全 文 ：·基础与临床·
山梗菜碱对MPTP 诱导小鼠帕金森病的治疗效应
栗超跃 惠国桢 史锡文 张建国 周 伟 柴 昌 步星耀
基金项目:国家自然科学基金(30271325);江苏省自然科学基金
(BK2001170)
作者单位:450003 郑州 , 河南省人民医院神经外科(栗超跃 、
史锡文 、张建国 、周 伟 、柴 昌 、步星耀);苏州大学附属第一医院神经
外科(惠国桢)
责任作者:惠国桢 E-mai l:guozhen-hui@163.com
山梗菜碱是一种亲脂性的非吡啶生物碱 ,为半边莲属的
一个主要成分。山梗菜碱被发现具有对黑质多巴胺能细胞
内多巴胺递质分布调节作用 , 可以促进多巴胺释放 , 提高细
胞外多巴胺浓度[ 1] 。那么 ,山梗菜碱是否具有改善帕金森病
(PD)的作用是我们研究的目的。
材料与方法
1.材料 C57BL/ 6J 由中科院上海生命科学院动物中
心提供;山梗菜碱 、多巴胺转运蛋白抑制因子(GBR12935)、
左旋多巴(L-DA)、1-甲基-4-苯基-1 , 2 , 3 , 6-四氢吡啶(MPTP)
和兔抗鼠 T H 抗体购自 Sigma公司;免疫组化按试剂盒购自
上海实生公司。
2.方法
(1)MPTP 诱导小鼠 PD模型的制作[ 2]及分组:36 只小
鼠体重(30±2)g , 实验开始时为 4 个月龄大小;分为 6 组
(n=6)。其中 5 组连续皮下注射 M PTP(30 mg · kg-1 · d -1)
5 d;另 1 组注射生理盐水作为对照 ,在每天注射 M PTP 后立
即给予药物治疗。前 3 组给予山梗菜碱 1 mg/ kg、3 mg/ kg
和 GBR12935(10 mg/ kg),第 5 组给予 L-DA(80 mg · kg-1
· d-1)替代治疗;连续药用 11 d。
(2)滚筒实验[ 3] :滚筒由两部分组成 ,控制元件和小鼠滚
动元件。小鼠在注射 MPTP 前先在滚筒上进行不同滚速训
练 2～ 3 d ,每天 2 次。在实验的第 7 、9 和 11 天进行 3 次检
测不同滚速在滚筒上的时间 ,取平均值 , 计算 ORP 值。
(3)游泳实验[ 4] :实验前一天在水桶中适应 10 min。为
了防止强迫游泳造成抑郁症状影响其他行为学实验 , 游泳实
验在第 11 天完成滚筒试验后进行。计分标准:0 , 在实验时
间内一直漂浮;1 ,偶尔游泳;2 , 游泳过程偶尔漂浮;3 , 连续不
断游泳。
(4)免疫组化染色:小鼠用 10%水合氯醛麻醉后 4%多
聚甲醛灌注 ,取脑组织后再在 4%多聚甲醛固定 24 h , 随后
再 25%蔗糖溶液中浸泡 48h , 行冰冻切片;TH 免疫组化按
试剂盒说明书操作(漂浮法):漂洗 , 甲醇处理 , 0.02%
T ritonX-100 的 3%羊血清 , 4℃ 24 h;不用 PBS 洗 ,直接加含
有 0.02%T ritonX-100 兔抗鼠 T H 抗体(含有 3%羊血清),
4℃ 24 h ,加入二抗 , 37℃ 1 h , DAB染色 , 显微镜下控制。镜
下记数黑质阳性细胞 ,阳性细胞为细胞浆内棕黄色颗粒染色
细胞;黑质连续切片 ,取均数。
3.统计学处理 计量数据以均数±标准差( x±s)表
示 ,采用 SPSS 10.01统计软件包处理 , P<0.05 为差异有统
计学意义。
结 果
1.MPTP 诱导的小鼠 PD 模型 小鼠在 M PTP 皮下注
射后 30 min 内表现为后脚叉开 、竖尾等 , 3 h 后出现僵直状
态 , 表明 MPTP已经发挥作用;连续皮下注射 5 d 备用。
2.滚筒实验 山梗菜碱治疗的两组行为都有改善 ,
3 mg/ kg治疗组显著改善运动缺陷 ,与生理盐水治疗组比较
(P<0.05), 与正常对照组比较(P>0.05), 1 mg/ kg 治疗组
有改善 , 差异无显著性(P>0.05);L-DA 和 GBR12935 为阳
性对照(图 1)。
图 1 山梗菜碱治疗 M PTP 诱导的小鼠 PD 模型的滚筒实验评
分
3.游泳实验 山梗菜碱(3 mg/ kg)、GBR12935 和L-DA
均有效改善小鼠运动缺陷 , 差异有显著性(P <0.05);而低
剂量的山梗菜碱(1 mg/kg)改善不明显(P>0.05)(图 2)。
图 2 山梗菜碱治疗 M PTP 诱导的小鼠 PD 模型的游泳实验评
分
·629·江苏医药 2008年 6月第 34卷第 6期 Jiang su Med J , Ju ne 2008 , Vol 34 , No.6
4.TH 免疫组化 实验结束后 , 每组随机抽取 3 只小鼠
做 TH 染色。MPTP 单独处理组黑质细胞严重丢失 ,丢失达
到 70%以上;L-DA 治疗组的多巴胺能细胞丢失要比 MPTP
单独处 理组严重 , 达 80%的多巴胺能 神经元丢 失;
GBR12935 和低剂量(1 mg/kg)山梗菜碱治疗组细胞丢失数
与生理盐水治疗组比较有所减少 , 达 60%, 差异有统计学意
义(P<0.05),而高剂量组(3 mg/ kg)仅仅使多巴胺能神经
元丢失了 10%左右 , 明显低于 GBR12935 和低剂量组的山
梗菜碱(1 mg/ kg)(P<0.05)(图 3)。
图 3 T H 免疫组化定量分析
讨 论
本研究利用 MPTP 诱导的帕金森病模型检测山梗菜碱
的可能治疗价值 , 应用行为学实验评价动物运动障碍及用
TH 免疫组化染色检测中脑黑质中多巴胺能神经元丢失情
况。结果显示 ,高剂量的山梗菜碱(3 mg/ kg)可以有效的改
善动物运动障碍 ,极大的减少黑质多巴胺能神经元丢失 , 而
低剂量(1 mg/ kg)和 GBR12935虽然可以一定程度上改善运
动障碍 ,但是对于多巴胺能神经元保护作用不是十分明显;
而作为替代治疗的 L-DA 可以改善运动障碍 , 但是不能有效
减少细胞丢失 ,且有加速细胞丢失的倾向 , 原因还不清楚。
我们选择山梗菜碱作为 PD 的治疗药物是根据前期工
作(另文发表于《中华神经外科疾病研究杂志》)发现山梗菜
碱是多巴胺转运蛋白的有效抑制因子 ,因为多巴胺转运蛋白
抑制因子作为 PD 的侯选药物已经有相关研究报道 ,证明是
有效的一类药物[ 5] 。同时 ,在多个大型流行病学调查中发现
吸烟的人群患 PD 危险性要比没有吸烟嗜好的人群低
2 倍[ 6] , 也就是说 ,在烟草成分中具有预防多巴胺能神经元
免受损伤的成分 , 尼古丁作为主要成分首先被用于实验 , 被
证明有效 , 而山梗菜碱与尼古丁具有许多相似的药理作
用[ 7] 。另外 , 研究还发现山梗菜碱可以促进多巴胺释放细胞
间隙 , 也即可以有效提高突触间隙多巴胺浓度。综合以上三
方面促使我们研究山根菜碱对 PD 治疗的应用价值。结果
表明高剂量的多巴胺具有保护作用和改善运动障碍的功能 ,
一方面是有效抑制 M PTP 的有效成分 MPP+进入多巴胺能
神经元的结果;另一方面也有可能通过类似尼古丁的途径有
效保护多巴胺能神经元 , 具体作用机制还需要继续研究 。此
外 , 由于 MPP+作为多巴胺能神经元神经毒物质 ,其毒性机
理既可以通过自身作用于呼吸链造成能量缺失 , 又能够加速
细胞内多巴胺的氧化造成细胞的损伤。 因此 , 利用 DAT 抑
制剂不仅有效抑制了 MPP+进入细胞 , 也可以有效减少细胞
内游离多巴胺的浓度 , 减少氧化 , 同时增加突触间隙多巴胺
浓度 , 取得一举两得的效果。
参 考 文 献
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(收稿日期:2007-08-18) (供稿编辑:王 瑶)
·630· 江苏医药 2008年 6月第 34卷第 6期 Jiangsu Med J , June 2008 , Vol 34 , No.6