全 文 ：收稿　2002-07-15　　　　修定　2002-11-18
资助　四川省中江县中药材(丹参)科技种植示范项目[ 川中药基
领(2001)01] 。
　＊　通讯作者(E-mail:nyz@sicau.edu.cn , Tel:0835-2882786)。
南丹参离体快速繁殖与多倍体诱导
段英姿1 　牛应泽1 , ＊　刘玉贞1 　郭世星1 　彭朝忠2(1四川农业大学油菜研究中心 , 四川雅安 625000;
2四川省中江县农业局 ,四川中江 618100)
提要　MS 附加 6-BA 2.0 mg·L-1和 IAA 0.2 mg·L-1的培养基上诱导南丹参丛生芽的频率最高(达 100%), 每一丛生芽数
达 20 ～ 30 个 ,移栽成活率 90%。MS 附加 6-BA 2.0 mg·L-1和 2 , 4-D 0.2 mg·L-1培养基上 , 叶缘及叶柄上长出绿芽或浅褐
色愈伤组织 ,经多次继代仍具有分化植株能力。多倍体诱导以秋水仙碱 15 mg·L-1处理愈伤组织和预培养 1周 ,处理时间 1
周的叶片诱导效果较好 ,加倍率可达 33.33%,且多数为整株加倍。加倍植株叶片较肥厚宽大 、皱折增多 、色深 、根粗壮 ,气孔
比二倍体明显增大 ,染色体数为 28 ～ 32 条不等 ,其中可见部分为同源四倍体。
关键词　南丹参;快速繁殖;秋水仙碱;多倍体诱导
In vitro Rapid Propagation and Induction of Polyploidy with Colchicine in
Salvia bowleyana
DUAN Ying-Zi1 , NIU Ying-Ze1 , ＊ , LIU Yu-Zhen1 , GUO Shi-Xing1 , PENG Chao-Zhong2(1Rapeseed Research Center , S ichuan
Agricultural University , Y aan , Sichuan 625000;2Zhongjiang Agricultural Beauro , Zhongjiang , Sichuan 618100)
Abstract　A high frequency (100%)of clump sprouts induction in Salvia bowleyana was observed on the M S
medium with 2.0 mg·L-1 6-BA , 0.2 mg·L-1 IAA.The number of clump sprouts counted to 20 ～ 30 , and
the survival rate af ter transplantation w as 90%.The green sprouts and the pale brow n calli from the leaf edges
and the petioles on the MS medium w ith 2.0 mg·L-1 6-BA and 0.2 mg·L -1 2 ,4-D still showed the capability
of dif ferentiation af ter several subcultures.In polyploid induction , the t reatments of calli and leaf slices , pre-
cultured w ith 15 mg·L-1 of colchicine for one w eek , show ed the best doubling ef fects , the doubling rate
reached 33.33%, in w hich the majority were w holly doubled plants.The doubled plants produced thicker and
broader leaves w ith a darker color , a thick root system and an obviously big ger stoma size , as compared to the
diploid plants.Chromosome numbers of the doubled plants ranged from 28 to 32 , parts of the doubled plants
w ere ident if ied as homologmous tet raploids.
Key words　Salv ia bowleyana;rapid propagation;colchicine;polyploid induction
　　在生产中由于南丹参不易得到种子 , 一般用
根繁殖 , 用种量大 , 且长期用根进行无性繁殖易感
染病毒 , 导致种群退化 、产量下降 、品质变劣 。用南
丹参优良株系的茎尖或幼叶进行组织培养快速繁
殖 , 1株良种苗 1年可繁殖上万株试管苗 , 可迅速
扩大优良种群。在离体培养过程中 , 结合人工多倍
体的诱导 , 方法简单 , 处理植株量大 、诱导率高 、繁
殖快 。四倍体植株根 、茎 、叶比二倍体大 , 长势旺 ,
经过选育可望获得产量高 、药用化学成分含量也提
高的新品系。因此 , 我们对南丹参叶片脱分化和根
芽分化的生长调节物质调控 , 以及秋水仙碱浓度 、
处理方式 、处理时间对诱导多倍体的效应和多倍体
鉴定等进行了研究 。本文报道得到的初步结果 。
材料与方法
　　实验材料南丹参(Salvia bow leyana)由四川省
优质丹参生产基地中江县科技局提供 ,为当地大面
201植物生理学通讯　第 39 卷 第 3 期 , 2003 年 6 月
DOI :10.13592/j.cnki.ppj.2003.03.004
积栽培的优良品种之一 。2001年春从中江县采集
南丹参膨大的根 ,栽于四川农业大学教学实验农
场。出苗后 ,取幼芽在室内进行快速繁殖 ,并为进
一步加倍试验提供材料。
快速繁殖南丹参　取 2 ～ 3 cm 幼芽流水冲洗
后 ,在 75%酒精中泡 30 s , 0.1%升汞液中消毒 8
min ,无菌水冲洗 3次 ,用无菌纸吸干 ,分别取茎尖 、
叶片 、叶柄 ,切成 0.5 cm2左右的小块 ,迅速接种在
培养基上 ,于(25±1)℃、光照度2 000 lx 、光照 12
h·d-1条件下培养 。培养基组成为:(1)诱导培养
基 ,MS+1 ～ 2 mg·L-1 6-BA+7 g·L-1琼脂+3%
蔗糖 ,分别附加 0.2 mg·L-12 , 4-D 、0.2 mg·L-1
IAA或 0.2 mg·L -1NAA;对照则不加生长素 , IAA
采用过滤除菌。(2)生根培养基 ,1/2MS+0.2 mg·
L-1ABT(1号生根粉 ,中国林业科学院 ABT 研制
中心)+7 g·L-1琼脂+2%蔗糖 , pH值为5.8。
南丹参多倍体诱导　(1)幼苗处理法。将秋水
仙碱过滤灭菌后配成分别含 30 、40 、50 mg·L-1的
秋水仙碱培养基 ,将 1.5 ～ 2 cm 长的健壮幼苗转入
该培养基中 ,分别处理 5 、7 、10 d ,各设 3次重复 ,每
组处理 50 株。转入生根培养基之后 ,开始 1 周转
继1次 ,转 2 次后间隔的时间可延长 。(2)叶片处
理法 。参照王鸿鹤等[ 3]的培养方法 ,将带柄幼叶切
成0.5 cm2的小块 ,接种于分化培养基预培养 1 周
后 ,分别转入加有 5 、10 、15 、20 mg·L-1秋水仙碱的
分化培养基中处理 1周或 2周后 ,再转入无秋水仙
碱的分化培养基中继续培养 ,各设 3 次重复 ,每处
理50个切块。(3)愈伤组织处理法 。将带柄幼叶
切成 0.5 cm 2的小块 ,接种于诱导培养基上 。当愈
伤组织长出后 ,切割成 3 ～ 5 mm2大小 ,转入加有 5 、
10 、15 、20 mg·L-1秋水仙碱的分化培养基中处理 1
周或 2周后 ,再转入无秋水仙碱的分化培养基中继
续培养 ,各设 3次重复 ,每处理 50个切块。
多倍体鉴定　(1)气孔保卫细胞的比较观察 。
南丹参的气孔属平列型。据报道[ 4 , 5] ,同一种植物
的多倍体要比二倍体气孔稍大。我们对南丹参气
孔进行了观察 ,取同一位置和大小相近的二倍体和
多倍体试管苗叶片撕取下表皮 ,放在高倍光学显微
镜下 ,用测微尺测量气孔和保卫细胞的长度与宽
度 ,每个叶片随机测 20个气孔 ,取平均值进行比
较 ,同时进行扫描电镜观察。(2)染色体数目观察 。
对加倍处理后的试管苗 ,在根长达 1 cm 左右时 ,切
取 4 ～ 6 mm 根尖 ,按蔡朝晖等[ 6]方法进行染色体
显微鉴定 。
结果与讨论
1　最佳快繁培养基的选择
　　要获得高频率的再生芽 ,最重要的是筛选出最
佳分化培养基。我们在光照 2 000 lx 、温度
(25±1)℃下 ,用不同配比的生长调节物质处理得
到的再生芽率均达 90%以上 ,每一个芽丛约有20 ～
30个芽(图 1-c),用生长期长短为指标筛选最佳分
化培养基。其中 MS +2 mg·L-1 6-BA+0.2 mg·
L
-1
IAA培养基诱导出芽时间最短 ,约 20 d 。当叶
和叶柄切块接种至培养基上约 1周时外植体切口
处变厚 ,长出愈伤组织 ,很快从愈伤组织处长出丛
生芽 。约 20 d 后 ,将丛生芽转至除去 IAA 的培养
基上继代繁殖 ,使芽丛健壮生长 。将生长健壮 、长
约 2 cm 的单芽剪下 , 转入1/2M S+0.2 mg·L -1
ABT +2%蔗糖的生根培养基上 , 10 d后开始生根 ,
生根率达 95%以上(图 1-d)。移栽按常规组培苗
移栽方法进行 ,成活率达 90%左右 。
在加有 2 ,4-D和 NAA的培养基上诱导出的愈
伤组织 ,生长快 、长势旺 , 呈浅褐色 ,分化芽很少。
浅褐色愈伤组织在继代时会产生浅绿色愈伤组织 ,
转入分化培养基上时 ,分化出正常芽丛 。据观察 ,
除发生不定芽外 ,还有经胚状体途径发生的芽苗 ,
这些芽易脱落 ,分离成单苗 。这种愈伤组织属胚性
愈伤组织 ,继代能力强 ,松散 ,易分散成颗粒状。通
过胚状体途径分化成苗的这种类型的愈伤组织(图
1-a、b),常被用作基因转移的受体。
我们对初步鉴定为多倍体的株系进行快繁 ,也
得到类似的结果。但玻璃化现象稍多 ,对培养基中
生长调节物质浓度作适当调控 ,基本上可以得到控
制。
2　秋水仙碱对诱导南丹参加倍的效果
　　秋水仙碱诱导结果表明 ,在幼苗处理中 ,以 40
mg·L-1秋水仙碱处理 5 d的效果最显著 ,幼苗加倍
株数约占 11%(表 1)。在叶片处理时 ,将叶片预培
养 1周后转到 5 ～ 20 mg·L-1的秋水仙碱培养基中
处理1 ～ 2 周 ,均有利于多倍体的发生 。从产生多
倍体频率来看 ,15 mg·L-1处理 1周的效果最好 ,加
倍率最高达 33.33%(表 2)。愈伤组织处理的结果
与叶片处理类似 ,加倍率亦较高 ,但由于需要首先
诱导 出愈伤组织 再进行诱导 分化 , 所 需时
间较叶片为长(表3)。3种方法中 ,南丹参多倍体
202 植物生理学通讯　第 39 卷 第 3 期 , 2003 年 6 月
图 1　南丹参愈伤组织的形成及植株再生
F ig.1　The fo rmation of callus and plant regeneration in S alvia bow leyana
表 1　不同浓度秋水仙碱处理幼苗的加倍效果
Table 1　The doubling effect s of diff eren t concent rations of colchicine on cultured young plant let s %
秋水仙碱浓度/
mg·L -1
成活率
处理 5 d 处理 7 d 处理 10 d
加倍率
处理 5 d 处理 7 d 处理 10 d
30 66.67±1.15 26±2 14.67±5.00 3.33±1.15 8.67±1.15 4.67±1.15
40 36.00±2.00 22±2 16.67±3.15 11.00±0 8.00±0 6.00±0
50 12.00±2.00 8±0 0 10.00±4.00 4.67±2.30 0
的诱导频率随外植体 、处理时间 、秋水仙碱浓度的
不同 ,诱导效果均有不同。处理时间越短 ,秋水仙
碱浓度越低 ,分化率虽高 ,但加倍率低;处理时间越
长 ,秋水仙碱浓度越高 ,外植体受害越严重 ,分化率
及加倍率亦随之降低 。因此 ,要获得较高的加倍率
和保持较高的成活率 ,选择适宜的外植体 、处理时
间和秋水仙碱浓度是非常重要的。本文结果表明 ,
离体培养早期进行多倍体诱导比成苗后诱导效果
好。由于叶片和愈伤组织在迅速生长和分化中 ,细
胞分裂活跃 ,秋水仙碱抑制分裂细胞内纺锤体的形
成 ,使染色体不能排列到赤道板处 ,只能分散在细
胞中 ,此种细胞不能分裂成两个子细胞 ,从而使染
色体加倍 ,结果是二倍体变成四倍体细胞 。这些细
胞继续分裂 ,可能发育成四倍体植株。用幼苗加倍
203植物生理学通讯　第 39 卷 第 3 期 , 2003 年 6 月
表 2　不同浓度秋水仙碱处理叶片的加倍效果
Table 2　The doubling effect s of dif ferent concent rations of colchicine on cultured leaf slices %
秋水仙碱浓度/
mg·L -1
成活率
处理 1周 处理 2周
分化率
处理 1周 处理 2周
加倍率
处理 1周 处理 2周
5 72.00±2.00 52±2 64.00±2.00 46.00±2.00 14.00±0 18.00±0
10 64.00±2.00 50±2 58.00±2.00 42.67±2.33 22.67±1.15 26.00±0
15 56.00±0 36±2 49.33±5.03 28.67±1.15 33.33±1.15 24.67±1.15
20 32.67±3.06 16±2 24.67±2.31 8.67±1.15 18.67±1.55 20.00±0
表 3　不同浓度秋水仙碱处理愈伤组织的加倍效果
Table 3　The doubling ef fects of di fferent concentrat ions of colchicine on callus %
秋水仙碱浓度/
mg·L -1
成活率
处理 1周 处理 2周
分化率
处理 1周 处理 2周
加倍率
处理 1周 处理 2周
5 70.00±0 54±2 70.00±0 42.67±2.33 13.33±1.15 16.00±0
10 66.00±2.00 60±0 56.00±2.00 48.67±1.15 22.00±0 24.00±2.00
15 49.33±1.15 36±2 40.00±2.00 24.00±0 30.67±1.15 28.00±0
20 26.00±2.00 16±2 14.67±1.15 6.00±2.00 14.00±2.00 4.67±1.15
只能作用于根茎尖端生长点 ,常出现部分腋芽或根
尖加倍现象 ,整体加倍则很困难 。我们在油菜游离
小孢子培养中也曾见到类似情况 ,即在小孢子培养
过程中进行加倍处理与小孢子成苗后再加倍处理 ,
结果是前者加倍率大大高于后者(待发表资料)。
本文中 3种方法以叶片处理法诱导多倍体的效果
最好 ,不仅经济方便 ,所需时间短 ,而且加倍率较
高 ,更重要的是 ,用此法可在短期内繁殖大量的多
倍体植株 。
3　人工多倍体的鉴定
3.1　形态变化　多倍体在外部形态上叶片较肥厚
宽大 ,皱折较多 ,叶柄基部膨大 , 色深 , 根较粗壮。
以显微镜观察叶片气孔的结果表明 ,四倍体比二倍
体的气孔明显较大 ,保卫细胞更大(图 2 、表 4)。
图 2　南丹参二倍体与多倍体气孔的扫描电镜观察
Fig.2　The electronic microscope observed stoma sizes of diploid and polyploid in Salv ia bow leyana
204 植物生理学通讯　第 39 卷 第 3 期 , 2003 年 6 月
表 4　南丹参多倍体与二倍体气孔及保卫细胞的比较
Table 4　T he comparision of stomata and protect ive cells betw een
diploid and polyploid in Salvia bowleyana
倍性 叶面积/
cm2
气孔长/
μm
气孔宽/
μm
保卫细胞
长/μm
保卫细胞
宽/μm
二倍体 1 10.45 6.35 12.34 5.36
多倍体 1 13.56 7.96 15.66 8.06
相对数/ % 129.80 125.20 126.90 150.40
3.2　染色体数目的观察　在形态鉴定基础上 , 对
试管苗根尖染色体作了显微鉴定 ,以未处理植株为
对照 ,其染色体数为 2n=16 ,加倍多倍体的染色体
数为28 ～ 32条不等(图 3),可见部分多倍体为同源
四倍体。这说明用秋水仙碱诱导南丹参获得多倍
体的方法是有效的 ,用上述形态学方法鉴定多倍体
也是有效的。因此 ,通过组织培养技术与秋水仙碱
诱导处理相结合 ,得到南丹参多倍体的育种方法是
可行的 ,操作简便 ,可处理较大量的植株 ,诱变率
高 ,繁殖速度快 ,用药量少 ,可能是药用植物多倍化
育种的有效途径。
图 3　南丹参二倍体与多倍体的染色体数目比较
Fig.3　The comparison of chromosome numbers between diploid and polyploid in Salvia bow leyana
参考文献
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205植物生理学通讯　第 39 卷 第 3 期 , 2003 年 6 月