全 文 ：　[ 收稿日期] 2005-05-23　　　[ 修回日期] 2005-07-26
＊[ 基金项目] 教育部高等学校博士学科点专项科研基金资助项目(No.39730210);山东省自然科学基金资助项目(No.
Q2004C03);山东省医药卫生科研项目
■通讯作者 Tel:0531-8382044;E-mail:huweicheng@sdu.edu.cn
[ 文章编号] 　1000-4718(2006)01-0026-05
半边莲生物碱抑制内皮素-1诱导的人脐
动脉平滑肌细胞增殖＊
王婧婧1 , 　范秀珍2 , 　刘尚明1 , 　任冬梅3 , 　陈　融1 , 　李　莉1 , 　胡维诚1■
(山东大学 1医学院 , 2护理学院 , 3药学院 , 山东 济南 250012)
　　[ 摘　要] 　目的:探讨半边莲生物碱(LCLA)对内皮素-1(ET-1)诱导人脐动脉平滑肌细胞(VSMC)增殖的抑制
效应及其作用机制。方法:采用细胞计数 、[ 3H] -TdR掺入 、流式细胞术 、免疫细胞化学染色及Fura-3/AM 荧光探针
标记方法检测 VSMC 增殖;并用台盼蓝拒染 、乳酸脱氢酶(LDH)检测方法观察 LCLA 对 VSMC 的毒性反应。结果:
LCLA(100 、200 和 400 mg/L)、BQ-123(10-6mol/ L)、ST(10-7mol/ L)均抑制 ET-1所诱导的 VSMC 增殖(均 P<0.05):
明显降低VSMC的细胞数目 、[ 3H] -TdR掺入量 、S 期和 G2/M期的数目百分比 , 增加 G0/G1期的数目百分比;减弱细
胞内增殖细胞核抗原(PCNA)的表达强度和 Ca2+荧光强度;LCLA 的抑制作用存在明显的剂量依赖关系 , 但对 VSMC
存活率和 LDH 释放量均没有影响。结论:LCLA浓度依赖性地抑制 ET-1 所诱导的人脐动脉 VSMC 增殖 ,其机制与
降低VSMC内 Ca2+含量有关。
[ 关键词] 　半边莲属;内皮缩血管肽类;肌 ,平滑;细胞增殖
　　[ 中图分类号] 　R363　　　　　[文献标识码] 　A
Inhibitory effects of Lobelia Chinensis Lour alkaloid on the proliferation of
human umbilical artery vascular smooth muscle induced by endothelin-1
WANG Jing-jing1 , FAN Xiu-zhen2 , LIU Shang-ming1 , REN Dong-mei3 , CHEN Rong1 ,
LI Li
1 , HU Wei-cheng1
(1School of Medicine , 2School of Nursing , 3School of Pharmaceutical Sciences , Shandong University , Jinan 250012 , China)
　　[ ABSTRACT] 　AIM:To investigate the effects of Lobelia Chinensis Lour alkaloid(LCLA)on the proliferation of cultured
vascular smooth muscle cells(VSMC)induced by ET-1.METHODS:Human umbilical artery VSMC was cultured and divided
into five groups:ET group , ET+LCLA group , ET+BQ-123 group , ET+ staurosporine(ST)group and control group.The cell
proliferation activity was subsequently quantified by cell counting kit-8(CCK-8)and [ 3H] -TdR incorporation.Flow cytometry
was used to examine cell cycle.Quantitative immunohistochemical technique was used to investigate the expression of proliferating
cell nuclear antigen(PCNA)and confocal microscope was used to measure the fluorescent intensity of Ca2+.Cytotoxicity was mea-
sured by Trypan blue exclusion and LDH colorimetry tests.RESULTS:BQ-123 (10-6mol/L), ST(10-7mol/ L)and LCLA
(100 , 200 and 400 mg/L)inhibited the increase in cell number , [ 3H] -TdR incorporation , the percentage of the S phase and
markedly decreased the expression of PCNA and fluorescent intensity of Ca2+ in response to ET-1 of VSMC(P <0.05).CON-
CLUSION:LCLA(100-400 mg/L)inhibits ET-1-induced proliferation of VSMC in a dose-dependent manner and the anti-
proliferative effect is realized by reducing the Ca2+ concentration in VSMC.
　　[ KEY WORDS] 　Lobelia;Endothelins;Muscle , smooth;Cell proliferation
　　内皮素(endothelin , ET)与某些蛇毒如角蝰毒素
(sarafotoxin)有共同的祖基因 、同源染色体结构和相
似的生物学效应[ 1] 。近年来发现传统的抗蛇毒中草
药在拮抗 ET作用 、阻断内皮素受体(endothelin recep-
tor ,ETR)、抑制血管平滑肌细胞(vascular smooth mus-
cle cell , VSMC)增殖方面 ,有着一定的作用[ 2] 。本实
·26· 中国病理生理杂志　Chinese Journal of Pathophysiology　2006 , 22(1):26-30
验室也发现含有抗蛇毒中药半边莲(Lobelia Chinensis
Lour)的清热解毒液可以使高脂血症大鼠的内皮细胞
合成和释放ET -1 减少[ 3 ] ,进而发现半边莲生物碱
(Lobelia Chinensis Lour alkaloid , LCLA)可显著降低高
脂血症大鼠血清 ET -1 含量和抑制主动脉中膜
VSMC增殖[ 4] 。本研究旨在观察 LCLA 对 ET -1 诱
导的人脐动脉 VSMC 增殖的抑制作用 ,并作相关机
制探讨 ,为其在临床上防治冠状动脉硬化 、高血压和
动脉成形术后再狭窄等内皮素相关性疾病提供一定
的理论依据。
材　料　和　方　法
1　材料 、主要试剂
　　人脐带由山东大学齐鲁医院妇产科提供。
ET-1 、BQ-123 、ST 、台盼蓝 、二甲基亚枫(DMSO)等
购自 Sigma 公司;DMEM 、胰蛋白酶 、新生小牛血清
(NCS)等购自 Gibco 公司;氚标胸腺嘧啶脱氧核苷
([ 3H] -TdR)购自中国原子能研究所;Fluo -3/AM 、
Pluronic F127购于 Biotium 公司 。Cell counting kit-8
(CCK-8 kit)购自日本株式会社同仁化学研究所;α
-actin 、PCNA 单克隆抗体 、免疫组化 SP 试剂盒购于
福州迈新生物技术公司 ,LDH 测试盒购自南京建成
生物工程研究所;其它试剂均为进口或国产分析纯 。
2　方法
2.1 　半边莲生物碱(LCLA)的制备　由山东大学药
学院天然药物化学教研室提供 。半边莲产自广东
省 ,所提取 LCLA 主要成分为:山梗菜碱 、山梗菜酮
碱 、山梗菜醇碱 、异山梗菜酮碱 , 纯度 >95%。将
LCLA溶于 DMSO中 ,并以条件培养液(含 0.2%NCS
的DMEM培养液)配成所需浓度 ,DMSO 的最终浓度
均小于0.01%。
2.2 　人脐动脉平滑肌细胞培养及鉴定　无菌条件
下取健康产妇分娩后新鲜的婴儿脐带 ,组织块贴壁
法进行 VSMC 培养 。倒置显微镜和α-actin免疫组
化染色阳性证实为VSMC ,纯度>95%。待细胞生长
融合出现“峰与谷”结构后 ,用含 0.25%胰蛋白酶消
化液消化 、传代培养 。选 3-8代细胞用于实验。
2.3 　CCK-8 kit计数 VSMC数目　按细胞密度 0.4
×108cells/L 将 VSMC 接种于 96 孔培养板 , 每孔
0.1 mL ,细胞生长至次融合状态时 , 更换无血清
DMEM饥饿培养 24 h ,使细胞同步化于G0/G1期。根
据不同的实验分组加药:①对照组 , 0.2%NCS 的条
件培养液;②ET组 ,ET-1 终浓度为 10-7mol/L 的条
件培养液;③ET+LCLA 组 ,ET -1(10-7mol/L)+不
同剂量的 LCLA(终浓度为 100 、200和 400 mg/L);④
ET +BQ -123 组 , ET -1(10-7mol/L)+BQ -123
(10-6mol/L)的条件培养液;⑤ET +ST 组 , ET -1
(10-7mol/L)+ST(10-7mol/L)的条件培养液 。孵育
24 h后参照CCK-8 kit说明书在酶标仪 450 nm波长
处读取还原的WST-8[其化学名称为 2-(2-甲氧
基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2 , 4-
二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐]的吸光度值(A),WST
-8可被细胞线粒体中的脱氢酶还原为高度水溶性
的黄色甲月赞染料 ,生成的甲月赞物的数量与细胞的数目
成正比 ,因此可利用这一特性对实验各组进行分析 。
2.4 　[ 3H] -TdR掺入法反映 VSMC的 DNA 合成量
　将VSMC 消化分离制成细胞悬液 ,调整密度为 5×
10
7
cells/L 种入24孔培养板 ,按以上实验分组及给药
方案对细胞处理后 ,继续孵育 18 h ,向各孔培养液中
加入[ 3H] -TdR至终浓度为 3.7×104 Bq/well ,孵育
8 h ,加入冷 PBS液终止反应。回收细胞 ,液体闪烁计
数仪行放射活性计数测定 。
2.5 　免疫细胞化学染色检测 VSMC增殖细胞核抗
原(PCNA)的表达水平　VSMC 消化传代至 6孔培养
板上(板内预先置入 1 cm2 消毒盖玻片), 按以上实
验分组及给药方案对细胞处理后 ,取出盖玻片 ,按照
免疫组化试剂盒步骤检测 PCNA的表达。采用 Sim-
plePCI(Compix , Inc.)图像测量软件对各组阳性切片
进行图像分析 ,统计其平均吸光度值 ,客观定量细胞
中PCNA的表达水平。
2.6 　流式细胞仪检测 VSMC 周期　实验分组及给
药方案同上 。消化收集各组细胞 ,用 PBS 洗 2 次制
成单细胞悬液 , 70%冷乙醇固定 , 调整细胞浓度为
109 cells/L ,加入 RNase 消化 , PBS 洗涤 ,加碘化丙啶
(PI)反应 30 min , 过滤后用流式细胞仪分析测定细
胞周期各阶段的细胞所占检测细胞数的比例 。
2.7 　激光共聚焦显微镜检测 VSMC 内游离 Ca2+　
将VSMC接种于 35 mm Petri细胞培养皿中 , 按以上
实验分组及给药方案处理细胞 , HEPES 缓冲液
(mmol/L:NaCl 118 , KCl 4.8 ,CaCl2 2.5 , KH2PO4 1.2 ,
HEPES 5 ,葡萄糖 10。NaOH 调 pH 至 7.4)洗涤 2遍 ,
加入终浓度为 10 μmol/L 的 Fura -3/AM 37 ℃负载
40 min ,染色结束后再用 HEPES 缓冲液洗涤 2次 ,立
即置于激光扫描共聚焦显微镜下观察 ,激发波长为
488 nm ,每个处理组选取大约30个细胞 ,记录平均荧
光强度 ,以此来衡量 VSMC内 Ca2+的水平。
2.8 　不同浓度 LCLA对VSMC的细胞毒性实验　细
胞接种于 96孔培养板内 ,在不同浓度(0 、100 、200和
·27·
400 mg/L)的 LCLA 溶液中孵育 48 h ,观察细胞的毒
性反应(变性 、坏死 、脱落),台盼蓝染色排斥实验计
算细胞存活率 ,并按 LDH 测试盒说明用紫外分光光
度计测定 LDH 释放量。
3　统计学处理
　　检测结果均以 x ±s 表示 ,统计学分析用 SPSS
12.0软件进行单因素方差分析(One-way ANOVA),
多样本均数之间两两比较采用 q检验。
结　　果
1　VSMC细胞鉴定
　　倒置相差显微镜下观察 ,细胞呈长梭形放射状
生长 ,细胞疏密相间 ,呈典型峰-谷状排列(图 1A)。
α-actin平滑肌细胞单克隆抗体免疫细胞化学检测 ,
可见 90%细胞胞浆中有大量与细胞长轴平行的细丝
状棕褐色免疫反应产物(图 1B)。
2　CCK-8 检测实验各组药物对 VSMC增殖的影
响
　　由表 1可知与对照组相比 , ET -1 可明显增加
VSMC内WST 的吸光度值 ,表明细胞的数目增加 ,增
殖活性增强;BQ-123和 ST 均抑制 ET-1所诱导的
VSMC增殖(P<0.01);LCLA预孵育使 ET-1诱导的
VSMC吸光度值呈剂量依赖性下降。
3　[ 3H] -TdR掺入法检测实验各组药物对 VSMC
的 DNA合成量的影响
　　ET-1使VSMC[ 3H] -TdR掺入量明显高于对照
组(P <0.01), BQ-123和 ST 均抑制 ET -1所诱导
的VSMC增殖(P <0.01);LCLA预孵育使 ET -1诱
导的VSMC的[ 3H] -TdR掺入量呈剂量依赖性下降 ,
见表 1。
4　各组药物对 VSMC的 PCNA表达活性的影响
　　PCNA的免疫阳性染色位于细胞核 ,呈棕褐色 ,
核着色深浅不一(图 2)。图像分析结果为:ET 组
VSMC 中的 PCNA 表达较对照组明显上调(P <
0.01),而 ET+LCLA(200和 400 mg/L)组 、ET+BQ-
123或 ST 均可下调 VSMC 的 PCNA 的表达率(P <
0.01),100 mg/L的 LCLA对此没有影响 ,见表 1。
5　各组药物对 VSMC细胞周期分布的影响
　　ET -1 刺激 VSMC 由静止期(G0/G1 期)进入
DNA合成期(S 期)和有丝分裂期(G2/M 期), 其中
G0/G1 期细胞比例显著低于对照组(P<0.01),而 S
期与 G2/M 期细胞显著高于对照组(P <0.01)。
100 mg/L 的 LCLA对上述变化无明显影响 ,而 BQ-
123 、ST 、LCLA(200和400 mg/L)均显著缓解ET-1所
致的变化(P <0.01)。LCLA具有一定的浓度-效应
依赖性 ,见表 2和图 3。
6　各组药物对 VSMC内钙荧光强度的影响
　　表 1 、图4结果显示 ,ET 组VSMC游离 Ca2+浓度
明显高于正常组(P <0.01), ET +LCLA 组 、ET +BQ
-123组 、ET+ST 组 VSMC 的 Ca2+浓度均显著低于
ET 组(P<0.05)。
7　不同浓度 LCLA对 VSMC的毒性反应
　　表 3所示 ,倒置显微镜下各浓度 LCLA组细胞生
长良好 ,形态正常 ,无细胞脱失区 ,无细胞碎片 。台
盼蓝拒染实验显示 ,各浓度组细胞存活率均大于
95%,上清液 LDH 含量差异无显著(P>0.05)。
讨　　论
　　本研究证实了 ET -1 能显著促进人脐动脉
VSMC增殖 ,并可被 ETAR特异性拮抗剂 BQ-123和
PKC非特异性抑制剂 ST所消弱 ,说明 ET -1致人脐
动脉VSMC增殖的机制可能为:ET -1作用于 VSMC
的 ETAR 使细胞内 PKC 活性和 Ca2+含量增加。
Hafizi等[ 5]也发现 ET -1可促进培养的人冠状动脉
平滑肌细胞增殖 ,并被 ETAR拮抗剂 BQ-123 所拮
抗 ,Piacentini等[ 6]证实 ET -1通过细胞外信号转导
表 1　各组药物对 VSMC [ 3H] -TdR掺入 、CCK-8、PCNA活性和 Ca2+荧光强度影响的比较
Tab 1　Comparison of [ 3H] -TdR incorporation and integral absorbance of CCK-8 , PCNA activity and Ca2+ fluorescent intensity of VSMC
( x±s.n=5)
Group CCK-8(A) [ 3H] -TdR(counts·min-1/well) PCNA(A) Ca2+(A)
Control 3.9±0.4 1 595.6±34.3 303.6±39.2 843.7±47.6
ET(10-7mol/L) 7.8±0.9■■ 1 979.4±11.1■■ 495.8±18.3■■ 1 193.8±49.4■■
ET+LCLA(100 mg/ L) 7.2±0.2＊ 1 940.8±35.6＊ 480.2±19.8 1 108.2±17.2＊
ET+LCLA(200 mg/ L) 6.3±0.8＊＊ 1 867.8±23.9＊＊ 437.8±18.7＊＊ 1 041.7±24.0＊＊
ET+LCLA(400 mg/ L) 5.5±0.3＊＊ 1 713.6±27.7＊＊ 397.8±14.6＊＊ 941.0±32.3＊＊
ET+BQ-123(10-6mol/ L) 5.2±0.4＊＊ 1 689.4±32.9＊＊ 394.2±17.3＊＊ 968.5±26.7＊＊
ET+ST(10-7mol/ L) 5.8±0.1＊＊ 1 756.6±25.7＊＊ 416.8±21.5＊＊ 938.3±23.6＊＊
　■■P<0.01 vs control group;＊P<0.05 , ＊＊P<0.01 vs ET group.
·28·
Fig 3　Cell cycle progression of VSMC in different groups.A:control group;B:ET group;C:ET+200 mg/L LCLA group;D:ET+
BQ-123 group;E:ET+ST group.
图 3　实验各组 VSMC的细胞周期
激酶 、PKC 启动细胞周期 , 促进细胞增殖。Shimoda
等[ 7]报道了 PKC 抑制剂 ST 可抑制 ET -1对人肺动
脉VSMC 的增殖反应和细胞内 Ca2+含量增加 ,均与
本文观点一致。但 Xu等[ 8]报道在大鼠心肌细胞 ,ST
加强了 ET-1促细胞内Ca2+增高的反应。所以一些
学者认为 ,根据不同的细胞类型 ,ET-1促细胞增殖
的信号转导通路可分为 PKC 完全依赖型[ 6 , 7] 、PKC部
分依赖型[ 9]和 PKC 非依赖型[ 8 ,10] 。
　　LCLA为传统抗蛇毒中草药半边莲的有效成分 ,
本研究证明它可呈浓度-效应依赖性抑制 ET-1所
诱导的 VSMC的增殖活性。台盼蓝拒染实验和培养
液LDH 检测证明 LCLA对VSMC无细胞毒性作用 ,说
·29·
表 2　各组细胞周期时相百分比结果
Tab 2　Distribution of cell cycle phases in different groups( x±s.n =4.%)
Group
Cell cycle
G0/ G1 G2/M S S+G2/M
Control 90.36±1.16 6.19±0.29 2.49±0.76 9.64±1.16
ET(10-7mol/ L) 77.89±3.98■■ 12.64±2.71■■ 8.25±1.23■■ 22.10±3.99■■
ET+LCLA(100 mg/ L) 79.60±0.85 11.65±0.59 7.01±0.54 20.46±0.97
ET+LCLA(200 mg/ L) 84.40±0.63＊＊ 9.56±0.39＊＊ 4.13±0.30＊ 15.60±0.63＊＊
ET+LCLA(400 mg/ L) 86.79±2.16＊＊ 7.73±0.69＊＊ 2.87±0.76＊＊ 13.21±2.16＊＊
ET+ST(10-7mol/L) 85.97±2.22＊＊ 7.67±0.75＊＊ 4.90±1.05＊ 14.03±2.22＊＊
ET+BQ-123(10-6mol/ L) 87.22±1.11＊＊ 7.14±0.26＊＊ 3.81±0.70＊＊ 12.78±1.11＊＊
　■■P<0.01 vs control group;＊P<0.05 , ＊＊P<0.01 vs ET group.
表 3　不同浓度 LCLA 对 VSMC生存率和细胞上清液 LDH
的影响
Tab 3　Cell survival rate and lactate dehydrogenase in growing cul-
tures of vascular smooth muscle cells after exposure to differ-
ent of LCLA( x±s.n=6)
Group
Survival rate
of cells(%)
LDH
(U/ L)
Control 97.5±4.1 87.9±19.2
LCLA(100 mg/L) 98.1±5.5 86.5±14.8
LCLA(200 mg/L) 97.4±6.3 88.5 ±15.4
LCLA(400 mg/L) 97.1±5.9 87.1±21.3
明LCLA具有抑制 ET -1 所诱导的 VSMC 增殖的作
用 ,并非细胞坏死所致。在含钙培养液中 , LCLA 可
拮抗 ET-1促进的 VSMC 中 Ca2+含量持续性增加 ,
并呈浓度-效应依赖性 ,这可能是 LCLA发挥抑制
ET-1诱导的VSMC增殖作用途径之一 。
　　本研究还利用免疫细胞化学染色技术观察了
VSMC中 PCNA的表达活性。PCNA是 DNA 聚合酶δ
的辅助蛋白 ,表达具有细胞周期依赖性 ,其含量在细
胞周期的G1期开始增加 ,S 期达到高峰 ,G2 、M 期降
低 ,G0期不能检测到。因此检测 PCNA 是评价细胞
增殖状态的可靠指标[ 11] 。本结果表明ET-1使人脐
动脉VSMC 表达 PCNA 增强 , LCLA(200 、400 mg/L)、
BQ-123 、ST 组能显著抑制 ET-1诱导的 PCNA蛋白
表达 ,使 DNA不能复制 ,细胞停滞于 G0 期 。从流式
细胞仪测定结果也可看出 ,LCLA(200 、400 mg/L)、BQ
-123 、ST 组抑制 ET-1诱导的VSMC增殖主要是细
胞由G0/G1期进入 S期过程受阻 ,致 G2/M 期细胞减
少 ,这种作用可能是其抑制 VSMC 增殖的重要机制
之一 。
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