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无核君迁子离体叶片的植株再生



全 文 :·生物技术· 北方园艺2016(22):104~106
第一作者简介:周瑞金(1977-),女,博士,副教授,研究方向为果树
种质资源与生物技术。E-mail:persimmonzhou@163.com.
基金项目:河南省教育厅自然科学研究计划资助项目(2010A210008);
河南省科技厅基础与前沿技术研究计划资助项目(122300410133);
河南科技学院大学生创新训练资助项目(2014CX047)。
收稿日期:2016-08-12
DOI:10.11937/bfyy.201622026
无核君迁子离体叶片的植株再生
周 瑞 金,张 晓 娜,扈 惠 灵,李 桂 荣,宋 如 慧
(河南科技学院 园艺园林学院,河南 新乡453003)
  摘 要:以“赞圆无核”君迁子组培苗叶片为试材,研究了基本培养基类型、植物生长调节物
质浓度和暗期处理对离体叶片不定芽再生的影响,并获得了完整的再生植株。结果表明:最适宜
的基本培养基为MS(1/2N),最佳的生长调节剂组合为5.0mg·L-1 ZT+0.10mg·L-1 IAA,其
愈伤组织诱导率、不定芽形成率及平均出芽数分别达到99.1%、87.3%和5.4个;暗培养4周,再
转为光下培养2周效果最佳;将叶片再生植物转入(1/2N)MS+0.5mg·L-1 ZT+0.01mg·L-1 IAA
培养基中继代培养,以1/2MS+1.0mg·L-1 IAA+20g·L-1蔗糖+7g·L-1琼脂培养基诱导生
根,生根率60.5%;生根苗大田移栽成活率63%。
关键词:君迁子;叶片培养;植株再生
中图分类号:S 665.103.6 文献标识码:A 文章编号:1001-0009(2016)22-0104-03
  君迁子(Diospyros lotus Linn.)属柿树科(Ebenaceae)
柿树属(Diopyros kaki)植物[1],又名黑枣、软枣,原产于
中国。君迁子根系发达,生活力强,寿命长,是中国北方
常用的柿树砧木。君迁子分为有核和无核2种类型,其
中无核类型以其营养价值高、可食部分多而成为研发食
品、饮料、保健品的理想原料[2]。君迁子多采用播种繁
育,但无核君迁子没有种子,自然繁殖较慢。近年来柿
属植物研究多集中于其功能成分分析,叶片再生体系研
究较少,但也取得一定进展[3-6],但不同基因型之间再生
体系存在较大差异,而关于无核君迁子类型的研究尚鲜
见报道。该试验在甜柿组织培养及叶片再生技术基础
上,以“赞圆无核”君迁子无菌苗的幼嫩叶片为外植体,
研究了不同浓度配比的植物生长调剂对离体叶片植株
再生的影响,以期建立高效稳定的叶片再生体系,以期
为无核君迁子规模化生产提供技术支撑,同时为叶盘法
基因转化奠定基础。
1 材料与方法
1.1 试验材料
供试的“赞圆无核”君迁子采自河北赞皇,取休眠
芽培养获得组培苗无性系群体,在(1/2N)MS+
0.5mg·L-1 ZT+0.01mg·L-1 IAA继代培养基中
继代培养10代后,作为供试材料。
1.2 试验方法
1.2.1 不同基本培养基对不定芽诱导的影响 选择苗
龄30d的继代组培苗,在无菌条件下切取中上部第3~4
片幼嫩叶片,垂直主脉方向横切3~5刀,但不切断,随机
将叶片分为3组,分别接种至以 MS、(1/2N)MS、1/2MS
为基本培养基,添加5.0mg·L-1 ZT和0.1mg·L-1
IAA的诱导培养基上,叶片上表面朝下,对比观察基本
培养基种类对叶片不定芽诱导的影响。愈伤组织诱导
率(%)=形成愈伤组织的叶片数/接种叶片数×100。
1.2.2 不同激素组合对不定芽诱导的影响 以(1/2N)
MS为基本培养基,附加不同浓度的ZT(3.0、4.0、5.0、
6.0mg·L-1)和IAA(0.01、0.10mg·L-1),叶片上表面
朝下接种于培养基上,确定不同浓度ZT和IAA组合对
叶片不定芽诱导的影响,统计平均出芽数。平均出芽数=
再生芽总数/再生叶片数。
1.2.3 暗处理时间对叶片不定芽诱导的影响 取组培
苗中上部叶片,上表面朝下接种于添加5.0mg·L-1 ZT
和0.10mg·L-1 IAA的(1/2N)MS培养基上,随机分成
9组,暗处理0~8周后转至光照下培养,对比观察暗处
理时间对叶片不定芽诱导的影响,2周后统计叶片不定
芽再生情况。不定芽再生率(%)=再生叶片数/接种叶
片数×100。
1.2.4 培养条件 以上各处理每瓶接种6~8片叶,每
个处理6瓶,2瓶为1区组重复。培养期间不更换培养
基,所有培养基均添加PVP 0.5g·L-1,蔗糖30g·L-1
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和琼脂7.0g·L-1,pH 5.8~6.0,121℃高压灭菌20min,
培养室温度(25±1)℃,空气相对湿度70%左右,光照强
度为1 500~2 000lx,光周期12h·d-1。
1.2.5 生根与移栽 切取生长健壮的茎段接入生根培
养基中(1/2MS+1.0mg·L-1 IAA+20g·L-1蔗糖+
7g·L-1琼脂,pH 5.8~6.0)诱导生根,培养条件同
上。生根苗练苗后移栽入基质(蛭石∶腐殖土∶田园
土=2∶1∶2)中。
1.3 数据分析
试验数据采用SPSS 19.0软件进行方差分析。
2 结果与分析
2.1 叶片不定芽再生过程
叶片接种后1周,叶片伤口处变黑,其它部位仍呈
翠绿色;接种后2周,叶片边缘膨胀翘起,变褐(图1-A);
接种后3周,部分叶片伤口处形成黑亮色且致密的愈伤
组织;接种后4周,愈伤组织体积不断膨大,且组织变得
蓬松(图1-B);接种后5周,伤口愈伤组织表面形成米黄
色茸毛状的芽点,并逐渐分化出丛生芽(图1-C);接种6
周以后,不定芽继续分化,不断伸长(图1-D)。
图1 叶片不定芽再生过程
Fig.1 Regeneration process of shoot regeneration
2.2 基本培养基对不定芽再生的影响
由表1可知,3种基本培养基中,以(1/2N)MS诱
导形成不定芽效果最好,不定芽形成率最高,MS次之,
1/2MS效果最差。(1/2N)MS培养基中叶片愈伤组织
诱导率、不定芽形成率及平均出芽数分别达到99.0%、
78.5%和4.2个,显著高于其它处理。大部分柿组织培
  表1 基本培养基对不定芽再生的影响
  Table 1 Efect of basal mediums on shoot regeneration
基本培养基
Basal
medium
愈伤组织诱导率
Calus percentage
/%
不定芽形成率
Shoot percentage
/%
平均出芽数
Adventitious buds per leaf disc
/个
MS  87.1b 46.3b 1.0±0.2c
(1/2N)MS  99.0a 78.5a 4.2±1.2a
1/2MS  84.6b 33.7c 2.8±1.1b
养最适培养基为1/2MS和(1/2N)MS[7],该试验中无核
君迁子更适宜(1/2N)MS培养基,与谢启鑫等[6]的研究
结果不同,说明无核君迁子叶片再生需要较低的氮素培
养环境。
2.3 不同浓度的ZT和IAA组合对不定芽再生的影响
由表2可知,诱导效果最好的组合为5.0mg·L-1
ZT+0.10mg·L-1 IAA,不定芽形成率和平均出芽数分别
为87.3%和5.4个。效果最差的组合为3.0mg·L-1 ZT、
0.01mg·L-1 IAA,不定芽形成率和平均出芽数仅为
28.3%和1.2个。随着ZT浓度的升高,愈伤组织诱导
率及不定芽形成率均较高,但ZT浓度过高时,形成的不
定芽容易产生玻璃化现象。
  表2 不同浓度的ZT和IAA组合对不定芽再生的影响
  Table 2 Efect of ZT and IAA with diferent concentrations on shoot regeneration
ZT浓度
ZT concentration/(mg·L-1)
IAA浓度
IAA concentration/(mg·L-1)
愈伤组织诱导率
Calus percentage/%
不定芽形成率
Shoot percentage/%
平均出芽数Adventitious
buds per leaf disc
3.0  0.01  62.2f 28.3g  1.2±0.3g
3.0  0.10  69.4e 35.7f 1.5±0.8g
4.0  0.01  74.3e 49.4e 2.0±0.8f
4.0  0.10  87.8d 53.9e 2.7±1.0e
5.0  0.01  91.0bc  79.1b 3.1±0.9d
5.0  0.10  99.1a 87.3a 5.4±1.3a
6.0  0.01  93.7abc  62.5d 4.8±1.1b
6.0  0.10  95.1ab  65.2d 4.3±1.4c
7.0  0.01  90.5cd  73.7c 4.7±0.9b
7.0  0.10  96.2ab  77.8bc  4.6±1.2bc
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2.4 暗处理时间对不定芽再生的影响
由表3可知,暗处理6、7、8周时愈伤组织诱导率均
较高,但其不定芽形成率和平均出芽数均较暗培养4、5
周时产生少,综合比较,暗处理4周诱导效果最佳。
2.5 生根与移栽成苗
将以上试验中分化的不定芽继代培养于伸长培养基
(1/2N)MS+0.5mg·L-1 ZT+0.01mg·L-1 IAA+
30g·L-1蔗糖 +7g·L-1琼脂中,继续培养40d,切取生
长健壮的茎段移至生根培养基1/2MS+1.0mg·L-1
IAA+20g·L-1蔗糖+7g·L-1琼脂中,30d后生
根率60.5%,平均不定根数4.7条,平均根长1.4cm。
当小苗有3条以上正常根,苗高至3~5cm时,开瓶练苗
7d后移栽。移栽基质为蛭石∶腐殖土∶田园土=2∶
1∶2,保湿培养。过渡30d后,将小苗移入大田,移栽成
活率63%。 
  表3 暗处理时间对不定芽再生的影响
  Table 3 Efect of dark period on shoot regeneration
暗处理时间
Dark period
/周
愈伤组织诱导率
Calus percentage
/%
不定芽形成率
Shoot percentage
/%
平均出芽数
Adventitious buds
per leaf disc
0  53.4f 42.1h 1.0±0.3g
1  86.5e 57.3g  1.7±0.3f
2  90.2d 61.7f 2.5±1.0e
3  93.0c 69.6e 2.8±0.5e
4  96.0b 88.4a 5.4±1.1a
5  97.3b 84.2b 5.0±1.0ab
6  99.8a 75.0d 4.6±1.3bc
7  100.0a 72.3de  4.1±0.9d
8  100.0a 78.9c 4.3±0.9cd
3 讨论
柿属植物组织培养和叶片再生体系建立相关研究
较少,多集中于甜柿研究,如马俊莲等[5]对“富有”和“次
郎”甜柿叶片再生植株进行研究时发现,TDZ可诱导离
体叶片产生大量愈伤组织,且随着浓度增加,愈伤组织
分化率和平均不定芽数增加,但当TDZ达1.0mg·L-1
时,诱导形成的不定芽多为丛状苗,节间短,不利于后期
生长。在诱导培养基中加入NAA后,愈伤组织诱导率
达100%,愈伤组织较大,颜色较深,但几乎没有不定芽
的再生。而课题组在选用其最佳培养基(1/2DKW+
1.0mg·L-1 ZT+1.0mg·L-1 TDZ)对君迁子叶片进
行诱导时,并未获得成果,说明君迁子虽与甜柿同属,但
种间差异较大,不能直接选用甜柿叶片再生培养基进行
叶片再生诱导。而ZT是较为适宜君迁子组培快繁和诱
导叶片再生不定芽的细胞分裂素[6]。
君迁子叶片组织培养过程中“褐化”现象会影响愈
伤组织和不定芽形成,是阻断培养的一大障碍,在该试
验在培养基中加入0.5g·L-1聚乙烯吡咯烷酮(PVP)
有效防止了褐化现象,有利于叶片愈伤组织的诱导和不
定芽再生。
参考文献
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Plant Regeneration From Leaves of Seedless Date Plum(Diospyros lotus L.)
ZHOU Ruijin,ZHANG Xiaona,HU Huiling,LI Guirong,SONG Ruhui
(School of Horticulture and Landscape Architecture,Henan Institute of Science and Technology,Xinxiang,Henan 453003)
Abstract:Taking seedless Diospyros lotus L.‘Zanyuan wuhe’as test material,factors afecting in vitro leaf regeneration
including basal medium,plant growth regulator and dark period were studied.The results showed that a high eficient
system of in vitroleaf regeneration was established.The superior induction medium was(1/2N)MS+5.0mg·L-1 ZT+
0.10mg·L-1 IAA,dark incubated for the first four weeks and then transferred to light was the most optimum for plant
regeneration,and the calus percentage,the shoot percentage and the adventitious buds per leaf disc were 99.1%,87%
and 5.4,respectively.(1/2N)MS+0.5mg·L-1 ZT+0.01mg·L-1 IAA was suitable for subculture of shoot.The
regenerated plantlets rooted wel in 1/2MS+1.0mg·L-1 IAA+20g·L-1 sugar+7g·L-1 agar,of which rooting
percentage was 60.5%.The survival rate of rooted plantlets in the field was 63%.
Keywords:date plum(Diospyros lotus L.);leaf culture;plantlet regeneration
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