全 文 ：植物科学学报　 ２０１５ꎬ ３３(６): ８４７~８５４
Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｊｏｕｒｎａｌ
　 　 ＤＯＩ:１０􀆰 １１９１３ / ＰＳＪ􀆰 ２０９５￣０８３７􀆰 ２０１５􀆰 ６０８４７
基于新一代高通量测序技术开发巨人半边莲
Ｌｏｂｅｌｉａ ｄｅｃｋｅｎｉｉ的 ＳＳＲ标记
米 奇１ꎬ２ꎬ 龙志成１ꎬ２ꎬ Ｍｕｃｈｕｋｕ Ｊｏｈｎ Ｋａｍａｕ１ꎬ２ꎬ 陈进明１∗ꎬ 王青锋１∗
(１􀆰 中国科学院武汉植物园ꎬ 中国科学院水生植物与流域生态重点实验室ꎬ 武汉 ４３００７４ꎻ ２􀆰 中国科学院大学ꎬ 北京 １０００４９)
摘　 要: 为了开发东非半边莲属特有植物的微卫星分子标记(ＳＳＲ) ꎬ 本研究基于 Ｉｌｌｕｍｉｎａ￣ＨｉＳｅｑ ２０００ 测序
平台对巨人半边莲 Ｌｏｂｅｌｉａ ｄｅｃｋｅｎｉｉ的基因组进行高通量测序ꎮ 利用 ＭＩＳＡ 软件对获得的基因组数据库进行
搜索与分析ꎬ 共鉴别出 ５８ ９６６ 个 ＳＳＲ 位点ꎬ 并利用 Ｐｒｉｍｅｒ 软件成功设计出 ３５５８ 对特异性的 ＳＳＲ 引物ꎮ
利用 Ｌ. ｄｅｃｋｅｎｉｉ ３ 个居群的 ６ 个样品对随机挑选的 ４０ 对 ＳＳＲ 引物进行扩增效率检验ꎬ 发现有 ３２ 对重复
性好且可扩增出清晰条带ꎮ 利用筛选出的 ３２ 对 ＳＳＲ 引物对来自肯尼亚山居群的 ２４ 株个体进行 ＰＣＲ 扩增
并采用荧光分型技术检测多态性ꎬ 结果显示有 １４ 对可扩增出稳定的多态性条带ꎬ 共有 ８６ 个等位基因ꎬ 各
ＳＳＲ 位点的等位基因数(ＮＡ)为 ４ ~ ９ 个ꎬ 观测杂合度(Ｈｏ)和期望杂合度(Ｈｅ)分别为 ０􀆰 ０００ ~ １􀆰 ０００ 和
０􀆰 ６２５ ~ ０􀆰 ８５４ꎮ 本研究结果表明ꎬ 通过高通量测序技术开发东非特有植物巨人半边莲的 ＳＳＲ 标记是一种
简单而高效的途径ꎬ 这些新的 ＳＳＲ 分子标记为巨人半边莲的居群遗传多样性、 遗传结构以及对其开展保护
生物学研究提供了工具ꎮ
关键词: 东非特有植物ꎻ 半边莲属ꎻ 高通量测序ꎻ ＳＳＲ标记
中图分类号: Ｑ３４６　 　 　 　 　 文献标识码: Ａ　 　 　 　 　 文章编号: ２０９５￣０８３７(２０１５)０６￣０８４７￣０８
　 　 　 收稿日期: ２０１５￣０５￣２９ꎬ 退修日期: ２０１５￣０７￣０２ꎮ
　 基金项目: 国家自然科学基金项目(３１５７０２２０)ꎻ 中国科学院海外拓展工程项目(２３Ｙ３２３７７１Ｗ０７７７)ꎮ
　 作者简介: 米奇(１９９０－)ꎬ 女ꎬ 硕士研究生ꎬ 研究方向为植物居群遗传学(Ｅ￣ｍａｉｌ: ４１８４６８３７８＠ｑｑ􀆰 ｃｏｍ)ꎮ
　 ∗通讯作者(Ａｕｔｈｏｒ ｆｏｒ ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｅｎｃｅ􀆰 Ｅ￣ｍａｉｌ: ｊｍｃｈｅｎ＠ｗｂｇｃａｓ􀆰 ｃｎꎻ Ｅ￣ｍａｉｌ: ｑｆｗａｎｇ＠ｗｂｇｃａｓ􀆰 ｃｎ)ꎮ
Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ＳＳＲ Ｍａｒｋｅｒｓ ｉｎ Ｇｉａｎｔ Ｌｏｂｅｌｉａ (Ｌｏｂｅｌｉａ ｄｅｃｋｅｎｉｉ)
Ｂａｓｅｄ ｏｎ Ｎｅｘｔ￣ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ｈｉｇｈ￣ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ
ＭＩ Ｑｉ１ꎬ２ꎬ ＬＯＮＧ Ｚｈｉ￣Ｃｈｅｎｇ１ꎬ２ꎬ ＭＵＣＨＵＫＵ Ｊｏｈｎ Ｋａｍａｕ１ꎬ２ꎬ
ＣＨＥＮ Ｊｉｎ￣Ｍｉｎｇ１∗ꎬ ＷＡＮＧ Ｑｉｎｇ￣Ｆｅｎｇ１∗
(１. Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ａｑｕａｔｉｃ Ｂｏｔａｎｙ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｓｈｅｄ Ｅｃｏｌｏｇｙꎬ Ｗｕｈａｎ Ｂｏｔａｎｉｃａｌ Ｇａｒｄｅｎｓꎬ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ
ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓꎬ Ｗｕｈａｎ ４３００７４ꎬ Ｃｈｉｎａꎻ ２. Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓꎬ Ｂｅｉｊｉｎｇ １０００４９ꎬ Ｃｈｉｎａ)
Ａｂｓｔｒａｃｔ: Ｔｏ ｄｅｖｅｌｏｐ ｃｏ￣ｄｏｍｉｎａｎｔ ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍａｒｋｅｒｓ ( ＳＳＲｓ) ｆｏｒ ｓｔｕｄｙｉｎｇ
ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎ ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｏｆ ｔｈｅ ｇｉａｎｔ ｌｏｂｅｌｉａ ｅｎｄｅｍｉｃ ｔｏ ｅａｓｔ Ａｆｒｉｃａꎬ ｗｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｄ ｔｈｅ ｇｅｎｏｍｅ
ｏｆ ｔｈｅ ｇｉａｎｔ ｌｏｂｅｌｉａꎬ Ｌｏｂｅｌｉａ ｄｅｃｋｅｎｉｉꎬ ｕｓｉｎｇ ｎｅｘｔ￣ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｈｉｇｈ￣ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ
ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ. Ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ＭＩＳＡ ｐｒｏｇｒａｍꎬ ｗｅ ａｃｑｕｉｒｅｄ ａ ｔｏｔａｌ ｏｆ ５８ ９６６ ＳＳＲｓꎬ ｆｒｏｍ ｗｈｉｃｈ ｗｅ
ｄｅｓｉｇｎｅｄ ３５５８ ＳＳＲ ｐｒｉｍｅｒ ｐａｉｒｓ ｕｓｉｎｇ Ｐｒｉｍｅｒ ｓｏｆｔｗａｒｅ. Ｗｅ ｓｅｌｅｃｔｅｄ ４０ ｐｒｉｍｅｒ ｐａｉｒｓ ａｔ ｒａｎｄｏｍ
ｔｏ ｅｖａｌｕａｔｅ ｔｈｅｉｒ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ａｃｒｏｓｓ ｓｉｘ ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｓ ｆｒｏｍ ｔｈｒｅｅ Ｌ􀆰 ｄｅｃｋｅｎｉｉ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ ( ｔｗｏ
ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｓ ｐｅｒ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ) . Ｔｈｉｒｔｙ￣ｔｗｏ ｍａｒｋｅｒｓ ｗｅｒｅ ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ ａｍｐｌｉｆｉｅｄꎬ ｙｉｅｌｄｉｎｇ ｃｌｅａｒ ａｎｄ
ｄｉｓｃｅｒｎｉｂｌｅ ｂａｎｄｓ. Ｕｓｉｎｇ ２４ Ｌ􀆰 ｄｅｃｋｅｎｉｉ ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｋｅｎｙａ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎꎬ ｗｅ
ｔｅｓｔｅｄ ｔｈｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ ｏｆ ｔｈｅ ３２ ＳＳＲ ｍａｒｋｅｒｓ ａｎｄ ｆｏｕｎｄ ｔｈａｔ １４ ｗｅｒｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ. Ｕｓｉｎｇ
ｔｈｅｓｅ １４ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ ＳＳＲ ｍａｒｋｅｒｓꎬ ｗｅ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ａ ｔｏｔａｌ ｏｆ ８６ ａｌｌｅｌｅｓ. Ｔｈｅ ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ ａｌｌｅｌｅｓ ｐｅｒ
ｌｏｃｕｓ ｒａｎｇｅｄ ｆｒｏｍ ｆｏｕｒ ｔｏ ｎｉｎｅ. Ｏｂｓｅｒｖｅｄ ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｓｉｔｙ (Ｈｏ) ａｎｄ ｅｘｐｅｃｔｅｄ ｖａｌｕｅ (Ｈｅ) ｐｅｒ
ｌｏｃｕｓ ｖａｒｉｅｄ ｆｒｏｍ ０􀆰０００ ｔｏ １􀆰０００ ａｎｄ ０􀆰６２５ ｔｏ ０􀆰８５４ꎬ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ. Ｏｕｒ ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ
ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ＳＳＲ ｍａｒｋｅｒｓ ｆｒｏｍ ｇｅｎｏｍｉｃ ｄａｔａ ｂｙ ｈｉｇｈ￣ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｉｎ ｔｈｅ ｇｉａｎｔ
ｌｏｂｅｌｉａ ｗａｓ ｖａｌｕａｂｌｅ ａｎｄ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ. Ｔｈｅｓｅ ｎｅｗｌｙ ｇｅｎｅｒａｔｅｄ ＳＳＲ ｍａｒｋｅｒｓ ｗｉｌｌ ｐｒｏｖｉｄｅ ｎｏｖｅｌ ｔｏｏｌｓ
ｆｏｒ ｓｔｕｄｙｉｎｇ ｇｅｎｅｔｉｃ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙꎬ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ｇｅｎｅｔｉｃ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎ ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｇｉａｎｔ
ｌｏｂｅｌｉａｓ ｉｎ ｅａｓｔ Ａｆｒｉｃａ.
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ: Ｅａｓｔ Ａｆｒｉｃａ ｅｎｄｅｍｉｃ ｐｌａｎｔꎻ Ｇｉａｎｔ ｌｏｂｅｌｉａꎻ Ｈｉｇｈ￣ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇꎻ ＳＳＲ
ｍａｒｋｅｒｓ
　 　 半边莲属(Ｌｏｂｅｌｉａ Ｌ.)为桔梗科(Ｃａｍｐａｎｕ￣
ｌａｃｅａｅ)草本或亚灌木植物ꎬ 全世界约 ３８０ 种ꎬ 主
要分布于热带及亚热带区域[１]ꎮ 巨人半边莲(ｇｉａｎｔ
ｌｏｂｅｌｉａ)是分布于东非高原的半边莲属特有植物ꎬ
共有 ２１ 种[１ꎬ２] ꎮ 巨人半边莲为亚灌木ꎬ 具高大花
序ꎬ 叶片互生并呈莲座状排列ꎬ 是植物进化生物
学领域中用来研究趋同进化及适应辐射的典型代
表材料[１ꎬ２] ꎮ
近年来ꎬ 气候变化、 人类农业活动的影响等
使巨人半边莲在东非的生境遭到较大破坏ꎬ 该类
植物的分布区范围也在逐渐缩小ꎬ 其中一些物种
(如 Ｌ. ａｂｅｒｄｅｒｉｃａ)已被世界自然保护联盟( ＩＵ￣
ＣＮ)列为濒危物种[３] ꎬ 因此开展巨人半边莲的居
群遗传学研究对于科学地保育这些珍稀植物具有
重要的指导意义ꎮ 目前ꎬ 关于采用分子标记开展
巨人半边莲的保护遗传学研究较少ꎬ 如 Ｋｅｂｅｄｅ
等采用 ＡＦＬＰ 分子标记探讨了分布范围最广的巨
人半边莲 Ｌ. ｇｉｂｅｒｒｏａ的居群遗传结构及谱系地理
学[４] ꎻ Ｇｅｌｅｔａ 和 Ｂｒｙｎｇｅｌｓｓｏｎ 采用 ＩＳＳＲ 分子标
记分析了分布在埃塞俄比亚境内的巨人半边莲 Ｌ.
ｒｈｙｎｃｈｏｐｅｔａｌｕｍ的遗传多样性[５] ꎮ 这些居群遗传
学研究结果为少数巨人半边莲物种的保护措施制
定提供了依据ꎬ 但由于其采用的分子标记在揭示
巨人半边莲的适应性遗传变异方面存在很大局限
性ꎬ 不能较好地满足保护遗传学深入研究的需
要ꎬ 故亟需开发适合研究巨人半边莲适应性遗传
变异的共显性分子标记ꎬ 如微卫星分子标记
(ｓｉｍｐｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｒｅｐｅａｔｓꎬ ＳＳＲ)ꎮ
本研究拟采用新一代高通量测序技术对分布于
东非的特有植物巨人半边莲 Ｌ. ｄｅｃｋｅｎｉｉ 进行 ＳＳＲ
分子标记的开发ꎬ 以期为东非特有半边莲属植物的
居群适应性遗传变异分析及其保护生物学提供有效
工具ꎮ
１　 材料与方法
１􀆰 １　 植物材料
巨人半边莲 Ｌ. ｄｅｃｋｅｎｉｉ居群材料分别采集于
东非肯尼亚山、 阿布代尔山和埃贡山ꎬ 其中用以
高通量测序的 １ 个样品来自于东非肯尼亚山居群
(０°１０􀆰１′Ｓꎬ ３７°１３􀆰７′Ｅꎻ 海拔 ３４４０ ｍ)ꎻ 用于检验
ＳＳＲ引物扩增效率的 ６ 个样品分别来自东非肯尼
亚山居群(０°１０􀆰１′Ｓꎬ ３７°１３􀆰７′Ｅꎻ 海拔３４４０ ｍ)、
阿布代尔山居群 ( ０° ２５􀆰８′ Ｓꎬ ３６° ４３􀆰５′ Ｅꎻ 海拔
３０５０ ｍ)及埃贡山居群(１°６􀆰１′Ｓꎬ ３４°３７′ Ｅꎻ 海拔
３６７０ ｍ)ꎬ 每居群 ２个样品ꎻ 用于检验引物多态性
的材料为肯尼亚山居群(０°３􀆰６′Ｓꎬ ３７°１７􀆰６′Ｅꎻ 海
拔 ３５８０ ｍ)的 ２４株个体ꎮ 取新鲜幼嫩的叶片放入置
有干燥剂(变色硅胶)的取样袋中迅速干燥、 备用ꎮ
１􀆰 ２　 ＤＮＡ提取
利用 Ｅｚｕｐ柱式植物基因组 ＤＮＡ 抽提试剂盒
(上海生工生物技术服务公司)提取巨人半边莲 Ｌ.
ｄｅｃｋｅｎｉｉ 干燥叶片的 ＤＮＡꎬ 并采用 Ｎａｎｏｄｒｏｐ
２０００ (Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ)和 Ｑｕｂｉｔ ２􀆰０(Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈ￣
ｎｏｌｏｇｉｅｓ)对 ＤＮＡ的纯度和浓度进行检测ꎮ
１􀆰 ３　 高通量测序与序列组装分析
对来自东非肯尼亚山的巨人半边莲 Ｌ. ｄｅｃｋｅ￣
ｎｉｉ居群的 １个样品进行 ＤＮＡ 文库构建: 使用 Ｃｏ￣
ｖａｒｉｓ Ｓ２２０超声波破碎仪(Ｃｏｖａｒｉｓ)将基因组 ＤＮＡ
随机打断ꎬ 再经末端修复、 加 Ａ 尾、 加测序接头、
纯化、 ＰＣＲ 扩增等步骤完成 ＤＮＡ 文库制备ꎮ 然
后ꎬ 使用 Ａｇｉｌｅｎｔ ２１００ 生物分析仪(Ａｇｉｌｅｎｔ)对文
库的插入片段(大小为 １００ ｂｐ)进行检测ꎬ 当插
入片段符合预期扩增产物大小后ꎬ 送往华中农业
大学公共测序平台采用 Ｉｌｌｕｍｉｎａ￣ＨｉＳｅｑ ２０００ 测序
系统对 ＤＮＡ 文库进行 ＰＥ１００ 测序 ( Ｐａｉｒｅｄ￣Ｅｎｄ
ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ)ꎮ 测序完成后ꎬ 使用 ＦＡＳＴＸ￣ｔｏｏｌｋｉｔ
(ｈｔｔｐ: / / ｈａｎｎｏｎｌａｂ. ｃｓｈｌ. ｅｄｕ / ｆａｓｔｘ ＿ ｔｏｏｌｋｉｔ / ｉｎｄｅｘ.
８４８ 植 物 科 学 学 报 第 ３３卷　
ｈｔｍｌ)对获得的高通量测序数据 (共 １０ Ｇ ｒａｗ
ｒｅａｄｓ)进行质量控制ꎬ 即将准确度低于 ９９􀆰５％且
长度小于 ２５的序列过滤后ꎬ 利用 ＳＯＡＰｄｅｎｏｖｏ软
件进行序列的拼接和组装(Ｋｍｅｒ值设为 ４３) [６]ꎮ
１􀆰 ４　 ＳＳＲ位点的开发与引物设计
对高通量测序的原始数据进行质控后共获得
９􀆰６ Ｇ ｃｌｅａｎ ｒｅａｄｓꎬ 经拼接后得到的最长序列片段
为 ５５７３ ｂｐꎬ ｃｏｎｔｉｇ 的 Ｎ５０ 为 １５９ ｂｐꎬ 平均覆盖
度为 ３７Ｘꎮ 对拼接后所获得的高通量测序数据ꎬ 首
先利用 ＭＩＳＡ (ＭｉｃｒｏＳａｔｅｌｌｉｔｅꎬ ｈｔｔｐ: / / ｐｇｒｃ. ｉｐｋ ＿
ｇａｔｅｒｓｌｅｂｅｎ.ｄｅ / ｍｉｓａ / )软件搜寻含 １ ~ ６ 个 ＳＳＲ
重复基元的区间ꎬ 本研究中 ＳＳＲ 重复基元的查找
标准为单核苷酸重复次数 ≥ １０ꎬ 二核苷酸重复次
数 ≥ ６ꎬ 三核苷酸重复次数 ≥ ５ꎬ 四核苷酸重复
次数 ≥ ５ꎬ 五核苷酸重复次数 ≥ ４ꎬ 六核苷酸重复
次数 ≥ ４ꎬ 复合型 ＳＳＲ 整体长度不小于 ２４ ｂｐꎻ 然
后ꎬ 采用 Ｐｒｉｍｅｒ ３􀆰０ ( ｈｔｔｐ: / / ｂｉｏｔｏｏｌｓ. ｕｍａｓｓｍｅｄ.
ｅｄｕ / ｂｉｏａｐｐｓ / ｐｒｉｍｅｒ ３＿ｗｗｗ.ｃｇｉ)对鉴定出的含有
ＳＳＲ重复基元的序列片段进行引物设计ꎬ 并要求
①引物长度 １５ ~ ３ ０ ｂｐꎬ 最适长度 ２０ ｂｐꎻ ②退火
温度 ５５℃ ~ ６５℃ꎬ 最适退火温度 ６０℃ꎻ ③ＰＣＲ产
物长度为 １００ ~ ２８０ ｂｐꎬ 最适长度 ２５０ ｂｐꎻ ④ ＧＣ
含量 ４０％ ~ ６０％ꎬ 最适 ＧＣ 含量为 ５０％[７]ꎮ 依据
此设计原则ꎬ 对 １１８６条包含 ＳＳＲ位点的高质量序
列共设计出 ３５５８对引物ꎮ 每个 ＳＳＲ位点至少设计
３对候选引物ꎬ 以用于巨人半边莲居群不同个体间
的多态性检测ꎮ
１􀆰 ５　 ＳＳＲ引物初步筛选
随机挑选 ４０对基于含有不同重复基元的区间
设计的 ＳＳＲ 引物(编号 ｌｏｂｅｌｓｓｒ１￣４０)ꎬ 并由北京
擎科新业生物技术公司进行引物序列合成ꎻ 然后ꎬ
分别从 ３ 个 Ｌ. ｄｅｃｋｅｎｉｉ 居群中各随机选取 ２ 个个
体ꎬ 对合成的 ４０ 对 ＳＳＲ 引物进行扩增效率检验ꎻ
最后ꎬ 对来自肯尼亚山巨人半边莲居群的 ２４ 株个
体进行引物的多态性分析ꎮ
ＰＣＲ反应体系为 ２５ μＬꎬ 包含 ３０ ｎｇ 基因组
ＤＮＡ 模板、 ０􀆰５ ｍｍｏｌ / Ｌ ｄＮＴＰｓ ０􀆰５μＬ、 １ Ｕ Ｔａｑ
ＤＮＡ聚合酶 ０􀆰２５ μＬ、 ０􀆰１ μｍｏｌ / Ｌ 正、 反向引物各
０􀆰５ μＬ、 １０ × Ｔａｑ 缓冲液(主要成分为 １０ ｍｍｏｌ / Ｌ
Ｔｒｉｓ￣ＨＣｌ (ｐＨ ８􀆰３)、 １􀆰５ ｍｍｏｌ / Ｌ ＭｇＣｌ２、 ５０ ｍｍｏｌ / Ｌ
ＫＣｌ) ２􀆰５ μＬꎮ ＰＣＲ扩增在 ＡＢＩ ２７２０ (Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏ￣
ｓｙｓｔｅｍｓꎬ ＵＳＡ) ＰＣＲ 仪上进行ꎬ 其反应程序设置
为: ９４℃预变性 ５ ｍｉｎꎻ ９４℃变性 ３５ ｓꎬ ５８℃ ~
６２℃退火 ３０ ｓ(退火温度取决于引物的长度、 碱基
组成等)ꎬ ７２℃延伸 ３０ ｓꎬ ３５个循环ꎻ 最后 ７２℃延
伸 １０ ｍｉｎꎮ ＰＣＲ扩增产物于 ４℃低温条件下保存ꎮ
采用 ２％琼脂糖凝胶对 ＰＣＲ扩增产物进行电泳
检测ꎬ 并在紫外灯下观察、 拍照ꎮ 然后ꎬ 选取扩增
条带清晰、 重复性好的引物并在其上游引物的 ５’端
标记荧光基团 ＦＡＭ(６￣ｃａｒｂｏｘｙ￣ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ)ꎮ ＳＳＲ
荧光引物由北京擎科新业生物技术公司合成ꎬ 并对
来自肯尼亚山巨人半边莲居群的 ２４ 株个体进行
ＰＣＲ扩增ꎬ 产物经 ２％琼脂糖凝胶电泳检测后送往
北京擎科新业生物技术公司ꎬ 在 ＡＢＩ ３７３０自动测序
仪(Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓꎬ ＵＳＡ)上进行荧光分型ꎮ
１􀆰 ６　 数据分析
采用软件 ＧｅｎｅＭａｒｋｅｒ Ｖ１􀆰５ ( ｈｔｔｐ: / / ｗｗｗ.
ｓｏｆｔｇｅｎｅｔｉｃｓ.ｃｏｍ / ＧｅｎｅＭａｒｋｅｒ. ｈｔｍｌ)打开荧光分
型数据的原始文件ꎬ 并根据峰图统计记录每个样
品每对引物的条带大小ꎬ 每对引物每个样品均记
录 ２ 个条带的片段大小( Ｌ􀆰 ｄｅｃｋｅｎｉｉ 为二倍体)ꎬ
其中只有一个扩增片段的纯合子将其谱带大小记
录 ２ 次ꎻ 统计结果整理完成后ꎬ 利用软件 ＧｅｎＡ￣
ｌＥｘ ６􀆰５０１ ( ｈｔｔｐ: / / ｂｉｏｌｏｇｙ￣ａｓｓｅｔｓ. ａｎｕ. ｅｄｕ. ａｕ /
ＧｅｎＡｌＥｘ / Ｄｏｗｎｌｏａｄ􀆰 ｈｔｍｌ)计算每一个 ＳＳＲ 位点
的等位基因数(ＮＡ)、 观测杂合度(Ｈｏ)、 预期杂合
度(Ｈｅ)和固定指数(ＦＩＳ) [８]ꎮ
２　 结果与分析
２􀆰 １　 巨人半边莲中 ＳＳＲ的分布及频率
利用 ＭＩＳＡ 软件在巨人半边莲 Ｌ. ｄｅｃｋｅｎｉｉ 的
高通量测序数据库中搜索含 １ ~ ６ 个 ＳＳＲ 重复基
元的区间ꎬ 共获得 ５８ ９６６ 个位点ꎬ 其中单一重复
类型(单个重复基元)ＳＳＲ 有 ５８ ３７６ 个(９９􀆰０％)ꎬ
而复合型(多个重复基元)ＳＳＲ 有 ５９０ 个(１􀆰０％)ꎮ
重复基元分析显示(表 １)ꎬ 分布最多的重复基元为
单核苷酸重复ꎬ 占 ４７􀆰６２％ꎻ 其次是二核苷酸重复
(占 ３６􀆰２２％)、 四核苷酸重复(占 ６􀆰９２％)、 六核
苷酸重复(占 ５􀆰２４％)、 三核苷酸重复(占 ２􀆰７７％)ꎻ
分布最少的是五核苷酸重复ꎬ 占 ０􀆰２３％ꎮ ＳＳＲ 重
９４８　 第 ６期　 　 　 　 　 　 米 奇等: 基于新一代高通量测序技术开发巨人半边莲 Ｌｏｂｅｌｉａ ｄｅｃｋｅｎｉｉ的 ＳＳＲ标记
复基元类型及发生频率的分析结果显示(表 ２)ꎬ
巨人半边莲 Ｌ. ｄｅｃｋｅｎｉｉ基因组序列片段中共发现
４ 种二核苷酸重复基元和 １０ 种三核苷酸重复基
元ꎬ 且在出现的二核苷酸重复中ꎬ ＡＣ / ＧＴ 所占比
例最高ꎬ 为 １２􀆰９４％ꎬ ＣＧ / ＣＧ 最少ꎬ 为 ０􀆰０１％ꎻ
三核苷酸重复中ꎬ ＡＡＣ / ＧＴＴ 所占比例最高ꎬ 为
０􀆰６３％ꎮ 此外ꎬ 在 Ｌ􀆰 ｄｅｃｋｅｎｉｉ ＳＳＲ 重复基元中
ＣＣＧ / ＣＧＧ发生频率最低ꎬ 为 ０􀆰００３％ꎮ
２􀆰 ２　 ＳＳＲ位点多态性
利用巨人半边莲 Ｌ. ｄｅｃｋｅｎｉｉ ３ 个居群的 ６ 个
样品对随机挑选的 ４０对 ＳＳＲ引物进行筛选ꎬ 发现
共有 ３２对(表 ３)可成功扩增出清晰条带ꎬ 即引物
有效扩增率为 ８０％ꎮ 利用筛选出的 ３２对 ＳＳＲ引物
对来自肯尼亚山居群的 ２４ 株个体进行 ＰＣＲ 扩增ꎬ
结果显示有 １４对可扩增出稳定的多态性条带ꎬ 共
有 ８６个等位基因(表 ４)ꎬ 各 ＳＳＲ位点的等位基因
(ＮＡ)数为 ４ ~ ９个ꎬ 期望杂合度(Ｈｅ)和观测杂合
度( Ｈｏ ) 的范围分别为 ０􀆰００ ~ １􀆰００ 和 ０􀆰６２５ ~
０􀆰８５４ꎻ Ｗｒｉｇｈｔ’ｓ 指数(ＦＩＳ)中ꎬ 有 ９ 个为正值ꎬ ５
个为负值ꎬ 表明该种群纯合度较高(表 ４)ꎮ
表 １　 巨人半边莲 ＳＳＲ重复基元分布的类型和数量
Ｔａｂｌｅ １　 Ｔｙｐｅ ａｎｄ ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ ＳＳＲ ｒｅｐｅａｔ ｍｏｔｉｆｓ ｉｎ Ｌｏｂｅｌｉａ ｄｅｃｋｅｎｉｉ
重复基元长度
Ｒｅｐｅａｔ ｍｏｔｉｆ ｌｅｎｇｔｈ
重复次数　 Ｒｅｐｅａｔ ｎｕｍｂｅｒｓ
４ ５ ６ ７ ８ ９ １０ １１ ≥１２
合计
Ｔｏｔａｌ
百分比
(％)
单核苷酸重复
Ｍｏｎｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ０ ０ ０ ０ ０ ０ １５３３２ ４９０５ ７８４５ ２８０８２ ４７.６２
二核苷酸重复
Ｄｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ０ ０ １２５３８ ３８４７ １４６２ ６８２ ２５０ １１９ ２４５８ ２１３５６ ３６.２２
三核苷酸重复
Ｔｒｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ０ ８６１ １９５ １０８ ３３ １９ ２４ ２７ ３６７ １６３４ ２.７７
四核苷酸重复
Ｑｕａｄｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ０ ２９５５ ６４８ １１２ ４５ ２３ ４８ １５３ ４０７９ ６.９２
五核苷酸重复
Ｐｅｎｔａｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ０ ８８ １２ ０ ０ ０ ０ ２１ １２ １３３ ０.２３
六核苷酸重复
Ｈｅｘａｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ０ ９４７ ５３０ ５３１ ８７９ １６４ ０ ０ ４１ ３０９２ ５.２４
总计 Ｔｏｔａｌ ０ ４８５１ １３９２３ ４５９８ ２４６９ ９１０ １５６２９ ５１２０ １０８７６
百分比(％) ８.２３ ２３.６１ ７. ８ ４.１９ １.５４ ２６.５１ ８.６８ １８.４５
　 　 注: 单、 二、 三、 四、 五、 六核苷酸重复类型 ＳＳＲ的最小重复次数标准分别为 １０、 ６、 ５、 ５、 ４、 ４ꎮ
Ｎｏｔｅ: Ｍｏｎｏ￣ꎬ ｄｉ￣ꎬ ｔｒｉ￣ꎬ ｑｕａｄ￣ꎬ ｐｅｎｔａ￣ ａｎｄ ｈｅｘａ￣ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｒｅｐｅａｔｓ ｈａｄ ａ ｍｉｎｉｍｕｍ ｏｆ ｔｅｎꎬ ｓｉｘꎬ ｆｉｖｅꎬ ｆｉｖｅꎬ ｆｏｕｒ ａｎｄ ｆｏｕｒ ｓｕｂｕｎｉｔｓꎬ ｒｅ￣
ｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ.
表 ２　 巨人半边莲基因组序列片段中 ＳＳＲ二、 三碱基重复基元的类型及出现频率
Ｔａｂｌｅ ２　 Ｄｉ￣ ａｎｄ ｔｒｉ￣ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ＳＳＲ ｒｅｐｅａｔ ｍｏｔｉｆｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｆｒｅｑｕｅｎｃｉｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｇｅｎｏｍｅ ｏｆ Ｌｏｂｅｌｉａ ｄｅｃｋｅｎｉｉ
重复基元类型
Ｒｅｐｅａｔ ｍｏｔｉｆ
重复次数　 Ｒｅｐｅａｔ ｎｕｍｂｅｒｓ
５ ６ ７ ８ ９ １０ １１ １２ >１２
合计
Ｔｏｔａｌ
频率(％)
Ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ
ＡＣ / ＧＴ ６４５３ ６９７ ２８３ ９０ ３２ ４１ １８ １８ ７６３２ １２.９４
ＡＧ / ＣＴ ３７８２ ２１０６ ９５７ ３８６ １２６ ９２ ４９ １０１ ７５９９ １２.８９
ＡＴ / ＴＡ ３４０８ １１７７ ４７１ ２４５ １３５ ２６ ２１ ２９５ ５７７８ ９.８
ＣＧ / ＧＣ ０ ７ ０ ０ ０ ０ ０ ０ ７ ０.０１
ＡＡＣ / ＧＴＴ １４５ １７ １８ １７ １７ １０ ２４ ８ １１４ ３７０ ０.６３
ＡＡＧ / ＣＴＴ ２４６ ５３ ２６ ２ ０ １０ ３ ９ ７ ３５６ ０.６
ＡＡＴ / ＡＴＴ ７５ ２６ ７ １０ ０ ３ ０ ０ ８ １２９ ０.２２
ＡＣＣ / ＧＧＴ １１７ ２ ２ ０ ０ ０ ０ ０ ０ １２１ ０.２１
ＡＣＧ / ＣＧＴ ５ ０ ０ ２ ０ ０ ０ ０ ０ ７ ０.０１
ＡＣＴ / ＡＧＴ ４２ ４ ８ ０ ０ ０ ０ ０ １２ ６６ ０.１１
ＡＧＣ / ＧＣＴ １４ ０ ０ ０ ０ ０ ０ ０ １ １５ ０.０３
ＡＧＧ / ＣＣＴ ２７ １８ ０ ０ ０ ０ ０ ０ ０ ４５ ０.０８
ＡＴＣ / ＧＡＴ ２３ １６ ３ ０ ０ ０ ０ ０ １０ ５２ ０.０９
ＣＣＧ / ＣＧＧ ０ ３ ０ ０ ０ ０ ０ ０ ０ ３ ０.０１
总计 Ｔｏｔａｌ ６９４ １３７８８ ４０５８ １７５０ ７４７ ３２６ １９７ １１７ ５６６ ２２２４３
频率(％)
Ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ １.１８ ２３.３８８ ６.８８８ ２.９７ １.２７ ０.５５ ０.３３ ０.２ ０.９６
０５８ 植 物 科 学 学 报 第 ３３卷　
表 ３　 巨人半边莲中筛选出的 ３２对 ＳＳＲ引物
Ｔａｂｌｅ ３　 Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ３２ ＳＳＲ ｐｒｉｍｅｒｓ ｏｆ Ｌ. ｄｅｃｋｅｎｉｉ
引物编号
Ｐｒｉｍｅｒ ｃｏｄｅ
引物序列
Ｐｒｉｍｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ
(５′－３′)
重复基元
Ｒｅｐｅａｔ ｍｏｔｉｆ
目标片段大小(ｂｐ)
Ｅｘｐｅｃｔｅｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ
ｐｒｏｄｕｃｔ
退火温度
Ｔａ (℃)
ＧｅｎＢａｎｋ
ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ.
ｌｏｂｅｌｓｓｒ１ Ｆ: ＡＣＴＴＣＡＧＣＡＡＴＴＡＣＴＣＣＡＡＧＧＡＡＲ: ＧＡＧＡＴＴＴＣＣＴＣＣＣＴＡＧＣＴＴＣＣＣ
(ＣＴ) ６ １０５ ６１ ＫＴ０３３４２５
ｌｏｂｅｌｓｓｒ２ Ｆ: ＧＧＡＧＧＡＡＣＴＧＡＡＡＴＡＡＣＡＡＧＧＧＲ: ＧＧＡＡＴＴＴＴＣＧＧＣＧＡＣＧＴＧ
(ＴＡ) ６ １０６ ６２ ＫＴ０３３４２６
ｌｏｂｅｌｓｓｒ３ Ｆ: ＣＣＴＴＣＡＧＴＡＧＡＡＡＣＡＣＡＣＡＣＡＡＡＲ: ＧＧＡＡＡＡＣＴＣＡＣＡＡＧＡＡＡＡＡＣＣＣ
(ＧＡ) ６ １０６ ５８ ＫＴ０３３４２７
ｌｏｂｅｌｓｓｒ５ Ｆ: ＣＡＴＴＣＡＴＴＣＧＴＴＣＡＴＴＣＡＴＴＣＧＲ: ＣＧＡＧＴＴＡＣＴＴＴＡＴＡＣＴＣＧＧＴＡＡＧＴＣＧＴ
(ＴＣＡＴ) ５ １０７ ６０ ＫＴ０３３４２８
ｌｏｂｅｌｓｓｒ７ Ｆ: ＧＧＡＡＡＴＧＡＧＧＡＡＡＡＧＡＧＡＧＡＧＴＡＴＴＴＲ: ＧＡＧＣＧＴＴＴＣＧＡＣＧＧＡＧＡＴ
(ＣＴ) ６ １０７ ５８ ＫＴ０３３４２９
ｌｏｂｅｌｓｓｒ８ Ｆ: ＧＡＧＡＧＣＧＡＴＣＣＴＣＣＣＧＴＡＴＣＲ: ＣＡＣＴＡＡＴＣＧＧＴＧＧＧＧＴＡＴＧＣ
(ＣＣＴ) ６ １０７ ６１ ＫＴ０３３４３０
ｌｏｂｅｌｓｓｒ９ Ｆ: ＣＣＡＧＡＧＴＧＧＴＧＴＧＡＣＴＧＧＴＴＲ: ＴＴＧＣＴＧＡＴＧＡＡＧＧＴＣＡＧＣＴＡＣＴ
(ＴＧＡＴ) ５ １０８ ５９ ＫＴ０３３４３１
ｌｏｂｅｌｓｓｒ１０ Ｆ: ＴＴＴＧＧＣＡＡＡＧＣＴＡＣＣＡＡＡＣＣＲ: ＧＧＧＧＡＧＴＡＴＴＴＡＡＡＧＧＧＡＧＣＣ
(ＴＣ) ６ １０８ ６０ ＫＴ０３３４３２
ｌｏｂｅｌｓｓｒ１１ Ｆ: ＴＧＡＴＴＴＴＴＧＣＡＴＴＣＣＴＧＣＴＧＲ: ＴＡＣＣＡＡＣＡＣＣＣＧＧＴＴＡＣＴＣＧ
(ＡＴ) ６ １０９ ６０ ＫＴ０３３４３３
ｌｏｂｅｌｓｓｒ１２ Ｆ: ＡＡＣＣＡＡＧＧＡＡＧＡＡＧＧＡＡＡＴＧＡＲ: ＴＴＣＣＴＴＧＣＣＴＴＧＴＴＴＡＧＴＴＴＣＡ
(ＣＴ) ７ １０９ ５８ ＫＴ０３３４３４
ｌｏｂｅｌｓｓｒ１３ Ｆ: ＴＴＣＴＴＴＣＣＡＴＣＡＴＴＣＡＴＴＣＧＡＴＲ: ＡＡＣＡＴＧＡＧＣＡＴＡＴＴＡＴＣＧＡＧＴＴＡＣＴＴＴ
(ＴＣＡＴ) ５ １１６ ５８ ＫＴ０３３４３５
ｌｏｂｅｌｓｓｒ１８ Ｆ: ＣＡＧＣＡＡＴＧＧＣＴＴＣＡＣＴＧＡＴＴＲ: ＴＣＣＣＡＴＣＡＡＴＧＴＣＡＡＴＧＧＡＧ
(ＧＡ) ６ １２１ ５９ ＫＴ０３３４３６
ｌｏｂｅｌｓｓｒ１９ Ｆ: ＧＧＧＣＴＴＣＣＡＡＣＡＡＣＡＡＡＧＡＲ: ＣＴＴＣＴＣＣＡＴＴＧＣＧＡＣＣＴＣＣ
(ＡＣＡ) ７ １２２ ５９ ＫＴ０３３４３７
ｌｏｂｅｌｓｓｒ２０ Ｆ: ＣＣＴＣＴＴＣＴＡＡＴＣＴＴＡＣＣＧＡＡＧＣＡＲ: ＧＡＡＡＴＧＣＴＡＣＴＧＣＧＧＡＡＴＴＧＡ
(ＴＡ) ６ １２２ ６０ ＫＴ０３３４３８
ｌｏｂｅｌｓｓｒ２１ Ｆ: ＡＴＴＧＡＧＧＧＡＧＣＣＴＴＴＡＣＴＣＣＲ: ＧＣＧＡＡＴＴＴＴＧＧＣＡＡＧＧＴＴＴＡ
(ＡＧ) ９ １０８ ６０ ＫＴ０３３４３９
ｌｏｂｅｌｓｓｒ２２ Ｆ: ＡＡＴＡＴＣＡＡＧＧＴＡＧＡＡＣＡＣＡＡＧＡＡＣＴＣＡＲ: ＡＧＴＡＣＴＡＣＣＡＡＴＴＣＡＴＴＴＣＡＣＴＣＣＡ
(ＣＴ) ６ １０８ ５８ ＫＴ０３３４４０
ｌｏｂｅｌｓｓｒ２３ Ｆ: ＡＴＣＣＣＡＣＣＡＡＧＧＡＡＣＡＡＧＴＧＲ: ＴＣＣＣＴＡＴＴＴＣＣＴＴＣＣＣＴＴＴＧ
(ＣＴ) ７ １１１ ５９ ＫＴ０３３４４１
ｌｏｂｅｌｓｓｒ２４ Ｆ: ＡＣＴＴＴＣＴＴＴＣＡＣＧＣＣＧＡＣＡＧＲ: ＧＣＧＣＣＧＧＡＧＴＡＡＧＧＴＡＡＡＣ
(ＧＡ) ６ １１１ ６０ ＫＴ０３３４４２
ｌｏｂｅｌｓｓｒ２５ Ｆ: ＣＧＡＧＴＴＡＣＴＴＴＡＴＡＣＴＣＧＧＴＡＡＧＴＣＧＴＲ: ＣＧＡＴＣＡＡＴＣＡＴＴＣＡＴＴＣＡＴＴＣＡＴＴＴ
(ＧＡＡＴ) ５ １１１ ６０ ＫＴ０３３４４３
ｌｏｂｅｌｓｓｒ２６ Ｆ: ＴＴＴＧＧＣＡＡＡＧＣＴＡＣＣＡＡＡＣＣＲ: ＧＧＧＧＡＧＴＡＴＴＴＡＡＡＧＧＧＡＧＣＣ
(ＴＣ) ６ １１１ ６０ ＫＴ０３３４４４
ｌｏｂｅｌｓｓｒ２７ Ｆ: ＣＴＣＣＣＴＴＴＴＣＴＴＣＣＴＴＧＴＴＣＴＴＣＲ: ＴＣＴＣＣＡＧＣＡＡＴＴＣＴＣＣＡＡＧＧ
(ＡＧ) ６ １１３ ６０ ＫＴ０３３４４５
ｌｏｂｅｌｓｓｒ２８ Ｆ: ＡＡＧＧＡＧＧＡＡＧＡＡＧＡＧＡＡＡＡＣＴＣＡＡＲ: ＣＴＡＣＣＴＴＡＴＴＴＣＴＧＴＡＡＣＡＣＣＡＡＡＣＴＴ
(ＣＴ) ６ １１４ ６０ ＫＴ０３３４４６
１５８　 第 ６期　 　 　 　 　 　 米 奇等: 基于新一代高通量测序技术开发巨人半边莲 Ｌｏｂｅｌｉａ ｄｅｃｋｅｎｉｉ的 ＳＳＲ标记
　 续表 ３
引物编号
Ｐｒｉｍｅｒ ｃｏｄｅ
引物序列
Ｐｒｉｍｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ
(５′－３′)
重复基元
Ｒｅｐｅａｔ ｍｏｔｉｆ
目标片段大小(ｂｐ)
Ｅｘｐｅｃｔｅｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ
ｐｒｏｄｕｃｔ
退火温度
Ｔａ (°Ｃ)
ＧｅｎＢａｎｋ
ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ.
ｌｏｂｅｌｓｓｒ２９
Ｆ: ＡＡＧＡＡＴＴＴＴＧＣＡＡＡＧＧＧＡＡＧＡＡ
Ｒ: ＴＴＡＣＴＣＴＣＡＴＴＴＧＴＧＴＴＡＣＴＴＡＣＣＴＧＧ
(ＴＣ) ６ １１４ ５９ ＫＴ０３３４４７
ｌｏｂｅｌｓｓｒ３０
Ｆ: ＣＧＡＡＴＴＡＡＴＧＡＧＡＡＴＴＴＴＴＣＡＡＡＧＧ
Ｒ: ＣＣＴＣＣＡＴＡＴＴＣＴＴＡＣＣＴＧＧＧＣ
(ＴＣ) ９ １１５ ６０ ＫＴ０３３４４８
ｌｏｂｅｌｓｓｒ３１
Ｆ: ＴＣＣＴＣＣＣＴＡＴＴＴＴＣＣＴＴＧＧＣ
Ｒ: ＣＣＡＣＣＡＡＧＡＡＣＡＧＣＡＣＡＡＧＡ
(ＡＧ) ７ １１６ ６０ ＫＴ０３３４４９
ｌｏｂｅｌｓｓｒ３２
Ｆ: ＴＧＴＴＣＴＴＴＣＡＴＴＣＧＴＴＣＡＴＴＣＡＡ
Ｒ: ＴＣＧＡＧＴＴＡＣＴＴＴＡＴＡＣＴＣＧＧＴＡＡＧＴＣＴ
(ＴＴＣＡ) ５ １１８ ５９ ＫＴ０３３４５０
ｌｏｂｅｌｓｓｒ３３
Ｆ: ＣＣＴＡＧＧＣＡＧＣＣＡＧＡＧＡＧＴＧＡ
Ｒ: ＧＡＡＣＧＧＴＣＧＡＡＴＴＴＡＡＡＣＧＡＡ
(ＧＡ) ９ １１８ ６０ ＫＴ０３３４５１
ｌｏｂｅｌｓｓｒ３４
Ｆ: ＣＣＡＡＡＣＴＴＴＧＡＧＡＡＴＴＴＣＣＴＣＣ
Ｒ: ＣＣＡＧＣＡＡＴＴＣＴＣＴＴＣＡＡＣＡＡＡ
(ＧＡ) ６ １２０ ５９ ＫＴ０３３４５２
ｌｏｂｅｌｓｓｒ３５
Ｆ: ＴＣＧＣＴＧＣＴＣＡＴＣＣＴＣＡＣＣ
Ｒ: ＡＴＴＴＴＴＧＧＡＴＧＣＧＴＧＧＡＴＧＴ
(ＣＴＧ) ５ １２１ ６１ ＫＴ０３３４５３
ｌｏｂｅｌｓｓｒ３６
Ｆ: ＴＣＴＴＡＣＣＧＡＡＧＣＡＣＡＣＡＡＡＡＡ
Ｒ: ＡＧＧＡＡＴＧＡＡＧＣＴＣＧＧＣＡＡＴ
(ＡＴ) ６ １２３ ５９ ＫＴ０３３４５４
ｌｏｂｅｌｓｓｒ３９
Ｆ: ＣＣＴＣＡＡＴＣＣＡＧＴＡＴＣＣＴＴＣＣＡ
Ｒ: ＴＧＡＧＣＡＧＴＴＴＣＡＡＴＣＡＡＴＡＣＡＴＣＣ
(ＡＴ) ６ １３１ ６０ ＫＴ０３３４５５
ｌｏｂｅｌｓｓｒ４０
Ｆ: ＣＡＴＧＧＡＣＡＡＴＴＣＣＡＡＡＧＡＣＧ
Ｒ: ＣＴＣＴＴＧＧＴＴＧＣＣＴＴＧＡＴＴＧＣ
(ＡＡＧ) ６ １３４ ６０ ＫＴ０３３４５６
表 ４　 多态性 ＳＳＲ引物在巨人半边莲 １个居群 ２４株个体中的扩增
Ｔａｂｌｅ ４　 Ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ｐｒｉｍｅｒ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｉｎ ２４ ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｓ ｆｒｏｍ ｏｎｅ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｌ. ｄｅｃｋｅｎｉｉ
引物编号
Ｐｒｉｍｅｒ ｃｏｄｅ
等位基因数
ＮＡ
观测杂合度
Ｈｏ
期望杂合度
Ｈｅ
Ｗｒｉｇｈｔ’ｓ固定指数
ＦＩＳ
ｌｏｂｅｌｓｓｒ１ ６ ０.７８４７ ０.５８３３ ０.２５７
ｌｏｂｅｌｓｓｒ５ ６ ０.７９５ ０.６２５ ０.２１４
ｌｏｂｅｌｓｓｒ８ ９ ０.８５４ ０.８７５ －０.０２４
ｌｏｂｅｌｓｓｒ１３ ６ ０.７４７ ０.９１７ －０.２２８
ｌｏｂｅｌｓｓｒ１８ ４ ０.６３９ ０.０００ １.０００
ｌｏｂｅｌｓｓｒ１９ ６ ０.７９５ ０.９１７ －０.１５３
ｌｏｂｅｌｓｓｒ２０ ５ ０.７３３ ０.０４２ ０.９４３
ｌｏｂｅｌｓｓｒ２１ ４ ０.６８１ ０.０００ １.０００
ｌｏｂｅｌｓｓｒ２４ ８ ０.８３０ １.０００ －０.２０５
ｌｏｂｅｌｓｓｒ２７ ８ ０.８３７ ０.７５０ ０.１０４
ｌｏｂｅｌｓｓｒ３０ ５ ０.７１２ ０.３７５ ０.４７３
ｌｏｂｅｌｓｓｒ３１ ７ ０.８０２ ０.７９２ ０.０１３
ｌｏｂｅｌｓｓｒ３９ ４ ０.６２５ ０.０００ １.０００
ｌｏｂｅｌｓｓｒ４０ ８ ０.８３３ １.０００ －０.２００
　 　 Ｎｏｔｅｓ: ＮＡꎬ Ｎｏ. ｏｆ ａｌｌｅｌｅｓꎻ Ｈｏꎬ Ｏｂｓｅｒｖｅｄ ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｓｉｔｙꎻ Ｈｅꎬ Ｅｘｐｅｃｔｅｄ ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｓｉｔｙꎻ ＦＩＳꎬ Ｗｒｉｇｈｔ’ｓ ｆｉｘａｔｉｏｎ ｉｎｄｅｘ.
２５８ 植 物 科 学 学 报 第 ３３卷　
２　 讨论
巨人半边莲作为一类东非特有的珍稀植物ꎬ 关
于其居群遗传学的研究还比较少ꎬ 可能是因为可利
用的共显性分子标记有限ꎮ 本实验基于采用高通量
测序方法获得的大量基因组数据ꎬ 开发了巨人半边
莲 Ｌ. ｄｅｃｋｎｅｉ 的 ＳＳＲ 分子标记ꎬ 为研究该属植物
的保护遗传学提供了有效工具ꎮ
在本研究获得的 ５８ ９６６个 ＳＳＲ位点中ꎬ 单核
苷酸重复类型的比例高达 ４７􀆰６２％ꎬ 而二核苷酸重
复仅占 ３６􀆰２２％ꎬ 三核苷酸重复占 ２􀆰７７％ꎬ 这一结
果与多数植物基因组中二核苷酸和三核苷酸重复的
频率较高不同[９－１１]ꎮ 例如水生植物莕菜 (Ｎｙｍ￣
ｐｈｏｉｄｅｓ ｐｅｌｔａｔａ)花芽的转录组测序 ＥＳＴ 数据库中
共检测到 １２ ３１９个 ＳＳＲ位点ꎬ 其中二碱基和三碱
基重复类型 ＳＳＲ所占的比例较大ꎬ 分别为 ５７􀆰３１％
和 ３０􀆰８７％[９]ꎮ 另外ꎬ 二碱基和三碱基重复类型
ＳＳＲ所占的比例变化较大ꎬ 这种变化在一定程度
上与 ＳＳＲ 重复基元搜索时的相关参数设定有
关[１２]ꎮ 在植物 ＳＳＲ标记的开发中需要寻找一个相
对统一的 ＳＳＲ 检测参数ꎬ 而对于巨人半边莲这样
的一类特殊植物ꎬ 也需要尝试更多的参数ꎬ 从而寻
找一个合适的平衡点ꎮ 本文二核苷酸重复中ꎬ ＡＣ /
ＧＴ出现的比例最高ꎬ 为 １２􀆰 ９４％ꎬ ＣＧ / ＣＧ 最少ꎬ
为 ０􀆰 ０１％ꎻ 三核苷酸重复中ꎬ ＡＡＣ / ＧＴＴ 出现的比
例最高ꎬ 但仅为 ０􀆰 ６３％ꎬ 此结果与有些物种中的
分析数据一致ꎬ 如在莕菜[９]、 咖啡(Ｃｏｆｆｅａ ａｒａｂｉ￣
ｃａ) [１１]、 芝麻(Ｓｅｓａｍｕｍ ｉｎｄｉｃｕｍ) [１３]等物种中ꎬ
ＣＧ / ＣＧ在其二核苷酸重复中所占比例均较少ꎬ 而
三核苷酸重复中ꎬ ＡＡＣ / ＧＴＴ 重复出现的频率较
高ꎮ 但在其他物种如水稻(Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ)、 玉米
(Ｚｅａ ｍａｙｓ)和枳壳等中ꎬ ＧＧＣ / ＣＣＧ 在三核苷酸
重复中出现次数较多[１４ꎬ１５]ꎬ 不同物种间的核苷酸
重复类型的差异可能与其编码蛋白的使用频率有
关ꎮ
本实验共设计出 ３５５８ 对引物ꎬ 从中随机挑选
出的 ４０ 对 ＳＳＲ 引物的扩增效率达 ８０％ꎬ 这与
Ｇｕｐｔａ等开发的面包小麦(ｂｒｅａｄ ｗｈｅａｔ)ＳＳＲ 引物
的扩增结果一致[１２]ꎮ 我们利用筛选出的 ３２对 ＳＳＲ
引物对来自肯尼亚山巨人半边莲 Ｌ. ｄｅｃｋｎｅｉ 居群
的 ２４ 株个体进行 ＰＣＲ 扩增ꎬ 并分析了该居群的
遗传多样性ꎬ 结果显示有 １４ 对可扩增出稳定、
清晰且具有多态性的条带ꎬ 各 ＳＳＲ 位点的等位基
因数(ＮＡ)为 ４ ~９个ꎬ 观测杂合度(Ｈｏ)为 ０􀆰６２５ ~
０􀆰８５４ꎬ 表 明 该 居 群 遗 传 变 异 程 度 较 高[１３]ꎻ
Ｗｒｉｇｈｔ’ｓ指数(ＦＩＳ)中ꎬ 大多(９ 个)为正值ꎬ 仅少
数(５个)为负值ꎬ 表明该居群中存在过多的纯合
子[１６]ꎬ 这可能与巨人半边莲 Ｌ. ｄｅｃｋｅｎｉｉ 兼具克隆
繁殖和有性生殖 ２ 种繁殖方式有关[４ꎬ５ꎬ７ꎬ１７]ꎮ 另外ꎬ
本文所检测的 ２４ 株个体取自 １ 个较小的居群(位
于肯尼亚山的南坡)ꎬ 植株间较近的距离很可能促
进了近交的发生ꎬ 从而增加了纯合子的数量ꎮ
综上分析ꎬ 基于高通量测序获得的基因组序列
数据库开发 ＳＳＲ 标记是一种简单而高效的途径ꎮ
本研究共筛选出适合巨人半边莲 Ｌ. ｄｅｃｋｅｎｉｉ 居群
研究的 １４对 ＳＳＲ引物ꎬ 同时我们已经设计的但未
进行验证的 ＳＳＲ 引物也能为东非特有半边莲属植
物的保护遗传学研究提供丰富的遗传标记ꎮ 通过对
Ｌ. ｄｅｃｋｅｎｉｉ的基因组进行高通量测序ꎬ 有利于发
掘与其功能基因相关联的 ＳＳＲ 分子标记ꎬ 这将为
进一步阐明东非特有半边莲属植物的生态适应性提
供有效的研究工具ꎮ
参考文献:
[ １ ] 　 Ｋｎｏｘ ＥＢ. Ｔｈｅ ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎ ｓｔａｔｕｓ ｏｆ ｔｈｅ ｇｉａｎｔ ｓｅ￣
ｎｅｃｉｏｓ ａｎｄ ｇｉａｎｔ ｌｏｂｅｌｉａｓ ｉｎ ｅａｓｔｅｒｎ Ａｆｒｉｃａ [ Ｊ] .
Ｏｐｅｒａ Ｂｏｔꎬ １９９３ꎬ １２１: １９５－２１６.
[ ２ ] 　 Ｋｎｏｘ ＥＢꎬ Ｐａｌｍｅｒ ＪＤ. Ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔ ＤＮＡ ｅｖｉｄｅｎｃｅ
ｏｎ ｔｈｅ ｏｒｉｇｉｎ ａｎｄ ｒａｄｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｇｉａｎｔ ｌｏｂｅｌｉａｓ ｉｎ
ｅａｓｔｅｒｎ Ａｆｒｉｃａ[Ｊ] . Ｓｙｓｔ Ｂｏｔꎬ １９９８ꎬ ２３(２): １０９－
１４９.
[ ３ ] 　 Ｍａｇｏｍｂｏ ＺＬＫꎬ Ｍｂｅｉｚａꎬ Ｎｄｉｒｉｔｕ Ｎꎬ Ｎｄｉｒｉｔｕꎬ Ｇ. Ｇ.
Ｌｏｂｅｌｉａ ａｂｅｒｄａｒｉｃａ. Ｔｈｅ ＩＵＣＮ Ｒｅｄ Ｌｉｓｔ ｏｆ Ｔｈｒｅａ￣
ｔｅｎｅｄ Ｓｐｅｃｉｅｓ ２００４: ｅ. Ｔ４４７１５Ａ１０９３９９２７. ｈｔ￣
ｔｐ: / / ｄｘ. ｄｏｉ. ｏｒｇ / １０. ２３０５ / ＩＵＣＮ. ＵＫ. ２００４. ＲＬＴＳ.
Ｔ４４７１５Ａ１０９３９９２７.ｅｎ
[ ４ ] 　 Ｍｕｌｕｇｅｔａ Ｋꎬ Ｄｏｒｏｔｈｅｅ Ｅꎬ Ｐｉｅｒｒｅ Ｔꎬ Ｓｉｌｅｓｈｉ Ｎꎬ
Ｃｈｒｉｓｔｉａｎａ Ｂ. Ｐｈｙｌｏｇｅｏｇｒａｐｈｙ ａｎｄ ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎ
ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｏｆ ａ ｇｉａｎｔ ｌｏｂｅｌｉａ ( Ｌｏｂｅｌｉａ ｇｉｂｅｒｒｏａ) ｉｎ
Ｅｔｈｉｏｐｉａｎ ａｎｄ Ｔｒｏｐｉｃａｌ Ｅａｓｔ Ａｆｒｉｃａｎ ｍｏｕｎｔａｉｎｓ[Ｊ] .
Ｍｏｌ Ｅｃｏｌꎬ ２００７ꎬ １６(６): １２３３－１２４３.
[ ５ ] 　 Ｌｉａｏ ＹＹꎬ Ｙｕｅ ＸＬꎬ Ｇｕｏ ＹＨꎬ Ｇｉｔｕｒｕ ＷＲꎬ Ｗａｎｇ ＱＦꎬ
３５８　 第 ６期　 　 　 　 　 　 米 奇等: 基于新一代高通量测序技术开发巨人半边莲 Ｌｏｂｅｌｉａ ｄｅｃｋｅｎｉｉ的 ＳＳＲ标记
Ｃｈｅｎ ＪＭ. Ｇｅｎｏｔｙｐｉｃ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ａｎｄ ｇｅｎｅｔｉｃ ｓｔｒｕｃ￣
ｔｕｒｅ ｏｆ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｔｈｅ ｄｉｓｔｙｌｏｕｓ ａｑｕａｔｉｃ ｐｌａｎｔ
Ｎｙｍｐｈｏｉｄｅｓ ｐｅｌｔａｔａ (Ｍｅｎｙａｎｔｈａｃｅａｅ) ｉｎ Ｃｈｉｎａ
[Ｊ] . Ｊ Ｓｙｓｔ Ｅｖｏｌꎬ ２０１３ꎬ ５１ (５): ５３６－５４４.
[ ６ ] 　 高洁ꎬ 李巧明. 羽叶金合欢的 ＤＮＡ提取和 ＳＳＲ引物
筛选[Ｊ] . 云南植物研究ꎬ ２００８ꎬ ３０(１): ６４－６８.
[ ７ ] 　 程小毛ꎬ 黄晓霞. ＳＳＲ 标记开发及其在植物中的应
用[Ｊ] . 中国农学通报ꎬ ２０１１ꎬ ２７(０５): ３０４－３０７.
[ ８ ] 　 Ｌｉ Ｒꎬ Ｚｈｕ Ｈꎬ Ｒｕａｎ Ｊꎬ Ｑｉａｎ Ｗꎬ Ｆａｎｇ Ｘꎬ Ｓｈｉ Ｚꎬ Ｌｉ
Ｙꎬ Ｌｉ Ｓꎬ Ｓｈａｎ Ｇꎬ Ｋｒｉｓｔｉａｎｓｅｎ Ｋꎬ Ｌｉ Ｓꎬ Ｙａｎｇ Ｈꎬ
Ｗａｎｇ Ｊꎬ Ｗａｎｇ Ｊ. Ｄｅ ｎｏｖｏ ａｓｓｅｍｂｌｙ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｇｅ￣
ｎｏｍｅｓ ｗｉｔｈ ｍａｓｓｉｖｅｌｙ ｐａｒａｌｌｅｌ ｓｈｏｒｔ ｒｅａｄ ｓｅｑｕｅｎ￣
ｃｉｎｇ[Ｊ] . Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓꎬ ２０１０ꎬ ２０(２): ２６５－２７２.
[ ９ ] 　 袁阳阳ꎬ 王青锋ꎬ 陈进明. 基于转录组测序信息的
水生植物莕菜 ＳＳＲ 标记开发[ Ｊ] . 植物科学学报ꎬ
２０１３ꎬ ３１(５): ４８５－４９２.
[１０] 　 Ｙｅｈ ＦＣ Ｂ. Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ｇｅｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｃｏｄｏｍｉ￣
ｎａｎｔ ａｎｄ ｄｏｍｉｎａｎｔ ｍａｒｋｅｒｓ ａｎｄ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｔｒａｉｔｓ
[Ｊ] . Ｂｅｌｇｉａｎ Ｊ Ｂｏｔꎬ １９９７ꎬ １２９: １５７.
[１１] 　 Ａｇｇａｒｗａｌ ＲＫꎬ Ｈｅｎｄｒｅ ＰＳꎬ Ｖａｒｓｈｎｅｙ ＲＫꎬ Ｂｈａｔ
ＰＲꎬ Ｋｒｉｓｈｎａｋｕｍａｒ Ｖꎬ Ｓｉｎｇｈ Ｌ. Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｃｈａｒ￣
ａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ＥＳＴ ｄｅｒｉｖｅｄ ｇｅｎｉｃ ｍｉ￣
ｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅ ｍａｒｋｅｒｓ ｆｏｒ ｇｅｎｏｍｅ ａｎａｌｙｓｅｓ ｏｆ ｃｏｆｆｅｅ
ａｎｄ ｒｅｌａｔｅｄ ｓｐｅｃｉｅｓ[Ｊ] . Ｔｈｅｏｒ Ａｐｐｌ Ｇｅｎｅｔꎬ ２００７ꎬ
１１４(２): ３５９－３７２.
[１２] 　 Ｇｕｐｔａ ＰＫꎬ Ｖａｒｓｈｎｅｙ ＲＫ. Ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ
ｕｓｅ ｏｆ ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅ ｍａｒｋｅｒｓ ｆｏｒ ｇｅｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ
ａｎｄ ｐｌａｎｔ ｂｒｅｅｄｉｎｇ ｗｉｔｈ ｅｍｐｈａｓｉｓ ｏｎ ｂｒｅａｄ ｗｈｅａｔ
[Ｊ] . Ｅｕｐｈｙｔｉｃａꎬ ２０００ꎬ １１３(３): １６３－１８５.
[１３] 　 Ｗｅｉ ＷＬꎬ Ｑｉ ＸＱꎬ Ｗａｎｇ ＬＨꎬ Ｚｈａｎｇ ＹＸꎬ Ｈｕａ Ｗꎬ Ｌｉ
ＤＨꎬ Ｌｖ ＨＸꎬ Ｚｈａｎｇ ＸＲ. Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ
ｓｅｓａｍｅ (Ｓｅｓａｍｕｍ ｉｎｄｉｃｕｍ Ｌ.) ｇｌｏｂａｌ ｔｒａｎｓｃｒｉｐ￣
ｔｏｍｅ ｕｓｉｎｇ Ｉｌｌｕｍｉｎａ ｐａｉｒｅｄ￣ｅｎｄ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ａｎｄ
ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ＥＳＴ￣ＳＳＲ ｍａｒｋｅｒｓ [ Ｊ] . ＢＭＣ Ｇｅ￣
ｎｏｍｉｃｓꎬ ２０１１ꎬ １２(１): ４５１－４６３.
[１４] 　 杨春霞ꎬ 温强ꎬ 叶金山ꎬ 朱培林. 枳壳 ＥＳＴ￣ＳＳＲ 标
记的开发[Ｊ] . 分子植物育种ꎬ ２０１１ꎬ ９(１): １２３－
１２７.
[１５] 　 Ｋａｎｔｅｔｙ ＲＶꎬ Ｌａ Ｒｏｔａ Ｍꎬ Ｍａｔｔｈｅｗｓ ＤＥꎬ Ｓｏｒｒｅｌｌｓ
ＭＥ. Ｄａｔａ ｍｉｎｉｎｇ ｆｏｒ ｓｉｍｐｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｒｅｐｅａｔｓ ｉｎ
ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｔａｇｓ ｆｒｏｍ ｂａｒｌｅｙꎬ ｍａｉｚｅꎬ
ｒｉｃｅꎬ ｓｏｒｇｈｕｍ ａｎｄ ｗｈｅａｔ [ Ｊ ] . Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌꎬ
２００２ꎬ ４８(５－６): ５０１－５１０.
[１６] 　 向华ꎬ 毛盛贤. 固定指数理论及其在遗传育种中的
应用[Ｊ] . 遗传ꎬ １９９５ꎬ １７(Ｓ１): ６３－７０.
[１７] 　 Ｔｒｕｍａｎ ＰＹ. Ｔｈｅ ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ｄｅｍｏｇｒａｐｈｙ ｏｆ
ｓｅｍｅｌｐａｒｏｕｓ Ｌｏｂｅｌｉａ ｔｅｌｅｋｉｉ ａｎｄ ｉｔｅｒｏｐａｒｏｕｓ Ｌｏｂｅ￣
ｌｉａ ｋｅｎｉｅｎｓｉｓ ｏｎ Ｍｏｕｎｔ Ｋｅｎｙａ[ Ｊ] . Ｊ Ｅｃｏｌꎬ １９８２ꎬ
７２ (２): ６３７－６５０.
(责任编辑: 刘艳玲)
４５８ 植 物 科 学 学 报 第 ３３卷