全 文 ：J. SHANXI AGＲIC. UNIV. (Natural Science Edition)
学报(自然科学版)2014，34(6) 003190
收稿日期:2014-05-29 修回日期:2014-07-04
作者简介:李灵娇(1989-) ，女( 汉) ，山西大同人，在读硕士，研究方向:作物生物技术。
通讯作者:吴玉香，教授，硕士生导师。Tel:15034664402;E-mail:yuxiangwu2009@ hotmail. com
基金项目:国家自然科学基金(31171599) ;山西省科技攻关项目(20130311004-1) ;山西农业大学“中青年学术带头人”基金(XD201203)
利用多倍体诱导技术改良草棉种质
李灵娇，吴玉香
( 山西农业大学 农学院，山西 太谷030801)
摘 要:以二倍体草棉(Gossypium herbaceum L．) 为材料，采用改良初生分生组织处理法对其进行多倍体诱变，并对获
得的草棉变异株进行形态学、生理指标及细胞学鉴定。结果表明最佳诱变参数为:用0. 2%秋水仙素处理草棉幼苗茎
尖生长点 24 h，诱变率最高，为 16. 67%。形态及生理特征变化: 与对照相比，诱变株草棉各个时期生长速度明显减
缓，新叶萌发时间晚。诱变株叶片皱缩、肥厚，颜色加深，对照株叶形指数( 长/宽) 为0. 81，变异株叶形指数为 0. 72，较
对照减小 11. 11%，变异株较对照茎结间变短，茎秆变粗;变异株叶绿素相对含量较对照株高。细胞遗传学差异表现
在减数第二次分裂中，变异株染色体发生不均等或不完全分裂，出现二分体、三分体和微核，而对照株中则全为正常四
分体。
关键词:草棉; 多倍体诱导; 改良初生分生组织处理法
中图分类号:S334. 3 文献标识码:A 文章编号:1671-8151(2014)06-0494-05
Germplasm Improvement of G． herbaceum by Polyploid Breeding
Li Lingjiao，Wu Yuxiang
(College of Agriculture，Shanxi Agricultural University，Taigu Shanxi 030801，China )
Abstract:The diploid cotton (G． herbaceum L．)was induced by improved meristem technique to obtain the tetraploid． Its
morphological，physiological and cytogenetic characteristics were analysed． The results are as follows:The most effective in-
duction was 0． 2% colchicine for 24 h and the induction rate reached 16． 67% ． Compared with the control，there were many
morphological changes． The growth rate and the emergence of new leaves in mutants were significantly slow． The leaf became
shrank and thicker and the color was much deeper green． The leaf index of the control group was 0． 81，but the mutants was 0．
72，reduced by 11． 11% ． Internodes became shorter and thicker than that of control． In addition，at the Anaphase II，chro-
mosomes in the mutants showed unequal separation and no separation，leading to the occurrence of dyad，triad and micronu-
cleus，in contrast with the normal tetrads in the controls．
Key words:G． herbaceum L．;Polyploidy induction;Improved meristem method
草棉(G． herbaceum L．) 属锦葵科(Malvace-
ae)、棉属(Gossypium)［1］。英文名为 levant cotton，
又名阿拉伯棉、小棉，原产于阿拉伯和小亚细亚，是
非洲大陆栽培较早的棉种，故又称非洲棉。草棉作
为四个栽培棉种之一，虽然不如陆地棉和海岛棉对
现代纺织业的贡献大，但与异源四倍体棉 A 染色
体组亲缘关系近，为异源四倍体提供了纤维性状，
同时草棉本身也具有某些其他棉种所不具备的优
良特征［2］，如极早熟性、高抗旱性和抗角斑病等。
因而草棉在 AD 组棉花进化过程中扮演着重要的
角色。同时，伴随着与异源四倍体 D 染色体组亲
缘关系较近的雷蒙德氏棉全基因组测序的完
成［3］，为 AD组棉种间种质互渗及异源四倍体进化
的研究提供了更大的空间。
在异源四倍体棉种的自然起源问题上，现在比
较认可的观点是由 A染色体组棉种与 D组棉种先
杂交后加倍得到，其中 A 组草棉和中棉作为母本
对异源四倍体贡献相等［4］，父本供体是 D 组雷蒙
德氏棉［5］。但这只是推测，不排除先加倍后杂交
的可能性。在人工远缘杂交过程中，常用的方法
DOI:10.13842/j.cnki.issn1671-8151.2014.06.003
34(6) 李灵娇等:利用多倍体诱导技术改良草棉种质
是，先将二倍体棉种加倍成同源四倍体，再和栽培
棉杂交，这样大大降低了种间杂交的不亲和性，从
而实现不同遗传物质间的相互渗透，大大降低了育
种难度［6］。孙济中等［7］用亚洲棉与陆地棉进行杂
交，几乎得不到种子; 而用同源四倍体的亚洲棉与
陆地棉进行杂交，成铃率在 30%以上。Ter － Av-
anesyan［8］用同源四倍体亚洲棉，或亚洲棉和草棉
杂种 F1 加倍的异源四倍体，再和陆地棉或海岛棉
杂交，成铃率很高。
目前关于草棉多倍体育种的报道很少，因此本
研究采用改良初生分生组织处理法诱导草棉二倍
体，旨在将二倍体草棉加倍成同源四倍体，为进一
步和加倍的雷蒙德氏棉杂交，创造异源四倍体提供
中间材料，这对于棉花的新种质创新及棉花起源研
究具有重要意义。
1 材料和方法
1. 1 实验材料
本实验所用草棉(Gossypium herbaceum L．)
(2n = 2x = 26) 属A 染色体组棉种，种子来源于国
家种质三亚野生棉圃。
1. 2 实验方法
1. 2. 1 制作阳畦、播种
在温室做长 1. 8 m、宽 1. 5 m、深 0. 1 m 的阳
畦。将生黄土掺入五氯硝基苯和多菌灵( 三者质
量比为 50∶ 1∶ 1) 装入营养钵，整齐地将营养钵排
列在阳畦中，基部灌水，备用。将饱满的草棉种子
用 60℃ 温水浸种 24 h 后，播种于营养钵中，每营
养钵播种 2 粒，覆土 3 mm，定期观察。
1. 2. 2 配制 0. 2 %秋水仙碱琼脂凝胶
200 mg 琼脂溶解于 10 mL 去离子水中，加热
约 10 min。取 10 mL 0. 4 %的秋水仙碱母液与上
述溶液充分混合，水密保存。
1. 2. 3 多倍体诱变
种子萌发并生长至 2 片子叶展开期，采用改良
初生分生组织处理法进行诱导。用 0. 2%秋水仙
素琼脂凝胶涂抹草棉幼苗生长点。再罩上 50 mL
塑料杯防止秋水仙碱蒸发并保持湿润。采用随机
区组实验设计［9］，将处理时间设为 3 个水平(24 h、
48 h 和 72 h) ，每个水平选若干植株进行诱变处
理。对照组不做任何处理。处理结束后，用尖镊子
撕掉琼脂凝胶并洗苗，将生长点周围残留的秋水仙
碱清洗干净，以保证相应的处理时间。
1. 2. 4 多倍体植株的初步鉴定
观察苗期诱变植株和对照植株的生长状况，依
据生长受阻、叶色浓绿、叶片皱缩、植株畸形等指
标［6］对得到的诱变株进行初步筛选和鉴定。
1. 2. 5 形态指标及生理指标的测定与统计学分析
随机选择诱变植株和对照植株各 5 株，用卷尺
测量其叶长、叶宽和节间距，计算其叶面积、叶形指
数;用游标卡尺测量植株的茎干直径; 在不同生育
期，选取变异株和诱变株植株相同部位叶片( 第6
节叶) ，随机选取每片叶子3 个不同部位，用
SPAD －502 叶绿素仪，进行叶绿素相对含量测定;
记录数据，采用 SＲS 统计软件进行方差分析，显著
性检验。
1. 2. 6 变异株与对照株的细胞遗传学比较
取材:棉花长出花蕾后，用镊子于不同的时间
(8:00、8:30、9:00) 采集正在生长的不同大小的花
蕾，并将花蕾放入盛有卡诺固定液的广口瓶中，其
配方为 95%酒精和冰乙酸(3 ∶ 1) ，现配现用。固
定时间为 12 ～ 24 h，固定后用 70%的酒精保存，置
于 4℃冰箱冷藏待用。
制片:将花蕾从广口瓶中取出，放于干净的载
玻片上，用镊子和解剖针轻轻将花蕾撕开; 取其中
4 ～ 6 粒花药，用镊子将其敲碎;再滴一滴卡宝品红
染液后，用镊子进一步将其敲碎，使得花药中的花
粉母细胞游离出来; 先于显微镜下看一下，初步判
定是否有母细胞;然后将染液中肉眼可见的杂质去
掉，盖上盖玻片，使用两张小滤纸，一张压住盖玻片
的一个角，另一张轻压玻片并将多余染液吸去，再
用铅笔橡皮头垂直敲打玻片［10］。
镜检:显微镜下观察减数分裂相，观察变异株
花粉母细胞减数分裂的异常现象，并与对照株相应
时期分裂相对比，拍照，记录结果。
2 结果与分析
2. 1 不同处理时间对草棉的诱导效果观察
秋水仙素在诱导染色体加倍的同时，对植物细
胞有很强的毒害作用［11］，不同浓度的秋水仙素诱
导效果不同( 表1) :0. 2%秋水仙素琼脂凝胶处理
草棉幼苗生长点 24 h 效果最佳，诱变成功率达
16. 67%。
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山 西 农 业 大 学 学 报( 自然科学版) 2014
表 1 秋水仙碱不同处理时间对草棉的诱导效果
Table 1 Induction effect of colchicine on G． herbaceum in different treatment time
处理时间 /h
Treatment time /h
处理株数
No． of treated plant
存活株数
No． of survival
变异株数
No． of mutant
存活率 /%
survival rate /%
变异率 /%
mutant rate / %
0h( 对照)
24 h
48 h
72 h
6
30
31
29
5
11
8
5
/
5
0
0
83. 33
36. 67
25. 81
17. 24
/
16. 67
0
0
2. 2 草棉变异株和对照株形态特征比较
与对照株相比，变异株叶片颜色浓绿，且叶片
皱缩、增厚;茎干较对照株粗( 图1)。
图 1 变异株和对照株形态比较
Fig. 1 Shape comparison between mutant and control
注:a，诱变后 50 天;b．诱变后 150 天;c．变异株和对照株叶片比较
Note:a、b:plant morphology after 50 and 150 days，respectively;c:comparison of leaves between mutant (left)and control (right)
2. 3 形态指标及生理指标的测定与统计学分析
变异株和对照株的叶宽、叶形指数、茎粗间均
存在极显著差异; 二者叶长、叶面积、节间距、叶绿
素相对含量间存在显著差异( 表2)。叶宽的增加
幅度较叶长大，使得叶形指数变小［12］; 茎干缩短变
粗是秋水仙素抑制生长的一种表现，一般多倍体植
株生长缓慢，这是多倍体诱变后最为普遍的现
象［13］;叶绿素含量与染色体数目成正相关［14］，诱
变株叶绿素含量明显高于对照株。
表 2 变异株和对照株间差异显著性比较(duncan新复极差法)
Table 2 Significant comparison between control and mutant(Duncan＇s new multiple range method)
材料
Material
叶宽 / cm
Leaf
width /cm
叶长 / cm
Leaf
length /cm
叶面积 / cm2
Leaf
area / cm2
叶形指数
Leaf
index
茎杆直径 / cm
Stem
diameter /cm
茎节距 / cm
Internode
length /cm
叶绿素相对含量
Spad
readings
对照株 3. 0667bB 2. 5000b 7. 727b 0. 8100aA 1. 4667bB 1. 7778a 33. 52bB
变异株 4. 3667aA 3. 1333a 13. 713a 0. 7167bB 2. 9333aA 1. 2667b 39. 46aA
注:小写字母和大写字母分别表示差异显著(0. 05 水平) 和极显著(0. 01 水平).
Note:Small letters and capital letters stand for significance at 0. 05 and 0. 01 level respectively．
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2. 4 变异株与对照株的细胞遗传学比较
减数分裂观察结果显示:变异株花粉母细胞在
减数分裂末期，出现不完全分裂现象，即未进行第
二次减数分裂的二分孢子和三分孢子，四分体伴有
微核的出现( 图2. e ～ f) ; 而对照株花粉母细胞减
数分裂末期产生正常的四分孢子( 图2. d)。
图 2 变异株与对照株的细胞遗传学比较
Fig. 2 Cytogenetin comparison setween mutant and control
注:d:对照株四分体;e和 f分别为变异株二分体( 未进行减数第二次分裂)、三分体;g、h、i:变异株四分体( 箭头示微核)
Note:A tetrad of the control in the figure d;a Dyad (having no second meiotic division)and a triad of the mutant in the figure e and f，
respectively;the tetrads of the mutant in the figure g － I (arrow showing micronucleus)
3 讨论与结论
3. 1 本研究植株死亡率分析
本实验不同处理间草棉植株死亡率的比较结
果可见，对照组死亡率最低，诱变处理的植株中，处
理时间为 24 h的植株死亡率较低。究其死亡原因
主要有以下四点:
(1) 病害:根腐病是棉花生长发育过程中常见
的病害，本研究发现部分草棉因根部腐烂而导致棉
花萎蔫死亡，这是对照株死亡的一个主要因素。后
期用根灵宝农药浇灌有活性的植株未发现死
亡，说明此农药对根腐病有一定的疗效。
(2) 药害: 秋水仙素作用于生长点，处理时间
越长毒害作用越强，一些植株生长点变黑死亡，从
而导致植株死亡。这是导致诱变株死亡及不同处
理时间下死亡率不同的主要因素。
(3) 虫害: 白粉虱在温室潮湿炎热的环境中，
繁殖率大大增加，成为食取棉花叶片的主要害虫，
其防治已是世界性难题。温室中喷施农药很难防
治，后期将棉花植株移到室外空旷处，大大减小了
白粉虱分布密度，降低了棉花死亡率。
(4) 环境影响: 前期草棉种植于温室，随着夏
季到来，温室内温度升高，再加上处理时，用塑料瓶
覆盖，使得诱变株周围温度过高而死亡。故根据棉
花生长状况，适当调节环境温度很重要。
3. 2 实验误差来源
植株出苗期不同: 由于所播撒种子的大小、活
力不尽相同以及温度的作用，使得同时播种的种子
出苗时间不同，甚至有的不出苗，造成子叶平展期
不同，诱变时间不同。随着环境温度变化，诱变较
早植株较诱变较晚植株生长缓慢，恢复生长期长，
影响后期测量。
设计与测量的误差: 由于本实验为单因素试
验，故采取较为简单的随机区组设计，存在很大的
随机误差。测量及统计分析时，不同植株存在组
内、组间差异。
3. 3 产生变异的遗传机制
本试验中诱变植株在形态特征、生理指标及细
胞遗传学上均表现出异于正常二倍体草棉的特征，
说明秋水仙素确实对其遗传物质造成一定程度的
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改变。由于秋水仙素可以阻止有丝分裂过程中纺
锤丝的形成，使得着丝点分离的染色单体不能移向
两极，从而导致染色体加倍，然而却不能致使所有
的细胞同时加倍，往往会产生二倍体、多倍体共存
的嵌合体植株。遗传物质不均等的细胞使得叶片
呈现皱缩形态，也导致减数分裂中染色体不能均等
分离、配对，减数分裂受阻导致二分体的产生，三分
体的出现可能是由于染色体分离不同步造成的，微
核的出现也与染色体不均等分离及落后染色体有
关［15］。本研究通过形态学、生理特征、细胞遗传学
鉴定初步判断诱变成功，有待进一步对其进行倍性
水平鉴定。
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( 编辑:武英耀)
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