全 文 ：剑 麻 ， 是 龙 舌 兰 科 （Agavaceae）龙 舌 兰 属
（Agave）多年生、 肉质、 旱生的草本植物， 剑麻不
仅是主要的热带纤维原料 [1]， 同时剑麻茎心是酿造
龙舌兰酒的主要原料 [2]， 剑麻液汁含有较高皂素，
可用来制药[3]， 麻渣可制造酒精和动力燃料， 因此，
剑麻的生物质资源[4]利用十分广泛， 有非常重要的
经济价值， 此外剑麻还具有很高的观赏价值 ，
常用于庭园 、 盆栽或室内美化 [5]。 龙舌兰科植物
大约有 670 种[6]， 在我国只有 7个属 41个种， 种质
资源严重缺乏 [7]。 已有的研究发现龙舌兰科植物倍
性复杂， 在自然条件下多倍体广泛存在 [8-11]。 目前
国内的主栽品种 H.11648 为 [ （A.angustifolia×A.
amaniensis）×A.amaniensis]的杂交后代， 为二倍体[9, 11]，
该品种叶纤维含量较高， 年产叶数多， 叶缘无刺
便于收割 [12]， 但抗真菌能力较差， 病虫害不断滋
生， 严重影响了剑麻的高产稳产[13]。
热带作物学报 2013， 34（8）： 1409-1415
Chinese Journal of Tropical Crops
收稿日期 2013-05-04 修回日期 2013-06-25
基金项目 中央级公益性科研院所基本业务费专项（No. sscri200802、 1251022011010）； 现代农业产业技术体系建设专项资金（No. CARS-19）；
剑麻种质资源标准化整理、 整合及共享运行服务项目。
作者简介 张燕梅（1975 年 —）， 女， 博士， 助理研究员； 研究方向： 作物育种。 *通讯作者： 周文钊， E-mail： zwenzhao@163.com。
剑麻四倍体诱导与倍性鉴定
张燕梅 1， 李俊峰 1， 陆军迎 1， 乔 飞 2， 胡玉林 1， 周文钊 1 *
1 中国热带农业科学院南亚热带作物研究所海南省热带作物营养重点实验室 （筹 ） 广东湛江 524091
2 中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所农业部华南作物基因资源与种质创制重点开放实验室 海南儋州 571737
摘 要 以剑麻H.11648 愈伤组织为材料， 分别采用 0、 2、 4、 6、 8 g/L 浓度的秋水仙碱对愈伤组织进行不同时
间（1、 2、 3、 4、 5、 6 d）的诱导处理， 观察处理后的再生植株气孔大小、 保卫细胞叶绿体数目、 叶长、 叶宽、
叶形指数、 叶片厚度以及苗头大小等， 采用流式细胞仪倍性鉴定方法对处理后的再生植株体细胞 DNA 含量进行
了检测。 结果表明： 用 4 g/L 浓度的秋水仙碱处理 2 d 诱变率最高， 诱变率为（57.69±6.66）％， 不定芽分化率为
（63.33±2.89）％， 分化系数为（3.55±1.24）， 加倍后的再生植株叶片下表皮气孔变大， 单位叶面积的气孔数减少，
叶片变宽变厚， 叶形指数变小， 植株变粗， 突变体再生植株体细胞 DNA 含量是二倍体的 2 倍。
关键词 剑麻； 秋水仙碱； 多倍体诱导； 植株再生
中图分类号 S563.8 文献标识码 A
Tetraploid Induction and Identification in Sisal
ZHANG Yanmei1， LI Junfeng1， LU Junying1， QIAO Fei2， HU Yulin1， ZHOU Wenzhao1
1 South Subtropical Crops Research Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences/Hainan Provincial
Key Laboratory for Tropical Crops Nutrition（planned）， Zhanjiang， Guangdong 524091， China
2 Tropical Crops Genetic Resources Institute, Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences/Key Laboratory of
Crop Gene Resources and Germplasm Enhancement in Southern China, Danzhou, Hainan 571737, China
Abstract Ca llus derived from H.11648 were treated with 0, 2, 4, 6, 8 g/L of colchicine for 1, 2 , 3, 4, 5, 6 d,
respectively. The size and density of leaf stomata, leaf length, leaf width, leaf thickness, leaf index and stem size from
regenerated plants were examined， and ploidy level was determined by an analysis of flow cytometry. The results
showed that among the tested combinations, the most effective treatment was the 4 g/L colchicine for 2 d which
resulted in about （57.69 ±6.66）% polyploidy. The colchicine -induced autotetraploids developed leaves with
significantly increased width, thickness, guard cell size when compared with the corresponding control diploids, but
significantly reduced stomata density and leaf index, and the stem diameter significantly increased in colchicine-
induced tetraploids compared to corresponding controls. The nuclear DNA content of putative tetraploids was
indeed doubled relative to that of control diploid plants.
Key words Sisal； Colchicines； Polyploidy induction； Plant regeneration
doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2013.08.001
第 34 卷热 带 作 物 学 报
自然界多倍体广泛存在， 并且研究结果表明多
倍体的出现是物种进化过程中的一个很突出的事
件， 在物种进化过程中扮演十分重要的角色 [14-15]。
由于多倍体具有巨大性、 产量高以及适应性强等
特点， 目前通过化学方法对植物染色体加倍来提
高植物的综合利用价值， 如抗逆性 [16-17]、 观赏价值
[18-20]、 药用价值 [21]、 生物量 [22]、 以及可育性 [23]等已
在多种植物中成功报导。 Ruvalcaba-Ruíz 等 [24]用对
氟苯丙氨酸对蓝剑麻胚性愈伤组织进行处理， 获得
了三体蓝剑麻植株。 本研究的目的是采用秋水仙碱
处理剑麻愈伤组织的方法， 建立剑麻多倍体诱导技
术体系， 同时通过诱导多倍体来提高剑麻的抗逆
性、 观赏价值以及生物量。
1 材料与方法
1.1 材料
以 H.11648 麻茎尖为外植体诱导的愈伤组织，
所有 H.11648 麻取自于中国热带农业科学院南亚热
带作物研究所剑麻种质资源圃。 所有试剂均购自上
海生工生物工程技术服务有限公司。
1.2 方法
1.2.1 诱变处理 取生长旺盛的愈伤组织为材
料， 切成黄豆大小， 分别浸泡于浓度为 0、 2、 4、
6、 8 g/L 的秋水仙碱（过滤灭菌）溶液中， 然后放置
于振荡仪上震荡， 转速为 120 r/min， 分别浸泡 1、
2、 3、 4、 5、 6 d 后取出， 用无菌水冲洗 3～5 次后
于滤纸上晾干， 然后分别接种于不定芽诱导培养
基上进行不定芽诱导， 不定芽诱导培养基参照张
燕梅等的方法 [25]。 愈伤组织诱导培养基为 MS 基本
培养基添加 3.0 6-BA 和 0.2 mg/L 的 NAA。 不定
芽分化培养基为 SH+0.1 mg/L NAA+3.0 mg/L 6-
BA+0.1 mg/L IBA。 所用培养基的蔗糖浓度均为
30 mg/L， 卡拉胶的浓度为 8.0％， 在灭菌前先将培
养基的 pH 调至 5.8， 充分混匀后分装于玻璃瓶中，
121 ℃灭菌 20 min， 取出后置于接种室备用。 培养
条件为光照 12 h， 黑暗 12 h， 光强 1 500～2 000 lx，
相对湿度 60％， 温度 （26±2）℃。 5 个浓度梯度， 6
个时间点共 30 个处理， 每个处理 20 个外植体， 所
有处理重复 3 次， 待不定芽完全成苗后（约 8～10
周）， 统计不定芽的诱导及变异情况。
1.2.2 多倍体鉴定 秋水仙碱处理后的变异植株主
要表现为 3种类型： 一类为白化苗； 二类为部分叶片
缺裂的植株； 三类为叶片变宽变绿、 苗头变大的植
株。 多倍体植株主要从第 3类植株中进行筛选。
表型变异特征测定： 以第 3类再生植株为粗筛
群体， 从中挑选有明显表型变异的植株， 以同一批
未进行秋水仙碱诱变处理的再生植株为对照， 每株
选取 2～3 片完全展开的叶片， 用测量尺和油标卡
尺分别测量叶片长度、 宽度、 叶片厚度以及苗头大
小（横向和纵向）， 根据测定的长度和宽度值计算相
应的叶形指数。
叶片下表皮气孔特征观察： 从粗筛群体中挑选
部分有代表性的植株， 撕取叶片下表皮， 平铺于载
玻片上， 用 1％碘-碘化钾染色 5～10 min， 然后于
显微镜下进行观察。 分别选取 5 株对照植株和变异
植株， 每株取 2 个叶片， 每个叶片选取 10 个视野，
在 Nikon ECLIPSE 80i 显微镜 10×/0.3 视野下统计
气孔密度（每个视野里的气孔数目）、 测量气孔的大
小， 并拍照保存。
流式细胞仪检测： 取未经过秋水仙碱处理的植
株、 经秋水仙碱处理二倍体再生植株和有表型变异
的再生植株的完整新鲜叶片 ， 用流式细胞仪
（Partec）测定变异植株和对照植株体细胞 DNA 的
相对含量， 具体方法参照 Palomino 等 [8]的方法进
行。 DNA 含量由广州市佰而林生物科技有限公司
检测。
1.2.3 数据处理 不定芽分化率=（分化不定芽的
愈伤组织数/接种的愈伤组织数）×100％
分化系数=分化的不定芽数/分化不定芽的愈伤
组织数
诱变率=（分化有表型变异的不定芽的愈伤组
织数/分化不定芽的愈伤组织数）×100％
所有数据均采用 SAS 分析软件进行统计， 并
进行差异显著性分析（p≤0.05）。
2 结果与分析
2.1 秋水仙碱对剑麻愈伤组织不定芽诱导和诱变
的影响
如表 1 所示： 未经秋水仙碱处理的愈伤组织不
定芽分化率在（91.67±2.89）％与（100±0.00）％之间，
分化系数在（5.45±2.42）与（7.87±2.87）之间， 诱变
率为 0％。 经不同浓度的秋水仙碱处理后， 不定芽
诱导率和分化系数均有显著降低。 用 2 g/L 的秋水
仙碱处理 1、 2、 3、 4、 5、 6 d， 不定芽分化率分别
为（86.67±2.89）％、 （71.67±2.89）％、 （56.67±2.89）％、
（51.67±2.89）％、 （3.33±2.89）％、 （1.67±2.89）％ ；
分化系数分别为（4.91±1.56）、 （3.78±1.31）、 （3.34±
1.39）、 （2.63±1.01）、 （2.5±0.71）； 即相同浓度的秋
水仙碱， 随着处理时间的延长， 不定芽分化率降
低， 达显著水平， 分化系数下降但差异不显著， 其
1410- -
第 8 期
处理浓度/（g/L） 处理时间/d 愈伤组织总数 不定芽分化率/％ 分化系数 诱变率/％
对 照
1 60 （96.67±2.89）a （7.87±2.87）a 0
2 60 （100±0.00）a （6.56±2.58）a 0
3 60 （96.67±2.89）a （6.3±2.82）a 0
4 60 （91.67±2.89）a （5.88±2.31）ab 0
5 60 （93.33±2.89）a （6.24±2.62）a 0
2
1 60 (86.67±2.89)b （4.91±1.56）b （7.62±3.02）c
2 60 （71.67±2.89)c （3.78±1.31）cd （11.59±3.88）c
3 60 （56.67±2.89)e （3.34±1.39）cde （11.62±4.38）c
4 60 （51.67±2.89)fg （2.63±1.01）efg （12.73±4.72）c
5 60 （3.33±2.89)l （2.5±0.71 ）efg -
4
1 60 （86.67±2.89)b （4.21±1.92）bc （35.14±3.82）b
2 60 （63.33±2.89)d （3.55±1.24）cd （57.69±6.66）a
3 60 （53.33±2.89)ef （3.40±1.28）cde （43.63±3.14）ab
4 60 （43.33±2.89)i （2.45±0.89）fg （42.59±8.49）ab
5 60 - - -
6
1 60 （63.33±2.89)d （3.75±1.59）cd （47.44±8.01）ab
2 60 （46.67±2.89)hi （3.03±1.22）def （46.29±3.21）ab
3 60 （18.33±2.89)j （2.11±0.86）g （44.44±9.62）ab
4 60 （10.00±0.00)k （1.33±0.29）h -
5 60 - - -
8
1 60 （48.33±2.89)gh （2.89±1.18）defg （51.85±10.50）a
2 60 （13.33±5.77)k （2.56±0.96）efg （48.89±18.36）ab
3 60 - - -
4 60 - - -
5 60 - - -
6 60 （91.67±2.89)a （5.45±2.42）ab 0
6 60 （1.67±2.89)l - -
6 60 - - -
6 60 - - -
6 60 - - -
表 1 不同浓度和处理时间组合的秋水仙碱对剑麻不定芽分化和诱变的影响
说明： 同列数据后不同小写字母表示 0.05 水平上的差异显著性， 下同。 “-” 表由于愈伤组织经秋水仙碱处理后出现部分或全部
死亡， 仅有 0～1 个观测值， 无法进行统计分析。
它浓度亦表现如此。 分别用 2、 4、 6、 8 g/L的秋水仙
碱处理 1 d， 不定芽分化率分别为（86.67±2.89）％、
（86.67±2.89）％、 （63.33±2.89）％和（48.33±2.89）， 分
化系数分别为（4.91±1.56）、 （4.21±1.92）、 （3.75±
1.59）和（2.89±1.18）， 即相同的处理时间， 随着浓
度的增加分化率显著下降， 分化系数下降但差异
不显著。 当用 4 和 6 g/L 的秋水仙碱处理 5～6 d，
用 8 g/L 的秋水仙碱处理 3～6 d， 愈伤组织全部死
亡（图 1）。 从诱变效果看， 不同浓度的秋水仙碱对
剑麻愈伤组织都可以产生诱变效果， 用低浓度的秋
水仙碱处理（2 g/L组合）， 其诱变效果显著低于 4、
6、 8 g/L 处理组合， 但相同浓度、 不同时间的秋水
仙碱处理之间， 诱变率差异不显著。
2.2 倍性鉴定
2.2.1 二倍体植株和变异体植株的形态特征比较
从图 2可以看出， 变异体植株生长健壮， 叶片
宽度、 苗头大小均大于对照植株。 如表 2 所示， 变
异体叶片平均长为 （10.25±2.82）cm， 宽为 （0.95±
0.17）cm， 厚度为 （0.97 ±0.22）mm， 苗头大小为
（6.70±0.96）mm（纵向）和（7.58±1.02）mm（横向）， 二
倍体对照植株叶片平均长为（9.18±2.45）cm， 宽为
（0.66±0.16）cm， 厚度为（0.75±0.21）mm， 苗头大小
张燕梅等： 剑麻四倍体诱导与倍性鉴定 1411- -
第 34 卷热 带 作 物 学 报
倍 性 叶长/cm 叶宽/cm 叶形指数 叶厚/mm 苗头大小（纵向）/mm 苗头大小（横向）/mm
变异体 （10.25±2.82）a （0.95±0.17）a （10.85±2.68）b （0.97±0.22）a （6.70±0.96）a （7.58±1.02）a
二倍体 （9.18±2.45）b （0.66±0.16）b (14.64±5.72）a (0.75±0.21）b (5.01±0.77）b (5.71±0.80）b
表 2 剑麻变异体植株与对照植株叶片形态比较
左为变异植株， 右为二倍体对照植株。
图 2 剑麻变异植株与对照植株比较
a 1～a 6 为对照； b 1～b 6 为 2 g/L 的秋水仙碱分别处理 1～6 d； c 1～c 6 为 4 g/L 的秋水仙碱分别处理 1～6 天； d
1～d 6 为 6 g/L 的秋水仙碱分别处理 1～6 d； e 1～e 6 为 8 g/L 的秋水仙碱分别处理 1～6 d； a 1～a 6 为在分化培养基上
培养 8 周的情况， b 1～b 6、 c 1～c 6、 d 1～d 6、 e 1～e 6 为在分化培养基上培养 4 周的情况。
图 1 秋水仙碱对剑麻不定芽分化的影响
a 1 a 2 a 3 a 4 a 5 a 6
b 1 b 2 b 3 b 4 b 5 b 6
c 1 c 2 c 3 c 4 c 5 c 6
e 1 e 2 e 3 e 4 e 5 e 6
d 1 d 2 d 3 d 4 d 5 d 6
为（5.01±0.77）mm（纵向）和（5.71±0.80）mm（横向），
叶片长度、 宽度、 厚度以及苗头大小等均显著高于
对照植株 ， 变异体植株的叶形指数为 （10.85 ±
2.68） ， 显著低于对照植株的叶形指数 （14.64±
5.72）。
2.2.2 气孔密度、 大小以及叶绿体含量比较 显
微镜观察显示： 突变体叶片下表皮细胞明显比二倍
体大， 保卫细胞位于两个细胞的交联处， 呈纺锤
型。 二倍体植株的保卫细胞密度为（15.05±3.26）
个/视野， 保卫细胞长为（62.21±7.37）μm， 保卫细
胞宽为（26.54±4.71）μm， 变异体植株的保卫细胞密
度为 （8.17±1.91）个/视野 ， 保卫细胞长为 （75.78±
10.69）μm， 保卫细胞宽为（36.01±4.61）μm（表 3），
二倍体和变异体植株的保卫细胞密度、 大小以及叶
绿体数如图 3所示， 变异体植株叶片的保卫细胞长
和宽均显著大于二倍体（图 3-c、 d）， 气孔密度显
著低于二倍体（图 3-a、 b）， 叶绿体数明显比二倍
体多（图 3-e， f）。
1412- -
第 8 期
倍 性 保卫细胞长/μm 保卫细胞宽/μm 气孔密度/（个/每个视野）
二倍体 （62.21±7.37）b （26.54±4.71）b （15.05±3.26）a
变异体 （75.78±10.69）a （36.01±4.61）a （8.17±1.91）b
表 3 二倍体与变异体植株叶片保卫细胞比较
a b c
d e f
a、 c、 e 为二倍体植株气孔， b、 d 及 f 为变异体植株气孔， a、 b、 c、 d 为关闭状态， e、 f 为打开状态
a、 b 为 10×/0.3 视野下拍摄， c、 d、 e 和 f 为油镜下拍摄 （bar=100px）。
图 3 变异体和二倍体剑麻叶片气孔
a 为对照的二倍体植株 DNA 含量分布图； b 为二倍体再生植株 DNA 含量分布图； c 为多倍体再生植株 DNA 含量分布图。
图 4 DNA 含量分布图
400
300
200
100
0
0 30 60 90 120 150 0 20 40 60 80 100 120 0 30 60 90 120 150
细
胞
数
200
150
100
50
0
细
胞
数
细
胞
数
200
150
100
50
0
荧光强度 荧光强度 荧光强度
a b c
2.2.3 体细胞 DNA 相对含量测定 如图 4 所
示 ： 对照植株在荧光强度为 48 左右出现了一
个单峰 （图 4-a） ， 二倍体再生植株在荧光强度
为 48 左右出现了一个单峰 （图 4-b） ， 与对照
植株结果一致 ， 突变体再生植株在荧光强度为
89 左右出现了一个单峰 （图 4 -c） ， 即突变植
株 DNA 含量为对照植株的 2 倍 ， 即突变植株
为四倍体 。
3 讨论与结论
研究发现高浓度长时间的秋水仙碱处理愈伤
组织全部死亡， 并且愈伤组织死亡率与愈伤组织
大小和继代次数有关。 可能原因为秋水仙碱对材
料本身有毒害作用， 另外， 不同的外植体对秋水
仙碱的吸收以及耐受性存在明显的差异， 并不是
浓度越高越好 [26]。
研究表明， 随着处理时间的延长和浓度的增
张燕梅等： 剑麻四倍体诱导与倍性鉴定 1413- -
第 34 卷热 带 作 物 学 报
加， 分化率和分化系数显著下降， 生长迟缓， 不定
芽诱导明显比未进行处理的慢。 这与 Omezzine 等[21]
和 Majdi 等[20]的研究结果一致。 Swanson[27]认为秋水
仙碱处理后引起生理紊乱从而导致细胞分裂减慢，
继而影响植株的正常生长， Chakraborti 等[28]认为秋
水仙碱渗透到了顶端分生细胞层， 影响了分生细胞
组织的正常分裂。
本研究中还发现， 最高的处理浓度和处理时间
组合， 多倍体的诱变率并不是最高的， 相反， 随着
浓度升高和处理时间延长， 畸形苗增加， 致死率也
明显增加， 这与 Sarathum 等 [26]的研究结果相似 。
Sarathum 等[26]认为存活率下降是因为处理材料过度
失水以及吸收秋水仙碱太多， 大多数处理材料都出
现死亡所致。 Luckett[29]则认为超过了染色体加倍的
时期， 秋水仙碱无法抑制纺锤体的形成， 不能起到
加倍的作用。 此外， 秋水仙碱本身也有一个代谢
期， 时间太长， 秋水仙碱代谢掉了， 其作用也就不
存在了。
此外， 在所有处理组合中， 都有不同程度的白
化苗出现。 这与 Sarathum[26]和Shahinul[30]的研究结
果一致。 Luckett[29]认为产生白化苗的原因是染色
体发生变异 （如重排或丢失 ）或基因突变所致 ，
Shahinul[30] 则认为是秋水仙碱引起生理紊乱导致叶
绿素合成受阻。
显微镜观察发现突变体的下表皮细胞增大， 气
孔大小和形态， 保卫细胞密度与对照均存在明显差
异， 表型观察突变体植株的叶片明显比正常植株的
叶片厚、 宽， 苗头也比正常植株粗壮， 这与 Majdi[20]
等的研究结果一致。 Leitch[31]和Breuer等[32]认为组织
器官变大是因为 DNA 含量增加 。 流式细胞术
在剑麻基因组大小和 DNA 含量分析中已广泛
应用 [8，33]， 本研究用流式细胞技术对 H.11648 进行
DNA 含量测定， 分析结果与气孔观察结果基本一
致。 由于剑麻染色体结构和形态繁多 [34]， 倍性复
杂[8-11]， 采用流式细胞技术只能对 DNA 含量和倍性
进行分析， 无法观测染色体的具体形态特征， 建
议在进行倍性检测时， 将流式检测技术与常规的
染色体制片技术相结合， 进一步分析染色体形态
特征及倍性。
基于以上结果， 建议在做诱变处理时， 应根据
具体材料做相应的浓度和处理时间的筛选， 为了减
少秋水仙碱对材料本身的伤害， 宜采用低浓度处
理。 在进行倍性鉴定时， 可以将植物的表型、 气孔
大小、 形态以及密度等作为初步筛选多倍体植株的
指标， 然后再进行 DNA 水平或染色体数目等方面
的鉴定。
本研究共获得 360 株再生多倍体植株， 移栽成
活 355 株， 成活率为 98.61％， 由于龙舌兰麻在自
然条件下变异广泛存在， 加倍后的再生植株在后期
的生长或繁殖过程中是否会稳定保存， 还有待进一
步研究。
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责任编辑： 凌青根
张燕梅等： 剑麻四倍体诱导与倍性鉴定 1415- -