柿组织培养及叶片再生技术基础
上，以“赞圆无核”君迁子无菌苗的幼嫩叶片为外植体，
研究了不同浓度配比的植物生长调剂对离体叶片植株
再生的影响，以期建立高效稳定的叶片再生体系，以期
为无核君迁子规模化生产提供技术支撑，同时为叶盘法
基因转化奠定基础。
１　材料与方法
１．１　试验材料
供试的“赞圆无核”君迁子采自河北赞皇，取休眠
芽培养获得组培苗无性系群体，在（１／２Ｎ）ＭＳ＋
０．５ｍｇ·Ｌ－１　ＺＴ＋０．０１ｍｇ·Ｌ－１　ＩＡＡ继代培养基中
继代培养１０代后，作为供试材料。
１．２　试验方法
１．２．１　不同基本培养基对不定芽诱导的影响　选择苗
龄３０ｄ的继代组培苗，在无菌条件下切取中上部第３～４
片幼嫩叶片，垂直主脉方向横切３～５刀，但不切断，随机
将叶片分为３组，分别接种至以 ＭＳ、（１／２Ｎ）ＭＳ、１／２ＭＳ
为基本培养基，添加５．０ｍｇ·Ｌ－１　ＺＴ和０．１ｍｇ·Ｌ－１
ＩＡＡ的诱导培养基上，叶片上表面朝下，对比观察基本
培养基种类对叶片不定芽诱导的影响。愈伤组织诱导
率（％）＝形成愈伤组织的叶片数／接种叶片数×１００。
１．２．２　不同激素组合对不定芽诱导的影响　以（１／２Ｎ）
ＭＳ为基本培养基，附加不同浓度的ＺＴ（３．０、４．０、５．０、
６．０ｍｇ·Ｌ－１）和ＩＡＡ（０．０１、０．１０ｍｇ·Ｌ－１），叶片上表面
朝下接种于培养基上，确定不同浓度ＺＴ和ＩＡＡ组合对
叶片不定芽诱导的影响，统计平均出芽数。平均出芽数＝
再生芽总数／再生叶片数。
１．２．３　暗处理时间对叶片不定芽诱导的影响　取组培
苗中上部叶片，上表面朝下接种于添加５．０ｍｇ·Ｌ－１　ＺＴ
和０．１０ｍｇ·Ｌ－１　ＩＡＡ的（１／２Ｎ）ＭＳ培养基上，随机分成
９组，暗处理０～８周后转至光照下培养，对比观察暗处
理时间对叶片不定芽诱导的影响，２周后统计叶片不定
芽再生情况。不定芽再生率（％）＝再生叶片数／接种叶
片数×１００。
１．２．４　培养条件　以上各处理每瓶接种６～８片叶，每
个处理６瓶，２瓶为１区组重复。培养期间不更换培养
基，所有培养基均添加ＰＶＰ　０．５ｇ·Ｌ－１，蔗糖３０ｇ·Ｌ－１
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北方园艺２０１６（２２）：１０４～１０６ ·生物技术·
和琼脂７．０ｇ·Ｌ－１，ｐＨ　５．８～６．０，１２１℃高压灭菌２０ｍｉｎ，
培养室温度（２５±１）℃，空气相对湿度７０％左右，光照强
度为１　５００～２　０００ｌｘ，光周期１２ｈ·ｄ－１。
１．２．５　生根与移栽　切取生长健壮的茎段接入生根培
养基中（１／２ＭＳ＋１．０ｍｇ·Ｌ－１　ＩＡＡ＋２０ｇ·Ｌ－１蔗糖＋
７ｇ·Ｌ－１琼脂，ｐＨ　５．８～６．０）诱导生根，培养条件同
上。生根苗练苗后移栽入基质（蛭石∶腐殖土∶田园
土＝２∶１∶２）中。
１．３　数据分析
试验数据采用ＳＰＳＳ　１９．０软件进行方差分析。
２　结果与分析
２．１　叶片不定芽再生过程
叶片接种后１周，叶片伤口处变黑，其它部位仍呈
翠绿色；接种后２周，叶片边缘膨胀翘起，变褐（图１－Ａ）；
接种后３周，部分叶片伤口处形成黑亮色且致密的愈伤
组织；接种后４周，愈伤组织体积不断膨大，且组织变得
蓬松（图１－Ｂ）；接种后５周，伤口愈伤组织表面形成米黄
色茸毛状的芽点，并逐渐分化出丛生芽（图１－Ｃ）；接种６
周以后，不定芽继续分化，不断伸长（图１－Ｄ）。
图１　叶片不定芽再生过程
Ｆｉｇ．１　Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　ｐｒｏｃｅｓｓ　ｏｆ　ｓｈｏｏｔ　ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ
２．２　基本培养基对不定芽再生的影响
由表１可知，３种基本培养基中，以（１／２Ｎ）ＭＳ诱
导形成不定芽效果最好，不定芽形成率最高，ＭＳ次之，
１／２ＭＳ效果最差。（１／２Ｎ）ＭＳ培养基中叶片愈伤组织
诱导率、不定芽形成率及平均出芽数分别达到９９．０％、
７８．５％和４．２个，显著高于其它处理。大部分柿组织培
　　表１ 基本培养基对不定芽再生的影响
　　Ｔａｂｌｅ　１　Ｅｆｅｃｔ　ｏｆ　ｂａｓａｌ　ｍｅｄｉｕｍｓ　ｏｎ　ｓｈｏｏｔ　ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ
基本培养基
Ｂａｓａｌ
ｍｅｄｉｕｍ
愈伤组织诱导率
Ｃａｌｕｓ　ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ
／％
不定芽形成率
Ｓｈｏｏｔ　ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ
／％
平均出芽数
Ａｄｖｅｎｔｉｔｉｏｕｓ　ｂｕｄｓ　ｐｅｒ　ｌｅａｆ　ｄｉｓｃ
／个
ＭＳ　 ８７．１ｂ ４６．３ｂ １．０±０．２ｃ
（１／２Ｎ）ＭＳ　 ９９．０ａ ７８．５ａ ４．２±１．２ａ
１／２ＭＳ　 ８４．６ｂ ３３．７ｃ ２．８±１．１ｂ
养最适培养基为１／２ＭＳ和（１／２Ｎ）ＭＳ［７］，该试验中无核
君迁子更适宜（１／２Ｎ）ＭＳ培养基，与谢启鑫等［６］的研究
结果不同，说明无核君迁子叶片再生需要较低的氮素培
养环境。
２．３　不同浓度的ＺＴ和ＩＡＡ组合对不定芽再生的影响
由表２可知，诱导效果最好的组合为５．０ｍｇ·Ｌ－１
ＺＴ＋０．１０ｍｇ·Ｌ－１　ＩＡＡ，不定芽形成率和平均出芽数分别
为８７．３％和５．４个。效果最差的组合为３．０ｍｇ·Ｌ－１　ＺＴ、
０．０１ｍｇ·Ｌ－１　ＩＡＡ，不定芽形成率和平均出芽数仅为
２８．３％和１．２个。随着ＺＴ浓度的升高，愈伤组织诱导
率及不定芽形成率均较高，但ＺＴ浓度过高时，形成的不
定芽容易产生玻璃化现象。
　　表２ 不同浓度的ＺＴ和ＩＡＡ组合对不定芽再生的影响
　　Ｔａｂｌｅ　２ Ｅｆｅｃｔ　ｏｆ　ＺＴ　ａｎｄ　ＩＡＡ　ｗｉｔｈ　ｄｉｆｅｒｅｎｔ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ　ｏｎ　ｓｈｏｏｔ　ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ
ＺＴ浓度
ＺＴ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ／（ｍｇ·Ｌ－１）
ＩＡＡ浓度
ＩＡＡ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ／（ｍｇ·Ｌ－１）
愈伤组织诱导率
Ｃａｌｕｓ　ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ／％
不定芽形成率
Ｓｈｏｏｔ　ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ／％
平均出芽数Ａｄｖｅｎｔｉｔｉｏｕｓ
ｂｕｄｓ　ｐｅｒ　ｌｅａｆ　ｄｉｓｃ
３．０　 ０．０１　 ６２．２ｆ ２８．３ｇ　 １．２±０．３ｇ
３．０　 ０．１０　 ６９．４ｅ ３５．７ｆ １．５±０．８ｇ
４．０　 ０．０１　 ７４．３ｅ ４９．４ｅ ２．０±０．８ｆ
４．０　 ０．１０　 ８７．８ｄ ５３．９ｅ ２．７±１．０ｅ
５．０　 ０．０１　 ９１．０ｂｃ　 ７９．１ｂ ３．１±０．９ｄ
５．０　 ０．１０　 ９９．１ａ ８７．３ａ ５．４±１．３ａ
６．０　 ０．０１　 ９３．７ａｂｃ　 ６２．５ｄ ４．８±１．１ｂ
６．０　 ０．１０　 ９５．１ａｂ　 ６５．２ｄ ４．３±１．４ｃ
７．０　 ０．０１　 ９０．５ｃｄ　 ７３．７ｃ ４．７±０．９ｂ
７．０　 ０．１０　 ９６．２ａｂ　 ７７．８ｂｃ　 ４．６±１．２ｂｃ
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·生物技术· 北方园艺２０１６（２２）：１０４～１０６
２．４　暗处理时间对不定芽再生的影响
由表３可知，暗处理６、７、８周时愈伤组织诱导率均
较高，但其不定芽形成率和平均出芽数均较暗培养４、５
周时产生少，综合比较，暗处理４周诱导效果最佳。
２．５　生根与移栽成苗
将以上试验中分化的不定芽继代培养于伸长培养基
（１／２Ｎ）ＭＳ＋０．５ｍｇ·Ｌ－１　ＺＴ＋０．０１ｍｇ·Ｌ－１　ＩＡＡ＋
３０ｇ·Ｌ－１蔗糖 ＋７ｇ·Ｌ－１琼脂中，继续培养４０ｄ，切取生
长健壮的茎段移至生根培养基１／２ＭＳ＋１．０ｍｇ·Ｌ－１
ＩＡＡ＋２０ｇ·Ｌ－１蔗糖＋７ｇ·Ｌ－１琼脂中，３０ｄ后生
根率６０．５％，平均不定根数４．７条，平均根长１．４ｃｍ。
当小苗有３条以上正常根，苗高至３～５ｃｍ时，开瓶练苗
７ｄ后移栽。移栽基质为蛭石∶腐殖土∶田园土＝２∶
１∶２，保湿培养。过渡３０ｄ后，将小苗移入大田，移栽成
活率６３％。　
　　表３ 暗处理时间对不定芽再生的影响
　　Ｔａｂｌｅ　３ Ｅｆｅｃｔ　ｏｆ　ｄａｒｋ　ｐｅｒｉｏｄ　ｏｎ　ｓｈｏｏｔ　ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ
暗处理时间
Ｄａｒｋ　ｐｅｒｉｏｄ
／周
愈伤组织诱导率
Ｃａｌｕｓ　ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ
／％
不定芽形成率
Ｓｈｏｏｔ　ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ
／％
平均出芽数
Ａｄｖｅｎｔｉｔｉｏｕｓ　ｂｕｄｓ
ｐｅｒ　ｌｅａｆ　ｄｉｓｃ
０　 ５３．４ｆ ４２．１ｈ １．０±０．３ｇ
１　 ８６．５ｅ ５７．３ｇ　 １．７±０．３ｆ
２　 ９０．２ｄ ６１．７ｆ ２．５±１．０ｅ
３　 ９３．０ｃ ６９．６ｅ ２．８±０．５ｅ
４　 ９６．０ｂ ８８．４ａ ５．４±１．１ａ
５　 ９７．３ｂ ８４．２ｂ ５．０±１．０ａｂ
６　 ９９．８ａ ７５．０ｄ ４．６±１．３ｂｃ
７　 １００．０ａ ７２．３ｄｅ　 ４．１±０．９ｄ
８　 １００．０ａ ７８．９ｃ ４．３±０．９ｃｄ
３　讨论
柿属植物组织培养和叶片再生体系建立相关研究
较少，多集中于甜柿研究，如马俊莲等［５］对“富有”和“次
郎”甜柿叶片再生植株进行研究时发现，ＴＤＺ可诱导离
体叶片产生大量愈伤组织，且随着浓度增加，愈伤组织
分化率和平均不定芽数增加，但当ＴＤＺ达１．０ｍｇ·Ｌ－１
时，诱导形成的不定芽多为丛状苗，节间短，不利于后期
生长。在诱导培养基中加入ＮＡＡ后，愈伤组织诱导率
达１００％，愈伤组织较大，颜色较深，但几乎没有不定芽
的再生。而课题组在选用其最佳培养基（１／２ＤＫＷ＋
１．０ｍｇ·Ｌ－１　ＺＴ＋１．０ｍｇ·Ｌ－１　ＴＤＺ）对君迁子叶片进
行诱导时，并未获得成果，说明君迁子虽与甜柿同属，但
种间差异较大，不能直接选用甜柿叶片再生培养基进行
叶片再生诱导。而ＺＴ是较为适宜君迁子组培快繁和诱
导叶片再生不定芽的细胞分裂素［６］。
君迁子叶片组织培养过程中“褐化”现象会影响愈
伤组织和不定芽形成，是阻断培养的一大障碍，在该试
验在培养基中加入０．５ｇ·Ｌ－１聚乙烯吡咯烷酮（ＰＶＰ）
有效防止了褐化现象，有利于叶片愈伤组织的诱导和不
定芽再生。
参考文献
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［２］　肖万魁．黑枣开发利用的探讨与研究［Ｊ］．现代农村科技，２０１１（８）：
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芽诱导［Ｊ］．果树学报，２００４，２１（４）：３７６－３７８．
［４］　马俊莲，刘晓娜，张子德．甜柿上西早生叶片不定芽再生的研究［Ｊ］．
中国农业科学，２００４，３７（１２）：２０１６－２０１８．
［５］　马俊莲，刘恺，张子德．“富有”和“次郎”甜柿叶片再生植株的研究
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国农业科学，２００８，４１（２）：６０７－６１２．
［７］　王海光，张国良，张淑云，等．柿组织培养技术研究进展［Ｊ］．河北农业
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Ｐｌａｎｔ　Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　Ｆｒｏｍ　Ｌｅａｖｅｓ　ｏｆ　Ｓｅｅｄｌｅｓｓ　Ｄａｔｅ　Ｐｌｕｍ（Ｄｉｏｓｐｙｒｏｓ　ｌｏｔｕｓ　Ｌ．）
ＺＨＯＵ　Ｒｕｉｊｉｎ，ＺＨＡＮＧ　Ｘｉａｏｎａ，ＨＵ　Ｈｕｉｌｉｎｇ，ＬＩ　Ｇｕｉｒｏｎｇ，ＳＯＮＧ　Ｒｕｈｕｉ
（Ｓｃｈｏｏｌ　ｏｆ　Ｈｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒｅ　ａｎｄ　Ｌａｎｄｓｃａｐｅ　Ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ，Ｈｅｎａｎ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｘｉｎｘｉａｎｇ，Ｈｅｎａｎ　４５３００３）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔａｋｉｎｇ　ｓｅｅｄｌｅｓｓ　Ｄｉｏｓｐｙｒｏｓ　ｌｏｔｕｓ　Ｌ．‘Ｚａｎｙｕａｎ　ｗｕｈｅ’ａｓ　ｔｅｓｔ　ｍａｔｅｒｉａｌ，ｆａｃｔｏｒｓ　ａｆｅｃｔｉｎｇ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｌｅａｆ　ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ
ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ　ｂａｓａｌ　ｍｅｄｉｕｍ，ｐｌａｎｔ　ｇｒｏｗｔｈ　ｒｅｇｕｌａｔｏｒ　ａｎｄ　ｄａｒｋ　ｐｅｒｉｏｄ　ｗｅｒｅ　ｓｔｕｄｉｅｄ．Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ａ　ｈｉｇｈ　ｅｆｉｃｉｅｎｔ
ｓｙｓｔｅｍ　ｏｆ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏｌｅａｆ　ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　ｗａｓ　ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ．Ｔｈｅ　ｓｕｐｅｒｉｏｒ　ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ　ｍｅｄｉｕｍ　ｗａｓ（１／２Ｎ）ＭＳ＋５．０ｍｇ·Ｌ－１　ＺＴ＋
０．１０ｍｇ·Ｌ－１　ＩＡＡ，ｄａｒｋ　ｉｎｃｕｂａｔｅｄ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｆｉｒｓｔ　ｆｏｕｒ　ｗｅｅｋｓ　ａｎｄ　ｔｈｅｎ　ｔｒａｎｓｆｅｒｒｅｄ　ｔｏ　ｌｉｇｈｔ　ｗａｓ　ｔｈｅ　ｍｏｓｔ　ｏｐｔｉｍｕｍ　ｆｏｒ　ｐｌａｎｔ
ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ，ａｎｄ　ｔｈｅ　ｃａｌｕｓ　ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ，ｔｈｅ　ｓｈｏｏｔ　ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ａｄｖｅｎｔｉｔｉｏｕｓ　ｂｕｄｓ　ｐｅｒ　ｌｅａｆ　ｄｉｓｃ　ｗｅｒｅ　９９．１％，８７％
ａｎｄ　５．４，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．（１／２Ｎ）ＭＳ＋０．５ｍｇ·Ｌ－１　ＺＴ＋０．０１ｍｇ·Ｌ－１　ＩＡＡ　ｗａｓ　ｓｕｉｔａｂｌｅ　ｆｏｒ　ｓｕｂｃｕｌｔｕｒｅ　ｏｆ　ｓｈｏｏｔ．Ｔｈｅ
ｒｅｇｅｎｅｒａｔｅｄ　ｐｌａｎｔｌｅｔｓ　ｒｏｏｔｅｄ　ｗｅｌ　ｉｎ　１／２ＭＳ＋１．０ｍｇ·Ｌ－１　ＩＡＡ＋２０ｇ·Ｌ－１　ｓｕｇａｒ＋７ｇ·Ｌ－１　ａｇａｒ，ｏｆ　ｗｈｉｃｈ　ｒｏｏｔｉｎｇ
ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ　ｗａｓ　６０．５％．Ｔｈｅ　ｓｕｒｖｉｖａｌ　ｒａｔｅ　ｏｆ　ｒｏｏｔｅｄ　ｐｌａｎｔｌｅｔｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｆｉｅｌｄ　ｗａｓ　６３％．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｄａｔｅ　ｐｌｕｍ（Ｄｉｏｓｐｙｒｏｓ　ｌｏｔｕｓ　Ｌ．）；ｌｅａｆ　ｃｕｌｔｕｒｅ；ｐｌａｎｔｌｅｔ　ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ
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