全 文 ：垂枝红千层精油的提取及抗菌活性研究
陶文琴， 梁锦升， 赵琳芝， 王 刚，张日凤，黄丽宜
（广州大学生命科学学院， 广东 广州 510006）
摘 要：采用微波辅助水蒸馏提取法提取垂枝红千层叶片精油，并进行正交设计优化提取条件；测定精油对 7 种
人类病原细菌的抑菌圈、最低抑菌浓度（MIC）和最低杀菌浓度（MBC）以研究其抗菌活性。结果表明，垂枝红千层精油
的最佳提取条件为：液料比 8∶1（V/W）、提取时间 1.0 h、浸泡时间 1.5 h、提取功率 250 W，提取率为 0.793%。 垂枝红千
层精油对 7株受试菌（枯草芽胞杆菌、表皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯氏
菌、乙型副伤寒沙门氏菌）均有不同程度的抑制作用，其抑菌圈范围在 9.26~17.35 mm 之间，MIC 在 0.03125 ~ 0.0625
g/mL之间。
关键词：垂枝红千层； 精油； 微波辅助提取； 正交试验； 抗菌活性
中图分类号：Q949.96 文献标识码：A 文章编号：1004-874X（2014）06-0113-04
Study on extraction and antibacterial activity of
the essential oil from Callistemon viminalis
TAO Wen-qin, LIANG Jin-sheng, ZHAO Lin-zhi, WANG Gang, ZHANG Ri-feng, HUANG Li-yi
(School of Life Sciences, Guangzhou University, Guangzhou 510006, China)
Abstract: To extract the essential oil from Callistemon viminalis leaf by the method of microwave -assisted
hydrodistillation, the extraction conditions were optimized through orthogonal test, and antibacterial activity of the essential
oil was studied, the inhibition zone, minimal inhibitory concentration (MIC) and minimal bactericida concentration (MBC)
against 7 species of human pathogenic bacteria were tested by disk diffusion method and microtiter plate double dilution
method. The results showed that the optimum conditions of extraction were as follows: ratio of water to leaves 8 ∶1 (V/W),
microwave power 250 W, extracting time 1.0 h, soaking time 1.5 h, with the extraction yield of 0.793%. The results also
showed that the essential oil from C. viminalis exhibited broad spectrum effect against Gram-positive (Bacillus subtilis,
Staphlococcus aureus and S. epidermidis) and Gram -negative bacteria (Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa,
Klebsiella pneumonia and Salmonella paratyphoid B) with the range of 9.26~17.35 mm for inhibition zone and the range of
0.03125~0.0625 g/mL for MIC.
Key words: Callistemon viminalis; essential oil; microwave-assisted extraction; orthogonal test; antibacterial activities
垂枝红千层（Callistemon viminalis）属桃金娘科红
千层属植物， 从澳大利亚引种多作为庭园绿化观赏 [1]。
目前，国内尚缺乏对其药用价值的研究，仅见文献报道
其同属植物红千层 （C. rigidus） 和柳叶红千层 （C.
salignus）的挥发油成分，其中含多种生物活性物质 [2-3]。
另据《中华本草》记载，红千层可入药，主治感冒、咳喘、
风湿痹痛、湿疹、跌打肿痛[4]。 近年来，国外关于红千层
属植物的化学成分及其抗菌活性的研究较活跃，其中
披针红千层（C. lanceolatus）、C. comboynensis 及 C. vi-
ridiflorous 的提取物（或精油）具有良好的抗菌活性 [5-8]，
垂枝红千层粗提物对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、绿脓
假单胞菌等细菌具有抗菌活性[9]。 但同种植物因地理位
置、环境和农艺条件甚至昼夜节律的差异，所含化学成
分及其生物活性可能有所不同。 因此，本研究旨在研究
垂枝红千层的精油提取工艺及其抗菌活性， 以微波辅
助水蒸馏提取法，采用正交试验优化条件，提取垂枝红
千层植物精油， 并测定精油对 7 种常见人类病原菌的
抑菌圈、最低抑菌浓度（MIC）和最低杀菌浓度（MBC）。
1 材料与方法
1.1 试验材料
垂枝红千层的带叶片枝条采集于广州大学城内，
经广州大学生命科学学院繆绅裕教授鉴定。
试验菌株：金黄色葡萄球菌（Staphlococcus aureus）
ATCC21023、表皮葡萄球菌（S. epidermidis）CMCC26069、
枯草芽胞杆菌（Bacillus subtilis）CMCC63501、铜绿假单
收稿日期：2013-09-01
基金项目：广东省大学生创新训练项目（1107812017）
作者简介：陶文琴（1969-），女，博士，副教授，E-mail：taowen
qin@21cn.com
广东农业科学 2014 年第 6期 113
C M Y K
DOI:10.16768/j.issn.1004-874x.2014.06.051
0.70
0.65
0.60
0.55
0.50
0.45
提
取
率
（ %
）
6∶1 7∶1 8∶1 9∶1 10∶1
液料比（V/W）
图 1 液料比对垂枝红千层精油提取率的影响
表 1 正交试验因素水平
水平
1
2
3
A 浸泡时间（h）
0.5
1.0
1.5
B 提取时间（h）
0.5
1.0
1.5
C 微波功率（W）
200
250
300
胞菌（Pseudomonas aeruginosa）ATCC27853、大肠埃希氏
菌 （Escherichia coli）ATCC25922、 肺炎克雷伯氏菌
（Klebsiella pneumoniae）CMCC46117、 乙型副伤寒沙门
氏菌 （Salmonella paratyphoid B）CMCC50094 均由杭州
天和微生物试剂有限公司提供。
试验仪器：NIL07-3 型微波实验炉；SN-CJ-1F 型
单人双面净化工作台（苏州净化设备有限公司）；MGC-
250BP-2 型培养箱 （上海一恒科技有限公司 ）；KQ-
800TDV 型高频数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有
限公司）。
MH 琼脂、MH 肉汤、营养肉汤以及 1%TTC 无菌的
溶液购自广东环凯微生物科技有限公司。
1.2 试验方法
1.2.1 样品的采集与处理 采集垂枝红千层枝条，剥
取嫩叶，存于密封袋中，低温遮光保存备用。
1.2.2 垂枝红千层精油的提取 [10] 称取垂枝红千层嫩
叶 25 g，置于蒸馏瓶中，加适量蒸馏水，放入微波实验
炉中，连接挥发油提取器及冷凝管，设定微波功率与提
取时间。 蒸馏瓶内的溶液发生沸腾时，混合蒸汽被快速
冷凝，由于精油与水不互容，分层出现（精油在上层，水
在下层）， 当水层液面高于挥发油接收管另一端时，水
溶液会自动回流到蒸馏瓶中，反复蒸馏。 提取完毕静置
冷却，用青霉素瓶收集精油，称重，密封遮光 4℃保存备
用。 计算精油提取率：
精油提取率（%）=A/B×100
式中，A为精油的质量，B为嫩叶的质量。
1.2.3 单因素试验 在其他条件一致的情况下， 分别
考察液料比 （V/W，6:1、7:1、8:1、9:1、10:1）、 微波功率
（200、250、300、350、400 W）、提取时间（0.5、1.0、1.5、2.0
h）和浸泡时间（0、1、2、4、10 h）对精油提取率的影响。
1.2.4 正交试验[11] 根据单因素试验结果，设计 L9（34）
正交试验优化提取工艺条件（表 1）。使用正交试验助手
软件对试验数据进行处理和统计分析。
1.2.5 抑菌圈的测定[12] 采用纸片扩散法测定抑菌圈。
取供试菌的 MH肉汤培养液稀释至 0.5 麦氏比浊度，取
0.1 mL 菌液涂布于制备好的 MH 琼脂表面， 并用镊子
贴上药物纸片，倒置于 37℃恒温箱培养 24 h，用游标卡
尺测定抑菌圈直径。 设置溶剂对照和阳性对照（四环素
药敏纸片），重复 3次。
1.2.6 MIC 与 MBC 的测定 [13] 采用微孔板二倍稀释
法测定 MIC 与 MBC。 取 96 孔细胞培养板， 每孔加入
50 μL的营养肉汤 （已加入适量乳化剂吐温 80）， 第 1
排微孔加入 50 μL 精油（0.5 g/mL），随后吸走 50 μL 加
到第 2个孔中，混匀后又从第 2孔吸走 50 μL 加到第 3
孔，以此类推，加至最后 1 个孔，从最后 1 孔吸 50 μL
弃去 。 获得精油的 2 倍稀释梯度 （0.2500、0.1250、
0.0625 g/mL、……）。
取 5 mL 麦氏比浊度的菌悬液， 迅速加入 200 μL
1% TTC 无菌溶液。 在上述 96 孔板中每孔加入 50 μL
含 TTC 的菌悬液，使各孔的总液量为 100 μL。 将培养
板密封、 遮光包扎后置于 37℃恒温箱培养，18~24 h 后
取出肉眼观察各个微孔的颜色变化。 培养液显红色则
有细菌生长， 以无红色显示的最低药物浓度判定为
MIC。 每次试验重复 3次，设置肉汤对照、精油对照、菌
液对照和吐温 80对照。
MIC 结果判读后，用无菌圆头牙签蘸取 96 孔板的
培养液按顺序点接于 MH 琼脂平板上， 倒置于 37℃恒
温箱培养 16~24 h 后取出， 以平板上无菌落生长的最
低药物浓度判定为 MBC。
2 结果与分析
2.1 微波水蒸馏提取垂枝红千层精油的单因素试验结
果
2.1.1 液料比对提取率的影响 在其他条件固定 （功
率 250 W、提取时间 1.0 h、浸泡时间 1.0 h）的情况下，
考察液料比对提取率的影响。 图 1显示，当液料比为 6∶
1 时，精油提取率较低；当液料比为 8∶1 时，精油的提取
率最高；继续增大液料比，精油的提取率下降；而液料
比过小，可能导致蒸馏不彻底，提取率降低。 微波的加
热作用是通过水分子高速旋转而使温度上升， 所以适
量的水分子有助于叶片中细胞破裂和物质溶出。 但水
分过多，反而延长了升温时间，可能导致提取率下降。
2.1.2 微波功率对提取率的影响 前期试验表明，微
波功率小于 200 W 时，由于温度太低，不能提取出精
114
C M Y K
表 2 微波水蒸馏法提取垂枝红千层精油的正交试验结果
试验号
1
2
3
4
5
6
7
8
9
k1
k2
k3
R
A 提取时间
（h）
0.5
0.5
0.5
1.0
1.0
1.0
1.5
1.5
1.5
0.654
0.695
0.606
0.089
B 浸泡时间
（h）
0.5
1.0
1.5
0.5
1.0
1.5
0.5
1.0
1.5
0.607
0.681
0.667
0.074
C 微波功率
（W）
200
250
300
300
200
250
250
300
200
0.61
0.723
0.623
0.113
提取率
（%）
0.578
0.737
0.648
0.603
0.690
0.793
0.640
0.617
0.561
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0
提
取
率
（ %
）
0 1 2 4 10
浸泡时间（h）
图 4 浸泡时间对垂枝红千层精油提取率的影响
0.70
0.65
0.60
0.55
0.50
0.45
提
取
率
（ %
）
0.5 1.0 1.5 2.0
提取时间（h）
图 3 提取时间对垂枝红千层精油提取率的影响
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0
提
取
率
（ %
）
200 250 300 350 400
微波功率（W）
图 2 微波功率对垂枝红千层精油提取率的影响
油。因此从 200 W 起设置功率。在其他条件（液料比 8∶
1、提取时间 1.0 h、浸泡时间 1.0 h）相同的情况下，微
波功率对提取率的影响如图 2 所示。 当功率为 200 W
或 250 W 时，提取率较高；功率升至 300 W 时，提取率
骤然下降， 且在 350、400 W 时仍然维持较低的提取
率。 微波通过对植物细胞内极性物质的加热，使温度
迅速升高，加速了精油与亲和组分的分离。 但随着微
波功率过大，精油的提取率有相当程度的下降。 因为
微波功率过大，温度过高，可能导致部分精油成分迅
速挥发或氧化分解 [10]。 因此，微波功率为 250 W 时，精
油提取率最高。
2.1.3 提取时间对提取率的影响 固定液料比 8∶1、功
率 250 W、浸泡时间 1.0 h，考察提取时间对精油提取率
的影响，结果见图 3。在一定范围内，随着提取时间的延
长，精油的提取率不断增加。 当提取时间为 1.5 h 时，精
油提取率最高，提取时间超过 1.5 h，精油的提取率较平
缓地下降。 原因可能是当提取时间过短，不利于精油从
叶片充分释放出来， 而提取时间过长又会导致精油因
挥发而损失[11]。
2.1.4 浸泡时间对提取率的影响 在其他提取条件相
同（液料比 8∶1、功率 250 W、提取时间 1.0 h）时，考察浸
泡时间对精油提取率的影响（图 4）。 图 4 显示，浸泡时
间为 1.0 h 时，提取率最高；浸泡时间超过 1.0 h，精油
提取率持续下降。 短时间浸泡使叶片吸涨水分，有助于
微波加热和精油溢出， 但浸泡时间过长可能导致精油
组分的水合或挥发。
2.2 微波水蒸馏提取垂枝红千层精油的正交试验
单因素试验结果显示，浸泡时间、微波功率和提取
时间对垂枝红千层精油提取率的影响较大， 而液料比
对提取率的影响较小，故选择浸泡时间、微波功率和提
取时间 3个因素各 3个水平，使用正交表 L9（34）进行正
交试验。 从表 2 可以看出，各因素的影响顺序为 C>A>
B，即影响微波辅助水蒸馏法提取垂枝红千层精油的最
大因素是微波功率，其次是提取时间，浸泡时间的影响
最小。 最优水平组合为 6号试验处理 A2B3C2，即提取时
间 1.0 h、浸泡时间 1.5 h、提取功率 250 W，此时提取率
为 0.793%。
2.3 垂枝红千层精油的抗菌活性研究
2.3.1 精油对 7 种受试菌的抑菌圈测定结果 从表 3
可以看出，垂枝红千层精油对 3 株革兰氏阳性菌（金黄
色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、枯草芽胞杆菌）和 4 株革
兰氏阴性菌（铜绿假单胞菌、大肠埃希氏菌、肺炎克雷
伯氏菌、乙型副伤寒沙门氏菌）均有明显的抑菌圈，说
明垂枝红千层精油具有广谱的抑菌作用。 方差分析结
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