全 文 ：植物科学学报 ２０１５，３３（６）：８４７～８５４
Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｊｏｕｒｎａｌ
ＤＯＩ：１０．１１９１３／ＰＳＪ．２０９５－０８３７．２０１５．６０８４７
基于新一代高通量测序技术开发巨人半边莲
Ｌｏｂｅｌｉａ ｄｅｃｋｅｎｉ 的ＳＳＲ标记
米 奇１，２，龙志成１，２，Ｍｕｃｈｕｋｕ Ｊｏｈｎ Ｋａｍａｕ１，２，陈进明１＊，王青锋１＊
（１．中国科学院武汉植物园，中国科学院水生植物与流域生态重点实验室，武汉４３００７４；２．中国科学院大学，北京１０００４９）
摘 要：为了开发东非半边莲属特有植物的微卫星分子标记（ＳＳＲ），本研究基于Ｉｌｕｍｉｎａ－ＨｉＳｅｑ ２０００测序平
台对巨人半边莲Ｌｏｂｅｌｉａ ｄｅｃｋｅｎｉｉ的基因组进行高通量测序。利用 ＭＩＳＡ软件对获得的基因组数据库进行搜
索与分析，共鉴别出５８ ９６６个ＳＳＲ位点，并利用Ｐｒｉｍｅｒ软件成功设计出３５５８对特异性的ＳＳＲ引物。利用
Ｌ．ｄｅｃｋｅｎｉｉ ３个居群的６个样品对随机挑选的４０对ＳＳＲ引物进行扩增效率检验，发现有３２对重复性好且
可扩增出清晰条带。利用筛选出的３２对ＳＳＲ引物对来自肯尼亚山居群的２４株个体进行ＰＣＲ扩增并采用
荧光分型技术检测多态性，结果显示有１４对可扩增出稳定的多态性条带，共有８６个等位基因，各ＳＳＲ位
点的等位基因数（ＮＡ）为４～９个，观测杂合度（Ｈｏ）和期望杂合度（Ｈｅ）分别为０．０００～１．０００和０．６２５～
０．８５４。本研究结果表明，通过高通量测序技术开发东非特有植物巨人半边莲的ＳＳＲ标记是一种简单而高
效的途径，这些新的ＳＳＲ分子标记为巨人半边莲的居群遗传多样性、遗传结构以及对其开展保护生物学研
究提供了工具。
关键词：东非特有植物；半边莲属；高通量测序；ＳＳＲ标记
中图分类号：Ｑ３４６ 文献标识码：Ａ 文章编号：２０９５－０８３７（２０１５）０６－０８４７－０８
收稿日期：２０１５－０５－２９，退修日期：２０１５－０７－０２。
基金项目：国家自然科学基金项目（３１５７０２２０）；中国科学院海外拓展工程项目（２３Ｙ３２３７７１Ｗ０７７７）。
作者简介：米奇（１９９０－），女，硕士研究生，研究方向为植物居群遗传学（Ｅ－ｍａｉｌ：４１８４６８３７８＠ｑｑ．ｃｏｍ）。
＊ 通讯作者（Ａｕｔｈｏｒ ｆｏｒ ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｅｎｃｅ．Ｅ－ｍａｉｌ：ｊｍｃｈｅｎ＠ｗｂｇｃａｓ．ｃｎ；Ｅ－ｍａｉｌ：ｑｆｗａｎｇ＠ｗｂｇｃａｓ．ｃｎ）。
Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ＳＳＲ Ｍａｒｋｅｒｓ ｉｎ Ｇｉａｎｔ Ｌｏｂｅｌｉａ（Ｌｏｂｅｌｉａ ｄｅｃｋｅｎｉ）
Ｂａｓｅｄ ｏｎ Ｎｅｘｔ－ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ
ＭＩ Ｑｉ １，２，ＬＯＮＧ Ｚｈｉ－Ｃｈｅｎｇ１，２，ＭＵＣＨＵＫＵ Ｊｏｈｎ Ｋａｍａｕ１，２，
ＣＨＥＮ Ｊｉｎ－Ｍｉｎｇ１＊，ＷＡＮＧ Ｑｉｎｇ－Ｆｅｎｇ１＊
（１．Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ａｑｕａｔｉｃ Ｂｏｔａｎｙ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｓｈｅｄ Ｅｃｏｌｏｇｙ，Ｗｕｈａｎ Ｂｏｔａｎｉｃａｌ Ｇａｒｄｅｎｓ，Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ
ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｗｕｈａｎ ４３００７４，Ｃｈｉｎａ；２．Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｅｉｊｉｎｇ １０００４９，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｏ ｄｅｖｅｌｏｐ ｃｏ－ｄｏｍｉｎａｎｔ ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｉｔｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍａｒｋｅｒｓ （ＳＳＲｓ）ｆｏｒ ｓｔｕｄｙｉｎｇ
ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎ ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｏｆ ｔｈｅ ｇｉａｎｔ ｌｏｂｅｌｉａ ｅｎｄｅｍｉｃ ｔｏ ｅａｓｔ Ａｆｒｉｃａ，ｗｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｄ ｔｈｅ ｇｅｎｏｍｅ ｏｆ ｔｈｅ
ｇｉａｎｔ ｌｏｂｅｌｉａ，Ｌｏｂｅｌｉａ ｄｅｃｋｅｎｉ，ｕｓｉｎｇ ｎｅｘｔ－ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．Ｕｓｉｎｇ
ｔｈｅ ＭＩＳＡ ｐｒｏｇｒａｍ，ｗｅ ａｃｑｕｉｒｅｄ ａ ｔｏｔａｌ ｏｆ ５８ ９６６ ＳＳＲｓ，ｆｒｏｍ ｗｈｉｃｈ ｗｅ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ３５５８ ＳＳＲ ｐｒｉｍｅｒ
ｐａｉｒｓ ｕｓｉｎｇ Ｐｒｉｍｅｒ ｓｏｆｔｗａｒｅ．Ｗｅ ｓｅｌｅｃｔｅｄ ４０ ｐｒｉｍｅｒ ｐａｉｒｓ ａｔ ｒａｎｄｏｍ ｔｏ ｅｖａｌｕａｔｅ ｔｈｅｉｒ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ
ａｃｒｏｓｓ ｓｉｘ ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｓ ｆｒｏｍ ｔｈｒｅｅ Ｌ．ｄｅｃｋｅｎｉ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ（ｔｗｏ ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｓ ｐｅｒ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）．Ｔｈｉｒｔｙ－
ｔｗｏ ｍａｒｋｅｒｓ ｗｅｒｅ ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｙ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ，ｙｉｅｌｄｉｎｇ ｃｌｅａｒ ａｎｄ ｄｉｓｃｅｒｎｉｂｌｅ ｂａｎｄｓ．Ｕｓｉｎｇ２４ Ｌ．ｄｅｃｋｅｎｉ
ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｋｅｎｙａｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ，ｗｅ ｔｅｓｔｅｄ ｔｈｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ ｏｆ ｔｈｅ ３２ ＳＳＲ ｍａｒｋｅｒｓ
ａｎｄ ｆｏｕｎｄ ｔｈａｔ １４ ｗｅｒｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ．Ｕｓｉｎｇ ｔｈｅｓｅ １４ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ ＳＳＲ ｍａｒｋｅｒｓ，ｗｅ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ａ ｔｏｔａｌ
ｏｆ ８６ ａｌｅｌｅｓ．Ｔｈｅ ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ ａｌｅｌｅｓ ｐｅｒ ｌｏｃｕｓ ｒａｎｇｅｄ ｆｒｏｍ ｆｏｕｒ ｔｏ ｎｉｎｅ．Ｏｂｓｅｒｖｅｄ ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｓｉｔｙ
（Ｈｏ）ａｎｄ ｅｘｐｅｃｔｅｄ ｖａｌｕｅ （Ｈｅ）ｐｅｒ ｌｏｃｕｓ ｖａｒｉｅｄ ｆｒｏｍ ０．０００ｔｏ １．０００ ａｎｄ ０．６２５ ｔｏ ０．８５４，
ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｏｕｒ ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ＳＳＲ ｍａｒｋｅｒｓ ｆｒｏｍ ｇｅｎｏｍｉｃ ｄａｔａ ｂｙ ｈｉｇｈ－
ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｉｎ ｔｈｅ ｇｉａｎｔ ｌｏｂｅｌｉａ ｗａｓ ｖａｌｕａｂｌｅ ａｎｄ ｅｆｅｃｔｉｖｅ．Ｔｈｅｓｅ ｎｅｗｌｙ ｇｅｎｅｒａｔｅｄ ＳＳＲ
ｍａｒｋｅｒｓ ｗｉｌ ｐｒｏｖｉｄｅ ｎｏｖｅｌ ｔｏｏｌｓ ｆｏｒ ｓｔｕｄｙｉｎｇ ｇｅｎｅｔｉｃ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ，ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ｇｅｎｅｔｉｃ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ
ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎ ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｇｉａｎｔ ｌｏｂｅｌｉａｓ ｉｎ ｅａｓｔ Ａｆｒｉｃａ．
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：Ｅａｓｔ Ａｆｒｉｃａ ｅｎｄｅｍｉｃ ｐｌａｎｔ；Ｇｉａｎｔ ｌｏｂｅｌｉａ；Ｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ；ＳＳＲ ｍａｒｋｅｒｓ
半边莲属（Ｌｏｂｅｌｉａ Ｌ．）为桔梗科（Ｃａｍｐａｎｕ－
ｌａｃｅａｅ）草本或亚灌木植物，全世界约３８０种，主要
分布于热带及亚热带区域［１］。巨人半边莲（ｇｉａｎｔ
ｌｏｂｅｌｉａ）是分布于东非高原的半边莲属特有植物，
共有２１种［１，２］。巨人半边莲为亚灌木，具高大花
序，叶片互生并呈莲座状排列，是植物进化生物
学领域中用来研究趋同进化及适应辐射的典型代
表材料［１，２］。
近年来，气候变化、人类农业活动的影响等
使巨人半边莲在东非的生境遭到较大破坏，该类
植物的分布区范围也在逐渐缩小，其中一些物种
（如Ｌ．ａｂｅｒｄｅｒｉｃａ）已被世界自然保护联盟（ＩＵＣＮ）
列为濒危物种［３］，因此开展巨人半边莲的居群遗
传学研究对于科学地保育这些珍稀植物具有重要
的指导意义。目前，关于采用分子标记开展巨人
半边莲的保护遗传学研究较少，如Ｋｅｂｅｄｅ等采用
ＡＦＬＰ分子标记探讨了分布范围最广的巨人半边
莲Ｌ．ｇｉｂｅｒｒｏａ的居群遗传结构及谱系地理学［４］；
Ｇｅｌｅｔａ和Ｂｒｙｎｇｅｌｓｓｏｎ采用ＩＳＳＲ分子标记分析了
分布在埃塞俄比亚境内的巨人半边莲Ｌ．ｒｈｙｎｃｈｏ－
ｐｅｔａｌｕｍ的遗传多样性［５］。这些居群遗传学研究结
果为少数巨人半边莲物种的保护措施制定提供了
依据，但由于其采用的分子标记在揭示巨人半边
莲的适应性遗传变异方面存在很大局限性，不能
较好地满足保护遗传学深入研究的需要，故亟需
开发适合研究巨人半边莲适应性遗传变异的共显
性分子标记，如微卫星分子标记（ｓｉｍｐｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ
ｒｅｐｅａｔｓ，ＳＳＲ）。
本研究拟采用新一代高通量测序技术对分布于
东非的特有植物巨人半边莲Ｌ．ｄｅｃｋｅｎｉｉ进行ＳＳＲ
分子标记的开发，以期为东非特有半边莲属植物的
居群适应性遗传变异分析及其保护生物学提供有效
工具。
１ 材料与方法
１．１ 植物材料
巨人半边莲Ｌ．ｄｅｃｋｅｎｉｉ居群材料分别采集于
东非肯尼亚山、阿布代尔山和埃贡山，其中用以
高通量测序的１个样品来自于东非肯尼亚山居群
（０°１０．１′Ｓ，３７°１３．７′Ｅ；海拔３４４０ｍ）；用于检验
ＳＳＲ引物扩增效率的６个样品分别来自东非肯尼
亚山居群（０°１０．１′Ｓ，３７°１３．７′Ｅ；海拔３４４０ｍ）、
阿布代尔山居群（０°２５．８′Ｓ，３６°４３．５′Ｅ；海拔
３０５０ｍ）及埃贡山居群（１°６．１′Ｓ，３４°３７′Ｅ；海拔
３６７０ｍ），每居群２个样品；用于检验引物多态性
的材料为肯尼亚山居群（０°３．６′Ｓ，３７°１７．６′Ｅ；海
拔３５８０ｍ）的２４株个体。取新鲜幼嫩的叶片放入置
有干燥剂（变色硅胶）的取样袋中迅速干燥、备用。
１．２ ＤＮＡ提取
利用Ｅｚｕｐ柱式植物基因组ＤＮＡ抽提试剂盒
（上海生工生物技术服务公司）提取巨人半边莲Ｌ．
ｄｅｃｋｅｎｉｉ干燥叶片的ＤＮＡ，并采用Ｎａｎｏｄｒｏｐ ２０００
（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）和 Ｑｕｂｉｔ ２．０（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏ－
ｇｉｅｓ）对ＤＮＡ的纯度和浓度进行检测。
１．３ 高通量测序与序列组装分析
对来自东非肯尼亚山的巨人半边莲Ｌ．ｄｅｃｋｅ－
ｎｉｉ居群的１个样品进行ＤＮＡ文库构建：使用Ｃｏ－
ｖａｒｉｓ Ｓ２２０超声波破碎仪（Ｃｏｖａｒｉｓ）将基因组ＤＮＡ
随机打断，再经末端修复、加Ａ尾、加测序接头、
纯化、ＰＣＲ扩增等步骤完成 ＤＮＡ 文库制备。然
后，使用Ａｇｉｌｅｎｔ ２１００生物分析仪（Ａｇｉｌｅｎｔ）对文
库的插入片段（大小为１００ｂｐ）进行检测，当插入
片段符合预期扩增产物大小后，送往华中农业大
学公共测序平台采用Ｉｌｕｍｉｎａ－ＨｉＳｅｑ ２０００测序系
统对 ＤＮＡ 文库进行ＰＥ１００测序（Ｐａｉｒｅｄ－Ｅｎｄ ｓｅ－
ｑｕｅｎｃｉｎｇ）。测序完成后，使用ＦＡＳＴＸ－ｔｏｏｌｋｉｔ（ｈｔ－
ｔｐ：／ｈａｎｎｏｎｌａｂ．ｃｓｈｌ．ｅｄｕ／ｆａｓｔｘ ＿ｔｏｏｌｋｉｔ／ｉｎｄｅｘ．
ｈｔｍｌ）对获得的高通量测序数据（共 １０Ｇｒａｗ
ｒｅａｄｓ）进行质量控制，即将准确度低于９９．５％且
长度小于２５的序列过滤后，利用ＳＯＡＰｄｅｎｏｖｏ软
件进行序列的拼接和组装（Ｋｍｅｒ值设为４３）［６］。
８４８ 植 物 科 学 学 报 第３３卷
１．４ ＳＳＲ位点的开发与引物设计
对高通量测序的原始数据进行质控后共获得
９．６Ｇｃｌｅａｎ ｒｅａｄｓ，经拼接后得到的最长序列片段
为５５７３ｂｐ，ｃｏｎｔｉｇ的Ｎ５０为１５９ｂｐ，平均覆盖度
为３７Ｘ。对拼接后所获得的高通量测序数据，首先
利用 ＭＩＳＡ （ＭｉｃｒｏＳａｔｅｌｉｔｅ，ｈｔｔｐ：／ｐｇｒｃ．ｉｐｋ＿
ｇａｔｅｒｓｌｅｂｅｎ．ｄｅ／ｍｉｓａ／）软件搜寻含１～６个ＳＳＲ重
复基元的区间，本研究中ＳＳＲ重复基元的查找标
准为单核苷酸重复次数 ≥１０，二核苷酸重复次数
≥６，三核苷酸重复次数 ≥５，四核苷酸重复次数
≥５，五核苷酸重复次数 ≥４，六核苷酸重复次数
≥４，复合型ＳＳＲ整体长度不小于２４ｂｐ；然后，采
用 Ｐｒｉｍｅｒ ３．０（ｈｔｔｐ：／ｂｉｏｔｏｏｌｓ．ｕｍａｓｓｍｅｄ．ｅｄｕ／ｂｉｏ－
ａｐｐｓ／ｐｒｉｍｅｒ ３＿ｗｗｗ．ｃｇｉ）对鉴定出的含有ＳＳＲ重复
基元的序列片段进行引物设计，并要求①引物长度
１５～３ ０ｂｐ，最适长度２０ｂｐ；②退火温度５５℃～
６５℃，最适退火温度６０℃；③ＰＣＲ 产物长度为
１００～２８０ｂｐ，最适长度２５０ｂｐ；④ ＧＣ含量４０％
～６０％，最适 ＧＣ含量为５０％［７］。依据此设计原
则，对１１８６条包含ＳＳＲ位点的高质量序列共设计
出３５５８对引物。每个ＳＳＲ位点至少设计３对候选
引物，以用于巨人半边莲居群不同个体间的多态性
检测。
１．５ ＳＳＲ引物初步筛选
随机挑选４０对基于含有不同重复基元的区间
设计的ＳＳＲ引物（编号ｌｏｂｅｌｓｓｒ１－４０），并由北京擎
科新业生物技术公司进行引物序列合成；然后，分
别从３个Ｌ．ｄｅｃｋｅｎｉｉ居群中各随机选取２个个体，
对合成的４０对ＳＳＲ引物进行扩增效率检验；最
后，对来自肯尼亚山巨人半边莲居群的２４株个体
进行引物的多态性分析。
ＰＣＲ反应体系为２５μＬ，包含３０ｎｇ基因组
ＤＮＡ模板、０．５ｍｍｏｌ／Ｌ ｄＮＴＰｓ ０．５μＬ、１ＵＴａｑ
ＤＮＡ聚合酶０．２５μＬ、０．１μｍｏｌ／Ｌ正、反向引物各
０．５μＬ、１０×Ｔａｑ缓冲液（主要成分为１０ｍｍｏｌ／Ｌ
Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ ８．３）、１．５ｍｍｏｌ／Ｌ ＭｇＣｌ２、５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＫＣｌ）２．５μＬ。ＰＣＲ扩增在ＡＢＩ ２７２０（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉ－
ｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＵＳＡ）ＰＣＲ仪上进行，其反应程序设置
为：９４℃预变性５ｍｉｎ；９４℃变性３５ｓ，５８℃ ～
６２℃退火３０ｓ（退火温度取决于引物的长度、碱基
组成等），７２℃延伸３０ｓ，３５个循环；最后７２℃延
伸１０ｍｉｎ。ＰＣＲ扩增产物于４℃低温条件下保存。
采用２％琼脂糖凝胶对ＰＣＲ扩增产物进行电泳
检测，并在紫外灯下观察、拍照。然后，选取扩增
条带清晰、重复性好的引物并在其上游引物的５’端
标记荧光基团ＦＡＭ（６－ｃａｒｂｏｘｙ－ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）。ＳＳＲ荧
光引物由北京擎科新业生物技术公司合成，并对来
自肯尼亚山巨人半边莲居群的２４株个体进行ＰＣＲ
扩增，产物经２％琼脂糖凝胶电泳检测后送往北京
擎科新业生物技术公司，在 ＡＢＩ ３７３０自动测序仪
（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＵＳＡ）上进行荧光分型。
１．６ 数据分析
采用软件 ＧｅｎｅＭａｒｋｅｒ Ｖ１．５（ｈｔｔｐ：／ｗｗｗ．
ｓｏｆｔｇｅｎｅｔｉｃｓ．ｃｏｍ／ＧｅｎｅＭａｒｋｅｒ．ｈｔｍｌ）打开荧光分
型数据的原始文件，并根据峰图统计记录每个样
品每对引物的条带大小，每对引物每个样品均记
录２个条带的片段大小（Ｌ．ｄｅｃｋｅｎｉｉ为二倍体），
其中只有一个扩增片段的纯合子将其谱带大小记
录２次；统计结果整理完成后，利用软件ＧｅｎＡ－
ｌＥｘ ６．５０１ （ｈｔｔｐ：／ｂｉｏｌｏｇｙ－ａｓｓｅｔｓ．ａｎｕ．ｅｄｕ．ａｕ／
ＧｅｎＡｌＥｘ／Ｄｏｗｎｌｏａｄ．ｈｔｍｌ）计算每一个ＳＳＲ位点的
等位基因数（ＮＡ）、观测杂合度（Ｈｏ）、预期杂合度
（Ｈｅ）和固定指数（ＦＩＳ）［８］。
２ 结果与分析
２．１ 巨人半边莲中ＳＳＲ的分布及频率
利用 ＭＩＳＡ软件在巨人半边莲Ｌ．ｄｅｃｋｅｎｉｉ的
高通量测序数据库中搜索含１～６个ＳＳＲ重复基
元的区间，共获得５８ ９６６个位点，其中单一重复
类型（单个重复基元）ＳＳＲ有５８ ３７６个（９９．０％），
而复合型（多个重复基元）ＳＳＲ有５９０个（１．０％）。
重复基元分析显示（表１），分布最多的重复基元为
单核苷酸重复，占４７．６２％；其次是二核苷酸重复
（占３６．２２％）、四核苷酸重复（占６．９２％）、六核
苷 酸 重 复 （占 ５．２４％）、三 核 苷 酸 重 复 （占
２．７７％）；分 布 最 少 的 是 五 核 苷 酸 重 复，占
０．２３％。ＳＳＲ重复基元类型及发生频率的分析结
果显示（表２），巨人半边莲Ｌ．ｄｅｃｋｅｎｉｉ基因组序
列片段中共发现４种二核苷酸重复基元和１０种三
核苷酸重复基元，且在出现的二核苷酸重复中，
９４８ 第６期 米 奇等：基于新一代高通量测序技术开发巨人半边莲Ｌｏｂｅｌｉａ ｄｅｃｋｅｎｉｉ的ＳＳＲ标记
ＡＣ／ＧＴ所占比例最高，为１２．９４％，ＣＧ／ＣＧ 最
少，为０．０１％；三核苷酸重复中，ＡＡＣ／ＧＴＴ所
占比例最高，为 ０．６３％。此外，在 Ｌ．ｄｅｃｋｅｎｉｉ
ＳＳＲ重复基元中 ＣＣＧ／ＣＧＧ 发生频率最低，为
０．００３％。
２．２ ＳＳＲ位点多态性
利用巨人半边莲Ｌ．ｄｅｃｋｅｎｉｉ ３个居群的６个
样品对随机挑选的４０对ＳＳＲ引物进行筛选，发现
共有３２对（表３）可成功扩增出清晰条带，即引物
有效扩增率为８０％。利用筛选出的３２对ＳＳＲ引物
对来自肯尼亚山居群的２４株个体进行ＰＣＲ扩增，
结果显示有１４对可扩增出稳定的多态性条带，共
有８６个等位基因（表４），各ＳＳＲ位点的等位基因
（ＮＡ）数为４～９个，期望杂合度（Ｈｅ）和观测杂合
度（Ｈｏ）的范围分别为０．００～１．００和０．６２５～
０．８５４；Ｗｒｉｇｈｔ’ｓ指数（ＦＩＳ）中，有９个为正值，５
个为负值，表明该种群纯合度较高（表４）。
表１ 巨人半边莲ＳＳＲ重复基元分布的类型和数量
Ｔａｂｌｅ １ Ｔｙｐｅ ａｎｄ ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ ＳＳＲ ｒｅｐｅａｔ ｍｏｔｉｆｓ ｉｎ Ｌｏｂｅｌｉａｄｅｃｋｅｎｉ
重复基元长度
Ｒｅｐｅａｔ ｍｏｔｉｆ ｌｅｎｇｔｈ
重复次数 Ｒｅｐｅａｔ ｎｕｍｂｅｒｓ
４ ５ ６ ７ ８ ９ １０ １１ ≥１２
合计
Ｔｏｔａｌ
百分比
（％）
单核苷酸重复
Ｍｏｎｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ０ ０ ０ ０ ０ ０ １５３３２ ４９０５ ７８４５ ２８０８２ ４７．６２
二核苷酸重复
Ｄｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ０ ０ １２５３８ ３８４７ １４６２ ６８２ ２５０ １１９ ２４５８ ２１３５６ ３６．２２
三核苷酸重复
Ｔｒｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ０ ８６１ １９５ １０８ ３３ １９ ２４ ２７ ３６７ １６３４ ２．７７
四核苷酸重复
Ｑｕａｄｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ０ ２９５５ ６４８ １１２ ４５ ２３ ４８ １５３ ４０７９ ６．９２
五核苷酸重复
Ｐｅｎｔａｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ０ ８８ １２ ０ ０ ０ ０ ２１ １２ １３３ ０．２３
六核苷酸重复
Ｈｅｘａｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ０ ９４７ ５３０ ５３１ ８７９ １６４ ０ ０ ４１ ３０９２ ５．２４
总计Ｔｏｔａｌ ０ ４８５１ １３９２３ ４５９８ ２４６９ ９１０ １５６２９ ５１２０ １０８７６
百分比（％） ８．２３ ２３．６１ ７．８ ４．１９ １．５４ ２６．５１ ８．６８ １８．４５
注：单、二、三、四、五、六核苷酸重复类型ＳＳＲ的最小重复次数标准分别为１０、６、５、５、４、４。
Ｎｏｔｅ：Ｍｏｎｏ－，ｄｉ－，ｔｒｉ－，ｑｕａｄ－，ｐｅｎｔａ－ａｎｄ ｈｅｘａ－ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｒｅｐｅａｔｓ ｈａｄ ａ ｍｉｎｉｍｕｍ ｏｆ ｔｅｎ，ｓｉｘ，ｆｉｖｅ，ｆｉｖｅ，ｆｏｕｒ ａｎｄ ｆｏｕｒ ｓｕｂｕｎｉｔｓ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．
表２ 巨人半边莲基因组序列片段中ＳＳＲ二、三碱基重复基元的类型及出现频率
Ｔａｂｌｅ ２ Ｄｉ－ａｎｄ ｔｒｉ－ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ＳＳＲ ｒｅｐｅａｔ ｍｏｔｉｆｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｆｒｅｑｕｅｎｃｉｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｇｅｎｏｍｅ ｏｆ Ｌｏｂｅｌｉａ ｄｅｃｋｅｎｉ
重复基元类型
Ｒｅｐｅａｔ ｍｏｔｉｆ
重复次数 Ｒｅｐｅａｔ ｎｕｍｂｅｒｓ
５ ６ ７ ８ ９ １０ １１ １２ ＞１２
合计
Ｔｏｔａｌ
频率（％）
Ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ
ＡＣ／ＧＴ ６４５３ ６９７ ２８３ ９０ ３２ ４１ １８ １８ ７６３２ １２．９４
ＡＧ／ＣＴ ３７８２ ２１０６ ９５７ ３８６ １２６ ９２ ４９ １０１ ７５９９ １２．８９
ＡＴ／ＴＡ ３４０８ １１７７ ４７１ ２４５ １３５ ２６ ２１ ２９５ ５７７８ ９．８
ＣＧ／ＧＣ ０ ７ ０ ０ ０ ０ ０ ０ ７ ０．０１
ＡＡＣ／ＧＴＴ １４５ １７ １８ １７ １７ １０ ２４ ８ １１４ ３７０ ０．６３
ＡＡＧ／ＣＴＴ ２４６ ５３ ２６ ２ ０ １０ ３ ９ ７ ３５６ ０．６
ＡＡＴ／ＡＴＴ ７５ ２６ ７ １０ ０ ３ ０ ０ ８ １２９ ０．２２
ＡＣＣ／ＧＧＴ １１７ ２ ２ ０ ０ ０ ０ ０ ０ １２１ ０．２１
ＡＣＧ／ＣＧＴ ５ ０ ０ ２ ０ ０ ０ ０ ０ ７ ０．０１
ＡＣＴ／ＡＧＴ ４２ ４ ８ ０ ０ ０ ０ ０ １２ ６６ ０．１１
ＡＧＣ／ＧＣＴ １４ ０ ０ ０ ０ ０ ０ ０ １ １５ ０．０３
ＡＧＧ／ＣＣＴ ２７ １８ ０ ０ ０ ０ ０ ０ ０ ４５ ０．０８
ＡＴＣ／ＧＡＴ ２３ １６ ３ ０ ０ ０ ０ ０ １０ ５２ ０．０９
ＣＣＧ／ＣＧＧ ０ ３ ０ ０ ０ ０ ０ ０ ０ ３ ０．０１
总计Ｔｏｔａｌ ６９４ １３７８８ ４０５８ １７５０ ７４７ ３２６ １９７ １１７ ５６６ ２２２４３
频率（％）
Ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ
１．１８ ２３．３８８ ６．８８８ ２．９７ １．２７ ０．５５ ０．３３ ０．２ ０．９６
０５８ 植 物 科 学 学 报 第３３卷
表３ 巨人半边莲中筛选出的３２对ＳＳＲ引物
Ｔａｂｌｅ ３ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ３２ ＳＳＲ ｐｒｉｍｅｒｓ ｏｆ Ｌ．ｄｅｃｋｅｎｉ
引物编号
Ｐｒｉｍｅｒ ｃｏｄｅ
引物序列
Ｐｒｉｍｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ
（５′－３′）
重复基元
Ｒｅｐｅａｔ ｍｏｔｉｆ
目标片段大小（ｂｐ）
Ｅｘｐｅｃｔｅｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ
ｐｒｏｄｕｃｔ
退火温度
Ｔａ（℃）
ＧｅｎＢａｎｋ
ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．
ｌｏｂｅｌｓｓｒ１
Ｆ：ＡＣＴＴＣＡＧＣＡＡＴＴＡＣＴＣＣＡＡＧＧＡＡ
Ｒ：ＧＡＧＡＴＴＴＣＣＴＣＣＣＴＡＧＣＴＴＣＣＣ
（ＣＴ）６ １０５ ６１ ＫＴ０３３４２５
ｌｏｂｅｌｓｓｒ２
Ｆ：ＧＧＡＧＧＡＡＣＴＧＡＡＡＴＡＡＣＡＡＧＧＧ
Ｒ：ＧＧＡＡＴＴＴＴＣＧＧＣＧＡＣＧＴＧ
（ＴＡ）６ １０６ ６２ ＫＴ０３３４２６
ｌｏｂｅｌｓｓｒ３
Ｆ：ＣＣＴＴＣＡＧＴＡＧＡＡＡＣＡＣＡＣＡＣＡＡＡ
Ｒ：ＧＧＡＡＡＡＣＴＣＡＣＡＡＧＡＡＡＡＡＣＣＣ
（ＧＡ）６ １０６ ５８ ＫＴ０３３４２７
ｌｏｂｅｌｓｓｒ５
Ｆ：ＣＡＴＴＣＡＴＴＣＧＴＴＣＡＴＴＣＡＴＴＣＧ
Ｒ：ＣＧＡＧＴＴＡＣＴＴＴＡＴＡＣＴＣＧＧＴＡＡＧＴＣＧＴ
（ＴＣＡＴ）５ １０７ ６０ ＫＴ０３３４２８
ｌｏｂｅｌｓｓｒ７
Ｆ：ＧＧＡＡＡＴＧＡＧＧＡＡＡＡＧＡＧＡＧＡＧＴＡＴＴＴ
Ｒ：ＧＡＧＣＧＴＴＴＣＧＡＣＧＧＡＧＡＴ
（ＣＴ）６ １０７ ５８ ＫＴ０３３４２９
ｌｏｂｅｌｓｓｒ８
Ｆ：ＧＡＧＡＧＣＧＡＴＣＣＴＣＣＣＧＴＡＴＣ
Ｒ：ＣＡＣＴＡＡＴＣＧＧＴＧＧＧＧＴＡＴＧＣ
（ＣＣＴ）６ １０７ ６１ ＫＴ０３３４３０
ｌｏｂｅｌｓｓｒ９
Ｆ：ＣＣＡＧＡＧＴＧＧＴＧＴＧＡＣＴＧＧＴＴ
Ｒ：ＴＴＧＣＴＧＡＴＧＡＡＧＧＴＣＡＧＣＴＡＣＴ
（ＴＧＡＴ）５ １０８ ５９ ＫＴ０３３４３１
ｌｏｂｅｌｓｓｒ１０
Ｆ：ＴＴＴＧＧＣＡＡＡＧＣＴＡＣＣＡＡＡＣＣ
Ｒ：ＧＧＧＧＡＧＴＡＴＴＴＡＡＡＧＧＧＡＧＣＣ
（ＴＣ）６ １０８ ６０ ＫＴ０３３４３２
ｌｏｂｅｌｓｓｒ１１
Ｆ：ＴＧＡＴＴＴＴＴＧＣＡＴＴＣＣＴＧＣＴＧ
Ｒ：ＴＡＣＣＡＡＣＡＣＣＣＧＧＴＴＡＣＴＣＧ
（ＡＴ）６ １０９ ６０ ＫＴ０３３４３３
ｌｏｂｅｌｓｓｒ１２
Ｆ：ＡＡＣＣＡＡＧＧＡＡＧＡＡＧＧＡＡＡＴＧＡ
Ｒ：ＴＴＣＣＴＴＧＣＣＴＴＧＴＴＴＡＧＴＴＴＣＡ
（ＣＴ）７ １０９ ５８ ＫＴ０３３４３４
ｌｏｂｅｌｓｓｒ１３
Ｆ：ＴＴＣＴＴＴＣＣＡＴＣＡＴＴＣＡＴＴＣＧＡＴ
Ｒ：ＡＡＣＡＴＧＡＧＣＡＴＡＴＴＡＴＣＧＡＧＴＴＡＣＴＴＴ
（ＴＣＡＴ）５ １１６ ５８ ＫＴ０３３４３５
ｌｏｂｅｌｓｓｒ１８
Ｆ：ＣＡＧＣＡＡＴＧＧＣＴＴＣＡＣＴＧＡＴＴ
Ｒ：ＴＣＣＣＡＴＣＡＡＴＧＴＣＡＡＴＧＧＡＧ
（ＧＡ）６ １２１ ５９ ＫＴ０３３４３６
ｌｏｂｅｌｓｓｒ１９
Ｆ：ＧＧＧＣＴＴＣＣＡＡＣＡＡＣＡＡＡＧＡ
Ｒ：ＣＴＴＣＴＣＣＡＴＴＧＣＧＡＣＣＴＣＣ
（ＡＣＡ）７ １２２ ５９ ＫＴ０３３４３７
ｌｏｂｅｌｓｓｒ２０
Ｆ：ＣＣＴＣＴＴＣＴＡＡＴＣＴＴＡＣＣＧＡＡＧＣＡ
Ｒ：ＧＡＡＡＴＧＣＴＡＣＴＧＣＧＧＡＡＴＴＧＡ
（ＴＡ）６ １２２ ６０ ＫＴ０３３４３８
ｌｏｂｅｌｓｓｒ２１
Ｆ：ＡＴＴＧＡＧＧＧＡＧＣＣＴＴＴＡＣＴＣＣ
Ｒ：ＧＣＧＡＡＴＴＴＴＧＧＣＡＡＧＧＴＴＴＡ
（ＡＧ）９ １０８ ６０ ＫＴ０３３４３９
ｌｏｂｅｌｓｓｒ２２
Ｆ：ＡＡＴＡＴＣＡＡＧＧＴＡＧＡＡＣＡＣＡＡＧＡＡＣＴＣＡ
Ｒ：ＡＧＴＡＣＴＡＣＣＡＡＴＴＣＡＴＴＴＣＡＣＴＣＣＡ
（ＣＴ）６ １０８ ５８ ＫＴ０３３４４０
ｌｏｂｅｌｓｓｒ２３
Ｆ：ＡＴＣＣＣＡＣＣＡＡＧＧＡＡＣＡＡＧＴＧ
Ｒ：ＴＣＣＣＴＡＴＴＴＣＣＴＴＣＣＣＴＴＴＧ
（ＣＴ）７ １１１ ５９ ＫＴ０３３４４１
ｌｏｂｅｌｓｓｒ２４
Ｆ：ＡＣＴＴＴＣＴＴＴＣＡＣＧＣＣＧＡＣＡＧ
Ｒ：ＧＣＧＣＣＧＧＡＧＴＡＡＧＧＴＡＡＡＣ
（ＧＡ）６ １１１ ６０ ＫＴ０３３４４２
ｌｏｂｅｌｓｓｒ２５
Ｆ：ＣＧＡＧＴＴＡＣＴＴＴＡＴＡＣＴＣＧＧＴＡＡＧＴＣＧＴ
Ｒ：ＣＧＡＴＣＡＡＴＣＡＴＴＣＡＴＴＣＡＴＴＣＡＴＴＴ
（ＧＡＡＴ）５ １１１ ６０ ＫＴ０３３４４３
ｌｏｂｅｌｓｓｒ２６
Ｆ：ＴＴＴＧＧＣＡＡＡＧＣＴＡＣＣＡＡＡＣＣ
Ｒ：ＧＧＧＧＡＧＴＡＴＴＴＡＡＡＧＧＧＡＧＣＣ
（ＴＣ）６ １１１ ６０ ＫＴ０３３４４４
ｌｏｂｅｌｓｓｒ２７
Ｆ：ＣＴＣＣＣＴＴＴＴＣＴＴＣＣＴＴＧＴＴＣＴＴＣ
Ｒ：ＴＣＴＣＣＡＧＣＡＡＴＴＣＴＣＣＡＡＧＧ
（ＡＧ）６ １１３ ６０ ＫＴ０３３４４５
ｌｏｂｅｌｓｓｒ２８
Ｆ：ＡＡＧＧＡＧＧＡＡＧＡＡＧＡＧＡＡＡＡＣＴＣＡＡ
Ｒ：ＣＴＡＣＣＴＴＡＴＴＴＣＴＧＴＡＡＣＡＣＣＡＡＡＣＴＴ
（ＣＴ）６ １１４ ６０ ＫＴ０３３４４６
１５８ 第６期 米 奇等：基于新一代高通量测序技术开发巨人半边莲Ｌｏｂｅｌｉａ ｄｅｃｋｅｎｉｉ的ＳＳＲ标记
续表３
引物编号
Ｐｒｉｍｅｒ ｃｏｄｅ
引物序列
Ｐｒｉｍｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ
（５′－３′）
重复基元
Ｒｅｐｅａｔ ｍｏｔｉｆ
目标片段大小（ｂｐ）
Ｅｘｐｅｃｔｅｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ
ｐｒｏｄｕｃｔ
退火温度
Ｔａ（°Ｃ）
ＧｅｎＢａｎｋ
ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．
ｌｏｂｅｌｓｓｒ２９
Ｆ：ＡＡＧＡＡＴＴＴＴＧＣＡＡＡＧＧＧＡＡＧＡＡ
Ｒ：ＴＴＡＣＴＣＴＣＡＴＴＴＧＴＧＴＴＡＣＴＴＡＣＣＴＧＧ
（ＴＣ）６ １１４ ５９ ＫＴ０３３４４７
ｌｏｂｅｌｓｓｒ３０
Ｆ：ＣＧＡＡＴＴＡＡＴＧＡＧＡＡＴＴＴＴＴＣＡＡＡＧＧ
Ｒ：ＣＣＴＣＣＡＴＡＴＴＣＴＴＡＣＣＴＧＧＧＣ
（ＴＣ）９ １１５ ６０ ＫＴ０３３４４８
ｌｏｂｅｌｓｓｒ３１
Ｆ：ＴＣＣＴＣＣＣＴＡＴＴＴＴＣＣＴＴＧＧＣ
Ｒ：ＣＣＡＣＣＡＡＧＡＡＣＡＧＣＡＣＡＡＧＡ
（ＡＧ）７ １１６ ６０ ＫＴ０３３４４９
ｌｏｂｅｌｓｓｒ３２
Ｆ：ＴＧＴＴＣＴＴＴＣＡＴＴＣＧＴＴＣＡＴＴＣＡＡ
Ｒ：ＴＣＧＡＧＴＴＡＣＴＴＴＡＴＡＣＴＣＧＧＴＡＡＧＴＣＴ
（ＴＴＣＡ）５ １１８ ５９ ＫＴ０３３４５０
ｌｏｂｅｌｓｓｒ３３
Ｆ：ＣＣＴＡＧＧＣＡＧＣＣＡＧＡＧＡＧＴＧＡ
Ｒ：ＧＡＡＣＧＧＴＣＧＡＡＴＴＴＡＡＡＣＧＡＡ
（ＧＡ）９ １１８ ６０ ＫＴ０３３４５１
ｌｏｂｅｌｓｓｒ３４
Ｆ：ＣＣＡＡＡＣＴＴＴＧＡＧＡＡＴＴＴＣＣＴＣＣ
Ｒ：ＣＣＡＧＣＡＡＴＴＣＴＣＴＴＣＡＡＣＡＡＡ
（ＧＡ）６ １２０ ５９ ＫＴ０３３４５２
ｌｏｂｅｌｓｓｒ３５
Ｆ：ＴＣＧＣＴＧＣＴＣＡＴＣＣＴＣＡＣＣ
Ｒ：ＡＴＴＴＴＴＧＧＡＴＧＣＧＴＧＧＡＴＧＴ
（ＣＴＧ）５ １２１ ６１ ＫＴ０３３４５３
ｌｏｂｅｌｓｓｒ３６
Ｆ：ＴＣＴＴＡＣＣＧＡＡＧＣＡＣＡＣＡＡＡＡＡ
Ｒ：ＡＧＧＡＡＴＧＡＡＧＣＴＣＧＧＣＡＡＴ
（ＡＴ）６ １２３ ５９ ＫＴ０３３４５４
ｌｏｂｅｌｓｓｒ３９
Ｆ：ＣＣＴＣＡＡＴＣＣＡＧＴＡＴＣＣＴＴＣＣＡ
Ｒ：ＴＧＡＧＣＡＧＴＴＴＣＡＡＴＣＡＡＴＡＣＡＴＣＣ
（ＡＴ）６ １３１ ６０ ＫＴ０３３４５５
ｌｏｂｅｌｓｓｒ４０
Ｆ：ＣＡＴＧＧＡＣＡＡＴＴＣＣＡＡＡＧＡＣＧ
Ｒ：ＣＴＣＴＴＧＧＴＴＧＣＣＴＴＧＡＴＴＧＣ
（ＡＡＧ）６ １３４ ６０ ＫＴ０３３４５６
表４ 多态性ＳＳＲ引物在巨人半边莲１个居群２４株个体中的扩增
Ｔａｂｌｅ ４ Ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ｐｒｉｍｅｒ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｉｎ ２４ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｓ ｆｒｏｍ ｏｎｅ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｌ．ｄｅｃｋｅｎｉ
引物编号
Ｐｒｉｍｅｒ ｃｏｄｅ
等位基因数
ＮＡ
观测杂合度
Ｈｏ
期望杂合度
Ｈｅ
Ｗｒｉｇｈｔ’ｓ固定指数
ＦＩＳ
ｌｏｂｅｌｓｓｒ１ ６ ０．７８４７ ０．５８３３ ０．２５７
ｌｏｂｅｌｓｓｒ５ ６ ０．７９５ ０．６２５ ０．２１４
ｌｏｂｅｌｓｓｒ８ ９ ０．８５４ ０．８７５ －０．０２４
ｌｏｂｅｌｓｓｒ１３ ６ ０．７４７ ０．９１７ －０．２２８
ｌｏｂｅｌｓｓｒ１８ ４ ０．６３９ ０．０００ １．０００
ｌｏｂｅｌｓｓｒ１９ ６ ０．７９５ ０．９１７ －０．１５３
ｌｏｂｅｌｓｓｒ２０ ５ ０．７３３ ０．０４２ ０．９４３
ｌｏｂｅｌｓｓｒ２１ ４ ０．６８１ ０．０００ １．０００
ｌｏｂｅｌｓｓｒ２４ ８ ０．８３０ １．０００ －０．２０５
ｌｏｂｅｌｓｓｒ２７ ８ ０．８３７ ０．７５０ ０．１０４
ｌｏｂｅｌｓｓｒ３０ ５ ０．７１２ ０．３７５ ０．４７３
ｌｏｂｅｌｓｓｒ３１ ７ ０．８０２ ０．７９２ ０．０１３
ｌｏｂｅｌｓｓｒ３９ ４ ０．６２５ ０．０００ １．０００
ｌｏｂｅｌｓｓｒ４０ ８ ０．８３３ １．０００ －０．２００
Ｎｏｔｅｓ：ＮＡ，Ｎｏ．ｏｆ ａｌｅｌｅｓ；Ｈｏ，Ｏｂｓｅｒｖｅｄ ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｓｉｔｙ；Ｈｅ，Ｅｘｐｅｃｔｅｄ ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｓｉｔｙ；ＦＩＳ，Ｗｒｉｇｈｔ’ｓ ｆｉｘａｔｉｏｎ ｉｎｄｅｘ．
２５８ 植 物 科 学 学 报 第３３卷
２ 讨论
巨人半边莲作为一类东非特有的珍稀植物，关
于其居群遗传学的研究还比较少，可能是因为可利
用的共显性分子标记有限。本实验基于采用高通量
测序方法获得的大量基因组数据，开发了巨人半边
莲Ｌ．ｄｅｃｋｎｅｉ的ＳＳＲ分子标记，为研究该属植物
的保护遗传学提供了有效工具。
在本研究获得的５８ ９６６个ＳＳＲ位点中，单核
苷酸重复类型的比例高达４７．６２％，而二核苷酸重
复仅占３６．２２％，三核苷酸重复占２．７７％，这一
结果与多数植物基因组中二核苷酸和三核苷酸重复
的频率较高不同［９－１１］。例如水生植物莕菜（Ｎｙｍ－
ｐｈｏｉｄｅｓ ｐｅｌｔａｔａ）花芽的转录组测序ＥＳＴ数据库中共
检测到１２ ３１９个ＳＳＲ位点，其中二碱基和三碱基
重复类型ＳＳＲ所占的比例较大，分别为５７．３１％和
３０．８７％［９］。另外，二碱基和三碱基重复类型ＳＳＲ
所占的比例变化较大，这种变化在一定程度上与
ＳＳＲ重复基元搜索时的相关参数设定有关［１２］。在
植物ＳＳＲ标记的开发中需要寻找一个相对统一的
ＳＳＲ检测参数，而对于巨人半边莲这样的一类特殊
植物，也需要尝试更多的参数，从而寻找一个合适
的平衡点。本文二核苷酸重复中，ＡＣ／ＧＴ出现的
比例最高，为１２．９４％，ＣＧ／ＣＧ最少，为０．０１％；
三核苷酸重复中，ＡＡＣ／ＧＴＴ出现的比例最高，但
仅为０．６３％，此结果与有些物种中的分析数据一
致，如在莕菜［９］、咖啡（Ｃｏｆｅａ ａｒａｂｉｃａ）［１１］、芝麻
（Ｓｅｓａｍｕｍ ｉｎｄｉｃｕｍ）［１３］等物种中，ＣＧ／ＣＧ在其二
核苷酸重复中所占比例均较少，而三核苷酸重复
中，ＡＡＣ／ＧＴＴ重复出现的频率较高。但在其他物
种如水稻（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ）、玉米（Ｚｅａ ｍａｙｓ）和枳壳
等中，ＧＧＣ／ＣＣＧ在三核苷酸重复中出现次数较
多［１４，１５］，不同物种间的核苷酸重复类型的差异可
能与其编码蛋白的使用频率有关。
本实验共设计出３５５８对引物，从中随机挑选
出的４０对 ＳＳＲ引物的扩增效率达８０％，这与
Ｇｕｐｔａ等开发的面包小麦（ｂｒｅａｄ ｗｈｅａｔ）ＳＳＲ引物的
扩增结果一致［１２］。我们利用筛选出的３２对ＳＳＲ引
物对来自肯尼亚山巨人半边莲Ｌ．ｄｅｃｋｎｅｉ居群的
２４株个体进行ＰＣＲ扩增，并分析了该居群的遗传
多样性，结果显示有１４对可扩增出稳定、清晰
且具有多态性的条带，各ＳＳＲ位点的等位基因数
（ＮＡ）为４～９个，观测杂合度（Ｈｏ）为０．６２５～
０．８５４，表 明 该 居 群 遗 传 变 异 程 度 较 高［１３］；
Ｗｒｉｇｈｔ’ｓ指数（ＦＩＳ）中，大多（９个）为正值，仅少数
（５个）为负值，表明该居群中存在过多的纯合
子［１６］，这可能与巨人半边莲Ｌ．ｄｅｃｋｅｎｉ 兼具克隆
繁殖和有性生殖２种繁殖方式有关［４，５，７，１７］。另外，
本文所检测的２４株个体取自１个较小的居群（位于
肯尼亚山的南坡），植株间较近的距离很可能促进
了近交的发生，从而增加了纯合子的数量。
综上分析，基于高通量测序获得的基因组序列
数据库开发ＳＳＲ标记是一种简单而高效的途径。
本研究共筛选出适合巨人半边莲Ｌ．ｄｅｃｋｅｎｉ 居群
研究的１４对ＳＳＲ引物，同时我们已经设计的但未
进行验证的ＳＳＲ引物也能为东非特有半边莲属植
物的保护遗传学研究提供丰富的遗传标记。通过对
Ｌ．ｄｅｃｋｅｎｉ 的基因组进行高通量测序，有利于发
掘与其功能基因相关联的ＳＳＲ分子标记，这将为
进一步阐明东非特有半边莲属植物的生态适应性提
供有效的研究工具。
参考文献：
［１］ Ｋｎｏｘ ＥＢ．Ｔｈｅ ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎ ｓｔａｔｕｓ ｏｆ ｔｈｅ ｇｉａｎｔ ｓｅｎｅｃｉｏｓ
ａｎｄ ｇｉａｎｔ ｌｏｂｅｌｉａｓ ｉｎ ｅａｓｔｅｒｎ Ａｆｒｉｃａ［Ｊ］．Ｏｐｅｒａ Ｂｏｔ，
１９９３，１２１：１９５－２１６．
［２］ Ｋｎｏｘ ＥＢ，Ｐａｌｍｅｒ ＪＤ．Ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔ ＤＮＡ ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｏｎ ｔｈｅ
ｏｒｉｇｉｎ ａｎｄ ｒａｄｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｇｉａｎｔ ｌｏｂｅｌｉａｓ ｉｎ ｅａｓｔｅｒｎ Ａｆｒｉ－
ｃａ［Ｊ］．Ｓｙｓｔ Ｂｏｔ，１９９８，２３（２）：１０９－１４９．
［３］ Ｍａｇｏｍｂｏ ＺＬＫ，Ｍｂｅｉｚａ，Ｎｄｉｒｉｔｕ Ｎ，Ｎｄｉｒｉｔｕ，Ｇ．Ｇ．
Ｌｏｂｅｌｉａ ａｂｅｒｄａｒｉｃａ．Ｔｈｅ ＩＵＣＮ Ｒｅｄ Ｌｉｓｔ ｏｆ Ｔｈｒｅａ－ｔｅｎｅｄ
Ｓｐｅｃｉｅｓ ２００４：ｅ．Ｔ４４７１５Ａ１０９３９９２７．ｈｔｐ：／ｄｘ．ｄｏｉ．
ｏｒｇ／１０． ２３０５／ＩＵＣＮ． ＵＫ． ２００４． ＲＬＴＳ．
Ｔ４４７１５Ａ１０９３９９２７．ｅｎ
［４］ Ｍｕｌｕｇｅｔａ Ｋ，Ｄｏｒｏｔｈｅｅ Ｅ，Ｐｉｅｒｅ Ｔ，Ｓｉｌｅｓｈｉ Ｎ，Ｃｈｒｉｓｔｉ－
ａｎａ Ｂ．Ｐｈｙｌｏｇｅｏｇｒａｐｈｙ ａｎｄ ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎ ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｏｆ ａ
ｇｉａｎｔ ｌｏｂｅｌｉａ（Ｌｏｂｅｌｉａ ｇｉｂｅｒｏａ）ｉｎ Ｅｔｈｉｏｐｉａｎ ａｎｄ Ｔｒｏｐｉ－
ｃａｌ Ｅａｓｔ Ａｆｒｉｃａｎ ｍｏｕｎｔａｉｎｓ［Ｊ］．Ｍｏｌ Ｅｃｏｌ，２００７，１６
（６）：１２３３－１２４３．
［５］ Ｌｉａｏ ＹＹ，Ｙｕｅ ＸＬ，Ｇｕｏ ＹＨ，Ｇｉｔｕｒｕ ＷＲ，Ｗａｎｇ ＱＦ，
Ｃｈｅｎ ＪＭ．Ｇｅｎｏｔｙｐｉｃ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ａｎｄ ｇｅｎｅｔｉｃ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ
ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｔｈｅ ｄｉｓｔｙｌｏｕｓ ａｑｕａｔｉｃ ｐｌａｎｔ Ｎｙｍｐｈｏｉｄｅｓ
３５８ 第６期 米 奇等：基于新一代高通量测序技术开发巨人半边莲Ｌｏｂｅｌｉａ ｄｅｃｋｅｎｉｉ的ＳＳＲ标记
ｐｅｌｔａｔａ （Ｍｅｎｙａｎｔｈａｃｅａｅ）ｉｎ Ｃｈｉｎａ［Ｊ］．Ｊ Ｓｙｓｔ Ｅｖｏｌ，
２０１３，５１（５）：５３６－５４４．
［６］ 高洁，李巧明．羽叶金合欢的ＤＮＡ提取和ＳＳＲ引物
筛选［Ｊ］．云南植物研究，２００８，３０（１）：６４－６８．
［７］ 程小毛，黄晓霞．ＳＳＲ标记开发及其在植物中的应
用［Ｊ］．中国农学通报，２０１１，２７（０５）：３０４－３０７．
［８］ Ｌｉ Ｒ，Ｚｈｕ Ｈ，Ｒｕａｎ Ｊ，Ｑｉａｎ Ｗ，Ｆａｎｇ Ｘ，Ｓｈｉ Ｚ，Ｌｉ Ｙ，Ｌｉ
Ｓ，Ｓｈａｎ Ｇ，Ｋｒｉｓｔｉａｎｓｅｎ Ｋ，Ｌｉ Ｓ，Ｙａｎｇ Ｈ，Ｗａｎｇ Ｊ，
Ｗａｎｇ Ｊ．Ｄｅ ｎｏｖｏ ａｓｓｅｍｂｌｙ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｇｅｎｏｍｅｓ ｗｉｔｈ
ｍａｓｓｉｖｅｌｙ ｐａｒａｌｅｌ ｓｈｏｒｔ ｒｅａｄ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ［Ｊ］．Ｇｅｎｏｍｅ
Ｒｅｓ，２０１０，２０（２）：２６５－２７２．
［９］ 袁阳阳，王青锋，陈进明．基于转录组测序信息的
水生植物莕菜ＳＳＲ标记开发［Ｊ］．植物科学学报，
２０１３，３１（５）：４８５－４９２．
［１０］ Ｙｅｈ ＦＣ Ｂ．Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ｇｅｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｃｏｄｏｍｉｎａｎｔ
ａｎｄ ｄｏｍｉｎａｎｔ ｍａｒｋｅｒｓ ａｎｄ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｔｒａｉｔｓ［Ｊ］．Ｂｅｌ－
ｇｉａｎ Ｊ Ｂｏｔ，１９９７，１２９：１５７．
［１１］ Ａｇｇａｒｗａｌ ＲＫ，Ｈｅｎｄｒｅ ＰＳ，Ｖａｒｓｈｎｅｙ ＲＫ，Ｂｈａｔ ＰＲ，
Ｋｒｉｓｈｎａｋｕｍａｒ Ｖ，Ｓｉｎｇｈ Ｌ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａ－
ｔｉｏｎ ａｎｄ ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ＥＳＴ ｄｅｒｉｖｅｄ ｇｅｎｉｃ ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｉｔｅ
ｍａｒｋｅｒｓ ｆｏｒ ｇｅｎｏｍｅ ａｎａｌｙｓｅｓ ｏｆ ｃｏｆｅｅ ａｎｄ ｒｅｌａｔｅｄ ｓｐｅ－
ｃｉｅｓ［Ｊ］．Ｔｈｅｏｒ Ａｐｐｌ Ｇｅｎｅｔ，２００７，１１４（２）：３５９－
３７２．
［１２］ Ｇｕｐｔａ ＰＫ，Ｖａｒｓｈｎｅｙ ＲＫ．Ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ ｕｓｅ ｏｆ
ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｉｔｅ ｍａｒｋｅｒｓ ｆｏｒ ｇｅｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ａｎｄ ｐｌａｎｔ
ｂｒｅｅｄｉｎｇ ｗｉｔｈ ｅｍｐｈａｓｉｓ ｏｎ ｂｒｅａｄ ｗｈｅａｔ［Ｊ］．Ｅｕｐｈｙｔｉ－
ｃａ，２０００，１１３（３）：１６３－１８５．
［１３］ Ｗｅｉ ＷＬ，Ｑｉ ＸＱ，Ｗａｎｇ ＬＨ，Ｚｈａｎｇ ＹＸ，Ｈｕａ Ｗ，Ｌｉ ＤＨ，
Ｌｖ ＨＸ，Ｚｈａｎｇ ＸＲ．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｓｅｓａｍｅ
（Ｓｅｓａｍｕｍ ｉｎｄｉｃｕｍＬ．）ｇｌｏｂａｌ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ ｕｓｉｎｇ Ｉｌｕ－
ｍｉｎａ ｐａｉｒｅｄ－ｅｎｄ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ａｎｄ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ＥＳＴ－
ＳＳＲ ｍａｒｋｅｒｓ［Ｊ］．ＢＭＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，２０１１，１２（１）：４５１
－４６３．
［１４］ 杨春霞，温强，叶金山，朱培林．枳壳ＥＳＴ－ＳＳＲ标
记的开发［Ｊ］．分子植物育种，２０１１，９（１）：１２３－
１２７．
［１５］ Ｋａｎｔｅｔｙ ＲＶ，Ｌａ Ｒｏｔａ Ｍ，Ｍａｔｈｅｗｓ ＤＥ，Ｓｏｒｅｌｓ ＭＥ．
Ｄａｔａ ｍｉｎｉｎｇ ｆｏｒ ｓｉｍｐｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｒｅｐｅａｔｓ ｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ
ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｔａｇｓ ｆｒｏｍ ｂａｒｌｅｙ，ｍａｉｚｅ，ｒｉｃｅ，ｓｏｒｇｈｕｍ ａｎｄ
ｗｈｅａｔ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ，２００２，４８（５－６）：５０１－
５１０．
［１６］ 向华，毛盛贤．固定指数理论及其在遗传育种中的
应用［Ｊ］．遗传，１９９５，１７（Ｓ１）：６３－７０．
［１７］ Ｔｒｕｍａｎ ＰＹ．Ｔｈｅ ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ｄｅｍｏｇｒａｐｈｙ ｏｆ ｓｅｍｅｌｐ－
ａｒｏｕｓ Ｌｏｂｅｌｉａ ｔｅｌｅｋｉ ａｎｄ ｉｔｅｒｏｐａｒｏｕｓ Ｌｏｂｅ－ｌｉａ ｋｅｎｉｅｎｓｉｓ
ｏｎ Ｍｏｕｎｔ Ｋｅｎｙａ［Ｊ］．Ｊ Ｅｃｏｌ，１９８２，７２ （２）：６３７－
６５０．
（责任编辑：刘艳玲）
４５８ 植 物 科 学 学 报 第３３卷