全 文 ：猪屎豆抗氧化活性成分的提取及活性测定体系的优化
姜佩佩1，纪明慧1，舒火明1，2* ，李 渊1
(1．海南师范大学，省部共建 －热带药用植物化学教育部重点实验室，海南海口 571158;2．琼台师范高等专科学校，海南海口 571100)
摘要 ［目的］研究猪屎豆(Crotalaria mucronata Desv．)乙醇提取物的抗氧化活性。［方法］采用超声波辅助乙醇提取法提取猪屎豆抗氧
化活性成分，用 H2O2-鲁米诺化学发光体系测定清除羟自由基(·OH)的效率。并对测定体系进行优化。［结果］在料液比为 3. 6∶ 1，乙
醇体积分数为 70%，提取时间为 30 min，提取温度为 80 ℃，猪屎豆乙醇提取物对·OH的清除效果最佳。清除率测定体系中，H2O2 浓度
为 0． 60%和 Luminol浓度为 1． 00 ×10 －4 mol /L时测定结果较准确。［结论］猪屎豆乙醇提取物对·OH有很好的清除作用。
关键词 猪屎豆;抗氧化;鲁米诺
中图分类号 S682． 39 文献标识码 A 文章编号 0517 －6611(2010)28 －15571 －03
Extraction of Antioxidant Active Components of Crotalaria mucronata Desv． and Optimization of Activity Determination System
JIANG Pei-pei et al (Key Laboratory of Tropical Medicinal Plant Chemistry of Ministry of Education，Hainan Normal University，Haikou，
Hainan 571158)
Abstract ［Objective］The aim is to study the antioxidant activity of ethanol extracts from Crotalaria mucronata Desv． ．［Method］The ultra-
sonic-assisted ethanol extraction method is adopted to extract the antioxidant active components of crotalaria mucronata Desv，chemilumines-
cence analysis in H2O2-Luminol system is used to determine efficiency of scavenging hydroxyl free radical and optimize the measurement sys-
tem． ［Result］Under the conditions that solid-to-liquid ratio is 3． 6∶ 1，ethanol concentration is 70%，extraction time is 30 min and tempera-
ture is 80 ℃，the test results are more accurate and crotalaria mucronata Desv． Shows the best scavenging effects on hydroxyl free radical．
［Conclusion］The ethanol extract of Crotalaria mucronata Desv． ． Shows good cavenging effects of hydroxyl free radical．
Key words Crotalaria mucronata Desv．;Antioxidation;Luminol
基金项目 海南省教育厅科研项目(Hj2010-19)。
作者简介 姜佩佩(1986 － ) ，男，江西鄱阳人，硕士研究生，研究方向:
天然产物化学。* 通讯作者，硕士，教授，硕士生导师，从事
天然产物化学方面的研究，E-mail:shuhm2000@ sina． com。
收稿日期 2010-07-30
猪屎豆(Crotalaria mucronata Desv．)为蝶形花科(Papil-
ionoideae)野百合属(Crotalaria Linn．)直立、矮小亚灌木，分
布于亚洲热带、非洲和美洲热带［1］。全草有散结、清湿热和
解痉等作用，民间常用来治疗手癣、足癣等症。近年来的研
究发现，猪屎豆对鳞状上皮癌和基底细胞癌有疗效［2］。中外
学者对多种野百合属植物进行了研究，发现该属植物主要含
生物碱［3 －5］、黄酮［6 －7］及苷［8］等成分，且大多具有较好的生物
活性，而关于猪屎豆的研究很少。韩桂秋等对猪屎豆种子生
物碱的提取和油成分进行了分析，并对猪屎豆种子提取的总
生物碱进行抗肿瘤活性研究，结果表明，其对宫颈癌有一定
的疗效［9］。为此，笔者采用超声波辅助乙醇提取法［10］对干
燥的猪屎豆全草进行提取，并用 H2O2-鲁米诺化学发光体
系［11］测定猪屎豆乙醇提取物的抗氧化性，以期为更好地开
发和利用猪屎豆提供理论依据。
1 材料与方法
1． 1 材料
1． 1． 1 中草药。猪屎豆，采自海南万宁，经海南师范大学生
命科学学院钟琼芯老师鉴定为蝶形花科野百合属植物猪屎
豆(Crotalaria mucronata Desv．)正品。
1． 1． 2 主要试剂。Luminol，GR级，由 Acros公司生产;无水
乙醇，AR级，由天津市恒兴化学试剂制造有限公司生产;
30% H2O2 溶液，AR 级，由广州化学试剂厂生产;NaHCO3，
AR级，由广州化学试剂厂生产;NaOH，AR级，由洛阳市化学
试剂厂生产。
1． 1． 3 主要仪器。IFFM-E 型流动注射化学发光仪，由西安
瑞迈电子科技有限公司生产;pHS-3C 型 pH计，由上海康仪
仪器有限公司生产;SK5200LH型超声仪，由上海科导超声仪
器有限公司生产;BS124S型电子天平，由赛多利斯科学仪器
有限公司生产。
1． 2 方法
1． 2． 1 提取工艺的优化。
1． 2． 1． 1 料液比的选择。在提取溶剂乙醇体积分数为
80%，提取温度为 60 ℃，提取时间为 30 min的条件下，选择
料液比分别为 2． 8∶ 1、3． 2∶ 1、3． 6∶ 1、4． 0∶ 1、4． 4∶ 1(W/V，下
同) ，提取猪屎豆的抗氧化活性成分，研究料液比对提取效果
的影响。
1． 2． 1． 2 乙醇体积分数的选择。在提取温度为 60 ℃，提取
时间为 30 min，料液比为 3． 6∶ 1的条件下，选择乙醇体积分数
分别为 50%、60%、70%、80%、90%，提取猪屎豆的抗氧化活
性成分，研究乙醇体积分数对提取效果的影响。
1． 2． 1． 3 提取时间的选择。在提取溶剂乙醇体积分数为
70%，提取温度为 60 ℃，料液比为 3． 6∶ 1的条件下，选择提取
时间分别为 10、20、30、60、90、120、150 min，提取猪屎豆的抗
氧化活性成分，研究提取时间对提取效果的影响。
1． 2． 1． 4 提取温度的选择。在提取溶剂乙醇体积分数为
70%，料液比 3． 6∶ 1，提取时间为 30 min的条件下，选择提取
温度分别为 40、50、60、70、80、90 ℃，提取猪屎豆的抗氧化活
性成分，研究提取温度对提取效果的影响。
1． 2． 2 清除率测定体系的优化。
1． 2． 2． 1 H2O2 体积分数的选择。在提取溶剂乙醇体积分
数为 70%，料液比 3． 6∶ 1，提取时间为 30 min的条件下，提取
温度为 80 ℃条件下，提取猪屎豆的抗氧化活性成分;测定体
系中鲁米诺浓度为 1 × 10 －4 mol /L，CuSO4浓度为 0． 90 × 10
－5
mol /L，Vc浓度为 0． 90 × 10 －5 mol /L，选择 H2O2 体积分数分
别为 0． 12%、0． 24%、0． 48%、0． 60%、1． 20%，测定猪屎豆提
取物对羟自由基(·OH)的清除效果。
安徽农业科学，Journal of Anhui Agri． Sci． 2010，38(28):15571 － 15573 责任编辑 姜丽 责任校对 卢瑶
DOI:10.13989/j.cnki.0517-6611.2010.28.107
1． 2． 2． 2 鲁米诺浓度的选择。在提取溶剂乙醇体积分数为
70%，料液比 3． 6∶ 1，提取时间为 30 min的条件下，提取温度
为 80 ℃条件下，提取猪屎豆的抗氧化活性成分;测定体系中
H2O2 的体积分数为 0． 60%，CuSO4 浓度为 0． 90 × 10
－5 mol /L，
Vc的浓度为 0． 90 × 10 －5 mol /L，选择鲁米诺浓度浓度分别为
0. 08 ×10 －4、0. 20 × 10 －4、0. 50 × 10 －4、0. 80 × 10 －4、1. 00 × 10 －4、
1. 20 ×10 －4 mol /L，测定猪屎豆提取物对·OH的清除效果。
2 结果与分析
2． 1 提取工艺的优化结果
2． 1． 1 不同料液比下的提取物对·OH的清除效果。由图 1
可知，随着料液比的增大，提取物对羟基自由基的清除率逐
渐增大，当料液比为 3. 6∶ 1，清除率达到 91． 09%，再增大料液
比，清除率反而下降。这说明在提取过程中，随着料液比的
增大，提取物的活性成分也会增多，同时其他成分的含量也
增加，而其中某些成分可能会对清除·OH的活动产生拮抗，
从而导致清除效果变差。故料液比以 3. 6∶ 1为宜。
图 1 不同料液比提取物对·OH的清除效果
Fig． 1 The scavenging effects of extracts with different solid-to-
liquid ratio on hydroxyl free radical
2． 1． 2 不同乙醇体积分数下的提取物对·OH的清除效果。
由图 2可知，乙醇体积分数为 70%时，体系发光强度降低最
明显，这对·OH的清除率最大，可达 96． 64%，对·OH的清
除作用最强。故乙醇体积分数以 70%为宜。
图 2 不同乙醇体积分数提取物对·OH的清除效果
Fig． 2 The scavenging effects of extracts with different volume
fraction of ethanol on hydroxyl free radical
2． 1． 3 不同提取时间下的提取物对·OH的清除效果。由
图 3可知，当提取时间为 30 min时，清除率可达 96． 81%，继
续增加时间，清除率变化不大。故提取时间以 30 min为宜。
2． 1． 4 不同提取温度下的提取物对·OH的清除效果。由
图 4可知，随着提取温度的升高，清除率逐渐增大，当提取温
图 3 不同提取时间提取物对·OH的清除效果
Fig． 3 The scavenging effects of extracts of different time on hy-
droxyl free radical
度为 80 ℃时，清除率可达 98． 46%，继续升温到 90 ℃时，清
除率为 98． 72%，变化不大。故提取温度以 80 ℃为宜。
图 4 不同提取温度提取物对·OH的清除效果
Fig． 4 The scavenging effects of extracts of different tempera-
ture on hydroxyl free radical
2． 2 清除率测定体系的优化结果
2． 2． 1 H2O2 体积分数对测定结果的影响。由图 5 可知，随
着 H2O2 体积分数的增加，清除率逐渐增大，当浓度增加到
0． 60%时，清除率可达 98． 62%，继续增大浓度，清除率反而
下降。故 H2O2 体积分数以 0． 60%为宜。
图 5 H2O2 体积分数对测定结果的影响
Fig． 5 Impact of volume fraction of H2O2 on test results
2． 2． 2 鲁米诺浓度对测定结果的影响。由图 6 可知，随着
鲁米诺浓度的增大，清除率逐渐增大，当鲁米诺浓度达到
1. 00 ×10 －4 mol /L时，清除率最大，可达 98． 77%，继续增加
浓度，清除率反而下降。故选择鲁米诺浓度以 1． 00 × 10 －4
mol /L为宜。
3 结论与讨论
该研究结果表明，在料液比为 3. 6∶ 1，乙醇体积分数为
27551 安徽农业科学 2010 年
图 6 鲁米诺浓度对测定结果的影响
Fig． 6 Impact of luminol concentration on test results
70%，提取时间为30 min，提取温度为80 ℃时，猪屎豆乙醇提
取物对·OH的清除效果最佳，可到 98． 77%，具有很强的抗
氧化活性。当 H2O2 浓度为 0． 60%和 Luminol浓度为 1. 00 ×
10 －4 mol /L时，测定结果较准确。该试验所选的抗氧化活性
测试样品为一混合体系，清除·OH的作用机理较复杂，有待
于进一步研究。
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85 －86．
(上接第 15570 页)
图 2 葛根素的洗脱曲线
Fig． 2 Elution curve of puerarin
3 结论
通过分析 5种树脂对葛根素的吸附解吸特性可以看出，
HPD-800型大孔吸附树脂对葛根中葛根素具有良好的吸附
性能，吸附量大，易于洗脱，分离效果好。对影响 HPD-800 树
脂分离纯化的各因素进行了系统研究，最终确定最佳工艺条
件为:在吸附过程中，上样液浓度为 0. 2 mg /ml，上样液 pH值
为 1. 0，过柱流速为 2. 0 ml /min;在洗脱过程中，以 5 倍树脂
柱体积的 70%乙醇洗脱葛根素，过柱流速为 1． 5 ml /min。在
最优工艺条件下，葛根素收率达到 91． 02%，所得产品仅经 1
次重结晶纯度可达 96． 13%。
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