全 文 ：第 2 5卷 第 5期
2 0 03 年 1 0月
西 南 农 业 _ 大 学 学 报 ( 自 然 科 学 版 )
Jo u rn a l o f so u t h w s et A g ri eu l t u a rl U n iv e
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it y ( N a t u ra l S ei en e e)
V o l
.
2 5
,
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5
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.
2 0 0 3
文章编 号 ; 10 0 0 一 2 6 4 2 ( 2 0 0 3】0 5 一 0 3 9 6 一 Q4
利用组织培养技术进行红千层多倍体诱导
商宏莉 ’ , 汪卫星 2 , 向素琼 “ , 梁国普 2 `
l(
. 四川师范大学 生命科学学院 , 四川 成都 61 。。68 ; 2 . 西南农业大学 园艺园林学院 重庆 4 0 0 7 16)
摘要 : 利 用 组织培养技术培育红千层无菌苗 , 并运用秋水仙碱诱 导 多倍 体 。 结果表明 : 利 用 。 . 2 %秋水仙钱 处理 无菌
苗 茎段 15 ~ 20 d , 从 60 个茎段中成功地诱导 出 了四倍体植株 6 株 , 其形 态特征为叶 色浓绿 、 叶片增厚 、 根系肥大等 ;据
方差分析结果表明 , 四倍体与二倍体的叶长宽比 差异 显著 ;其体细胞染 色体数 目由 Z n = Z x 一 2 2 变 为 2n 一 4 x ` “ 。
关 健 词 :红 千层 ; 多倍 体诱导 ;秋水仙碱
中圈分类号 : 5 60 3 . 6 文狱标识码 : A
P O L Y P L O I D Y IN D U C T IO N IN C A L L I S T E M O N R I G I D U S W IT H
T I S S U E C U L T U R E T E C H N O L O G Y
s l l A N G H o n g一 11, , w A N G w e i一 x i n扩 , x I A N G s 。一 q i on 扩 , L I A N G G u o 一 lu Z ’
( 1
.
A
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d
e m y o f C h e而 s t r y a n d iL f e cS i e n e e , S ie h u a n N o rma l U n iv e r s i t y , Ch e n g d u iS e h u a n 6 10 0 6 8 . C h i n a ; 2 . C o ll e g e o f H o r t i-
e u l t u r e a n d g a r d e城雌 , oS u t h w e s t A g r ie u l t u r a l U n iv e r s it y , C h o n g q i叱 4 0 0 7 1 6 , C h i n a )
A加 tacr t : T i s s u e e u l t u r e tec h n o l o g y w a s u s e d t o o b t a in v ir u s 一 f r e e p l a n t s o f 山 l l f s t em o n r i g id “ 5 a n d e o le h ie in e w a s u s e d t o in d u e e
op ly p l
o id y
.
T
r e a t m e n t o f 6 0 , t e m s e e t io n s o f v ir u s一 f r e e C . r i g苦d u : p la n t s w i t h c o le h i e i n e s ( 0 . 2 % ) f o r 15~ 2 0 d a y , i n d u e e d s ix
t e r r a p lo id p la n t s e ha
r a e t e r i z e d b y d a r k g r e e n
, t h ie k e n e d le a v e s
, e r a s s i t u d e r o t
s a n d d o u b le d e h r o m o s o m e n u m b e r ( Z n = 4 x =
4 4 )
.
T h e i r le a f l e n g t h / w id t h
r a t i o w
a s s ig in f ie a n t ly d if f e er n t f r o m t h a t o f t h e ir d ip lo id e o u n t e r p a r t s
.
K盯 w o n ls : aC l l坛s t e m o n r i g i d u : ; 卯 lyP lo id y i n d u e t io n ; e o le h ie in e
红千层 ( aC l l￡s t , o n r i g i d u : )属桃金娘科 ( M y r -
at ce ae )红午层属 , 为多年生常绿小灌木 , 高 2~ 3 m ,
原产于澳洲 , 引进我国己有百年历史 。 它的树冠成球
形 ,树姿优美 。 叶互生 , 富含芳香气味 。 花鲜红色 , 穗
状花序 ,生近顶枝 ,形似瓶刷 , 于 4 , 5 月间盛开 , 花期
颇长 , 盛开时 ,红压枝头 , 极为美观 , 为一种极为优雅
的园林观赏植物 〔` 〕 。 为了加快新品种的培育 ,本试验
利用组织培养手段进行多倍体的诱导 ,通过秋水仙碱
诱导处理 〔卜 5〕 , 已获得了稳定的四倍体株系 。
1 材料和方法
1
.
1 试验材料
以二倍体红千层幼嫩茎叶作为外植体 。
1
.
2 外植体的准备及无菌苗的获得
在晴天选取生长良好的幼树 ,剪取生长旺盛的 1
年生枝梢 1一 2 。 m , 用肥皂水清洗后置 自来水下冲洗
1 ~ Z h
, 然后 放在 70 %酒精中浸泡 10 5 , 再放 人 .0
1%的升汞溶液消毒 10 m in 左右 ,最后用无菌水清洗
3 ~ 5 次 ,将茎切成 0 . 5~ 1 . 0 。 m 茎段 ,叶片切成纵横
径 5 m m 左右大小作接种材料 。 将外植体接种于 M S
收稿 日期 : 2 0 0 3一 0 3一 2 5
作者简介 : 商宏莉 ( 1 96 5一 ) ,女 , 四川内江人 , 四川师范大学讲师 , 硕士 ,从事遗传育种与生物技术研究 .
, 为通讯作者
DOI : 10. 13718 /j . cnki . xdzk. 2003. 05. 006
第 2 5 卷第 5 期 商宏莉等 利 .用组 织培养技术进行红 千层多倍体诱导 3 9 7
+ B A
,十 N A戊 . 。或 M S十 B A : + N A A 。卜 : 的培养基中
培养 , 待其萌发出一定数 量的芽后 , 将芽切割转 人
M S十 IA OA . : 中继代培养 。
1
.
3 增殖培养
将无菌苗切割成带 3 ~ 5 片叶的茎段 , 转人 M S
+ B A : + N A戊 . : 或 M S + B A : 十 N A A o . : 培养基中培
养 , 将培养瓶置于 25 ℃光照培养室中培养 。
1
.
4 多倍体的诱导
将无菌苗切割成 0 . 5一 1 c m 的茎 段 , 接入 含
0
.
1%
,
0
.
2% 和 0 . 3% 的秋 水仙碱 的 M S + 1 m g ·
L
一 `
B A十 。 . 2 m g · L 一 ’ N A A 的培养基 中均培养 15
d
,
2 0 d 和 3 0 d 。
1
.
5 倍性鉴定
从外部形态上 (枝 、 叶 、 茎 、根等 ) 初步判断困 ; 从
细胞学方面 , 主要是通过体细胞染色体数 目的鉴定 。
取无菌苗茎尖为材料 , 采用改良去壁低渗火焰干燥法
制片川 ,镜检观察染色体数确定植株倍性 。
2 结果与讨论
2
.
1 无菌株系的建立
以茎段作为外植体 , 在 M S + B A ; 十 N A OA . : 或
M S十 B A : + N A A o . : 培养基中培养 7 d 左右叶腋萌生
腋芽 , 20 d 后切割转人 M S+ I A OA . : 的培养基中继代
培养 20 ~ 30 d ,即可获得 1 ~ 2 e m 高的健壮无菌苗 ;
以叶作为外植体 ,培养 20 ~ 30 d 后 , 叶片增厚 , 长 出
凹凸不平的愈伤组织 , 10 一 20 d 后 , 在愈伤组织 的表
面能分化出成簇的不定芽 ,切割转人 M S + IA A Q. : 的
培养基中继代 20 ~ 30 d , 即可获得 l ~ 2 c m 高的健壮
无菌苗 。
2
.
2 增殖培养
与互叶 白千层相似闭 , 红 千层在 B A 含量为 1
m g
·
L
一 ’ 或 2 . 0 m g · L 一 `的培养基中都能增殖 , 主要
是芽增殖 。 切取红千层幼苗带 3 ~ 5 片叶的茎段转人
上述培养基中进行增殖 , 均能获得生长健壮的再生植
株 。 培养 6一 10 d 在叶腋可产生腋芽 ,继续培养 15 ~
ZO d
, 切割带一侧芽的茎段接种于上述培养基中培养
2 0 ~ 3 o d 可长成 1一 2 c m 高的幼苗 。 然后如此循环
可炼苗移植或继续增殖产生大 t 健壮无菌苗 。 繁殖
系数为 ( 3 ~ 5 ) “ , 即 4 2~ 6 0 d 增殖 1次 ( 3一 5 倍 ) 。
2
.
3 多倍体诱导
2
.
3
.
1 不 同处理诱导多倍体的效果 (表 ”
0
.
1%秋水仙碱处理 30 d 及 。 . 2环秋水仙碱处理
15 d
,
20 d 的植株有一定的生物学特性 的改变 , 观察
诱导过后的植株染色体数也为 Z n = 4 x = 4 4 ,这说明
这几种处理均能诱导产生四倍体 。 但 比较而言 , 利用
秋水仙碱处理 15 ~ 20 d 效果较佳 。
衰 l 不 同浓度秋水仙旅处理不同时间的结果比较
T a bl e 1 th e e o m p a r i s io n o f r e s u l t o f t h e d i ff e r e n t t r e a t m e n t
处 理
r e a t m e n t s
生长速度
th e s p e ed
o f g or w in g
茎 叶 根 系
t h e s r e m t h e or o t
处理茎数
t o t le n u m b e r
t r e a ted
四倍休株数
t h e n u m b e r o f
t e t r a IP面d
四倍体得率 /%
t h e P r oOP
t i o n
a n d lea v e s
变化不明显
变化不明显
o f t e t r a P lo id
0
,d勺口几舀Q
2 0
3 0
变化不明显
变化不明显
几乎不长
枝条生长缓慢
叶色变浓 、茎变粗
叶片增厚 、 叶色变浓
茎杆粗壮
叶片增厚 、叶色变浓
茎杆粗壮
死 亡
变化不明显
变化不明显
变化不明显
根系增粗
根系增粗明显.dJUd.d亡J0口已01人,`几舀,.`心
%水碱幼.0l秋仙。
秋水
仙碱
枝条生长级慢 根系增粗明显
00
1口内J,l目
0
.
3% 变化不明显 发根较细
秋水
仙喊
2
.
3
.
2
部分死亡 ,成活植株生长不 良 , 最终死亡
死 亡
四倍体与二倍体的形态及倍性比较 四倍体
植株在形态上及染色体数 目与二倍体植株有着明显
的区别 : ( )I 通过生长状况及茎 、 叶 、根系的生长 比较
发现四倍体植株在形态上表现出枝条生长较慢 、茎杆
短而粗壮 、 叶片肥厚 、叶色浓绿 、叶形由正常的披针形
变为长椭圆形及节间距明显增大 以及植株高度明显
降低等特征 ( 图 1 、表幻 ,并通过统计学分析发现红千
层二倍体与四倍体植株叶片长宽比达极显著差异 (表
3 )
,叶片厚度 、 枝条粗度 ( 当年新梢中部直径 ) 以及节
间长差异均未达显著水平 , ( 2) 通过染色体数目的检
3 9 8 西 南 农 业 大 学 学 报 ( 自然科学版 ) 2 0 03 年 1 0 月
测 , 处理后的植株 的体细胞染色体数为 2n 一 4 x ~ 4 4 ,
而二倍体植株体细胞染色体数为 Z n 一 Z x ~ 2 2( 图 2 ) 。
培养的方法能再生完整健壮的植 株 , 并可快速繁殖 ;
在无菌的条件下利用秋水仙碱对红 千层无菌苗茎段
进行处理 ,成功的诱导 出了四倍体植株 ; 利用组织快
繁技术以及诱导技术 , 可望培育出优质 、美观 、 实用的
红千层新品种 。
( b》左为二倍体植株 , 右为 四倍体植株
田 1 红千层二倍体及四倍体叶片和植株形态比较
F ig 1 t h e co m阶 ir s on o f th e le a v e s a n d p lB n t s o f d i P lo id a n d
t e t ar p lo i d o f aC l l i
廿饰。 月 ir g id u s
襄 2 红千层二倍体与四倍体植株形态比较
T a b le 2 T h e co m aP
r i , o n o f P la n t s o f id P lo id a n d t e t r a Pl o id
o f
山 l l i st ~ 月 ir g亡d u :
倍 性
p lo idy
叶长 /宽
Ie n g th / w idth
o f lea v e s
叶片平均
厚度 / m yn
吕 v e t日g e
thi比 n e s s
枝条平均
粗度c/ m
a v e r a g e di a me
t e r
o f b r a n e h e s
平均节间长
/
c m
a v e r a g e l e n g th
o f in t e r n o de s
Z x 14
.
3 3 0
.
2 5 0
.
5 3 0
_
4 1
4蕊 2 ` 9 8 0 . 3 1 0 . 8 6 0 5 1
裹 3 叶长宽比 F 洲脸衰
T a b le 3 T h e F t e s t o f l e n g t h / w id t h o f le a v e s
变 因
系 间
系 内
总变异
5 5 S Z F 值
6 4 3
.
88 5 2 6 4 3
.
8 8 5 2 7 8 0
.
3 0 6 5
卜 ,
oF
. 。 :
18 1 4
.
8 5 3 1 0
.
82 5 2
19 6 5 8
.
7 3 8 6
将四倍体幼苗切成段 , 运用上述增殖方法 , 能够
培养出大童的健壮幼苗 。 经过 15 代继代培养 , 植株
形态特征及细胞学特征基本不变 。
3 讨论
3
.
1 利用红千层幼嫩的茎叶作为外植体 , 通过组织
( b ) Z n 一 4 x = 4 4
圈 2 红千层二倍体《a) 及四倍体 ( b) 体细胞染色体傲目比较
F ig 2 th e e h or m o s o m e o f id P lo id a n d t e t ar P lo id o f Q l l正s t~
”
ir g i d u s
3
.
2 诱导的多倍体大多数为嵌合体困 。 本试验所诱
导的四倍体虽然有了明显的形态上的改变 , 且在初期
检测为纯合体 ,但经过 2 年后再检测发现四倍体植株
为二倍体与四倍体的混倍体 , 所以在实际中有必要进
行进一步的分离纯化 , 如利用营养器官的组织培养就
可以分离出纯合的四倍体 。
3
.
3 红千层的组织快繁技术结合多倍体诱导育种的
应用前景 。 一直以来 , 对于多种植物而言 , 其多倍体
营养器官的巨大性往往能大大增加其经济价值 、 营养
价值和药用价值等 。 尽管多倍体植株有育性下降 、 不
能结实或较少产生种子的特点 , 但针对红千层的观赏
价值及经济价值 ,利用组织培养快速繁育出幼苗及诱
导多倍体植株的产生将具有重要的实际意义 。 近年
来 ,组织培养技术的广泛应用更是加快了倍性育种的
进程 , 这是因为用组织培养进行多倍体诱导与常规植
株或种子诱变相 比 ,具有明显 的优越性 z1[ : ( l) 可反复
大批量的在培养瓶 中处理植物愈伤组织 、 丛生芽等 ,
第 2 5卷第 5 期 商宏莉等 利用组 织培养技术进行红 千层多倍体诱导 39 9
从而大大的提高了诱导的成功率 ; ( )2 不受节气等 自
然条件的限制 ,可大大的缩短诱导育种的周期 ; ( 3) 筛
选 出的多倍体可应用组织培养技术迅速的大量繁殖 ,
而且繁殖 出的种苗纯度高 、 质量好 、 无病虫害 ,这对于
提高植物的产量和质量都有利 。 基于 白千层的医用
价值等研究的巨大成果 , 加大红千层的医药 、 营养价
值等方面的研究具有很大的实际意义 , 这也对红千层
的组织快繁技术和倍性诱导提出了更高 的要求 。 由
此可见 ,红千层组织快繁和多倍体诱导技术的研究具
有很广阔的应用前景 。
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