全 文 ：姜果实资源的合理开发与利用 。
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[ 收稿日期] 2010-03-03
[作者简介] 陈镜楼 ,男 , 硕士 , 13297965238 , E-mai l:shanghuchuan@126.com 　[ 通讯作者] 阮金兰 , 男 ,教授 , 电话:027-83692311 , E-m ail:
shanghuchuan@sohu.com
正交试验法优选普通针毛蕨地上部位总黄酮提取纯化工艺
陈镜楼 ,刘瑜洁 ,阮金兰 ,蔡亚玲　(华中科技大学同济药学院 , 湖北省天然药物化学与资源评价重点实验室 , 湖北 武汉
430030)
[ 摘要] 　目的:优选普通针毛蕨地上部位总黄酮提取和纯化工艺条件。方法:以总黄酮提取率为考查指标 , 液料比 、提取次
数 、提取时间 、乙醇浓度为考察因素 ,选用 L9(34)表对提取工艺进行正交试验。以总黄酮提取率 、总黄酮纯度和主要活性成分
原芹菜素(pro toapig enone)物质为考查指标 ,用高效液相色谱法测定原芹菜素含量 , 以加碱水量 , 加碱水次数 , 碱水 pH 值 ,加
酸后 pH 为影响因素 ,选用 L9(34)表对纯化工艺进行正交试验。结果:普通针毛蕨总黄酮提取最佳工艺为 20 倍量 75%乙醇
提取 3 次 ,每次1.5 h。纯化条件为药材醇提浸膏加 2 倍量 pH 9 的氢氧化钠溶液 ,提取 2 次 ,提取液用浓盐酸调节为 pH 1。
结论:优选工艺获得的总黄酮提取率 , 纯度和原芹菜素含量较高。本方法合理 , 便于生产。
[ 关键词] 　正交设计;普通针毛蕨;总黄酮
[ 中图分类号] R284.2　　[ 文献标识码] A　　[ 文章编号] 1001-5213(2010)23-1969-04
Study on extraction and purification processes for the total flavonoids of the aerial parts of Mac-
rothel ypteris torresiana (Gaud.)Ching by orthogonal test
CHEN Jing-lou , LIU Yu-jie , RUAN Jin-lan , CAI Ya-ling(College of Pharmacy , Tongji Medica l Center of Hua-
zhong Univ ersity of Science and Technology , H ubei Key Labo ra to ry of Na tural Medicinal Chemistry and Resoures Eva luation ,
Hubei Wuhan 430030 , China)
ABSTRACT:OBJECTIVE　To optimize the conditions of ex traction and purification processe s for the to tal flav onoids o f the ae r-
ial par ts o f Macrothelypteris torresiana.METHODS　Or thogonal test w as used fo r study ing the effects of alcohol concentra-
tion , volume , extr action time and the number of times on the content of total flavonoids , and the effects o f alka li ex tractions
pH , volume , the numbe r of time s and acid precipita tions pH on the content of pr otoapig enone , purity quotient and ex traction
rates.RESULTS　The optimal ex traction pro cess is as fo llow:20 times of 75% alcoho l , 3 times o f e xtr action and each for 1.5
hours.The optimal purification pro cess is as fo llow :20 time s of pH 9 alkali ex traction , 2 times of ex traction and pH 1 acid pre-
cipitation.CONCLUSION　The ex traction and purification pr ocesses are reasonable and fit fo r industrialism.
KEY WORDS:or thogona l test;Macrothelypteris torresiana ;the to tal flavonoids
　　普通针毛 蕨 [ Macrothelypteris torresiana
(G aud.)Ching]为金星蕨科(Thelypteridaceae)针
毛蕨属(Macro thelypteris)植物 ,含有大量黄酮类成
分 ,民间应用其地下部位治疗肿瘤[ 1] 。本课题组前
期研究发现 ,普通针毛蕨富含的总黄酮类成分具有
良好的抗肿瘤活性 ,尤其是原芹菜素(protoapig-
·1969·中国医院药学杂志 2010年第 30卷第 23期 Chin H osp Pharm J , 2010 Dec , Vol 30 , No.23
enone)具有优良的细胞毒性 。但地下部位产量有限
且不可持续。为扩大药用资源 ,获得更多稳定来源
的普通针毛蕨总黄酮成分 ,本实验验证了从地上部
位提取总黄酮成分的可行性 ,同时分别以总黄酮提
取率和总黄酮纯度 ,原芹菜素含量为评价指标 ,正交
设计优选总黄酮提取和纯化的最佳工艺 ,为获得来
源稳定的普通针毛蕨总黄酮成分提供实验依据。
1　材料
Hitachi高效液相色谱仪 ,包括 L -2130多溶
剂输送泵 、L -2400 紫外检测器;756MC 紫外分光
光度计(上海精密科学仪器厂);普通针毛蕨药材地
上部位(采于江西省九江县 ,由九江林科所高级工程
师谭策铭教授鉴定),原芹菜素对照品(实验室自制 ,
纯度>98%);乙腈 ,甲醇为色谱纯 ,其他试剂为分析
纯;水为注射用水。
2　方法与结果
2.1　总黄酮提取工艺
2.1.1　正交设计[ 2] 　采用热回流提取法 ,选取液料
比(A),提取次数(B),提取时间(C),乙醇体积分数
(D)为考察因素 ,以总黄酮提取率为评价指标 ,以 L9
(34)表安排试验 ,见表 1。
表 1　提取工艺因素水平表
Tab 1　Fac to rs and levels fo r ex tracting process
水平 因素
A B/次 C/ h D/ %
1 1∶20 1 1 75
2 1∶30 2 1.5 85
3 1∶40 3 2 95
2.1.2　正交试验　精密称取普通针毛蕨地上部位
粉末约 1 g ,置于圆底烧瓶 ,热回流法提取 ,收集提取
液 ,自然冷却 ,静置 12 h ,过滤 ,合并滤液 ,回收溶剂
得浸膏。按硝酸铝显色法[ 3] 测量总黄酮含量。每组
平行做 3次 ,取平均值。正交试验结果见表 2 ,方差
分析见表 3。
表 2　提取工艺正交试验分析结果表
Tab 2　Results of o r tho gonal test analysis on the extr acting
process
试验号 A B C/ h D/% 黄酮提取率/ %
1 1∶20 1 1 75 1.075
2 1∶20 2 1.5 85 1.337
3 1∶20 3 2 95 1.297
4 1∶30 1 1.5 95 0.575
5 1∶30 2 2 75 1.364
6 1∶30 3 1 85 1.279
7 1∶40 1 12 85 0.945
8 1∶40 2 1 95 1.267
9 1∶40 3 1.5 75 1.579
均值 1 1.236 0.865 1.207 1.339
均值 2 1.073 1.323 1.164 1.187
均值 3 1.264 1.385 1.202 1.046
R 0.191 0.520 0.043 0.293
表 3　提取工艺方差分析表
Tab 3　Analy sis of v ariance of the ex tracting pr ocess
方差来源 A B C / h D / % 误差
偏差平方和 0.033 0.265 0.014 0.054 0.014
自由度 2.00 2.00 2.00 2.00 2.00
F比 3.857 18.929 1.000 2.357
P >0.05 >0.05 >0.05 >0.05
　　结果表明最优化条件为用 40倍量 75%乙醇提
取 3次 ,每次1.5 h 。而影响因素的主次顺序为提取
次数>乙醇体积分数>液料比>提取时间 ,各因素
均无显著性影响 。考虑到工业成本 ,最终选定普通
针毛蕨地上部位总黄酮的提取条件为用 20 倍量
75%乙醇提取 3次 ,每次1.5 h 。
2.1.3　工艺验证　精密称取 1 g 普通针毛蕨粉末 3
份 ,按选定工艺提取 ,总黄酮提取率分别为1.432%,
1.419%,1.428%。
2.2　总黄酮纯化工艺
2.2.1　正交设计　选取对黄酮纯化影响较大的加
碱水量 A ,提取次数 B ,碱水 pH C ,酸沉后溶液 pH
D为考查因素 ,以 L9(34)安排试验 ,见表 4 。
表 4　纯化工艺因素水平表
Tab 4　Factor s and level fo r purification pr ocess
水平
因素
加碱水量
/倍(A)
提取次数
(B)
碱水 pH
(C)
酸沉后 pH
(D)
1 1 2 8 5
2 2 3 9 3
3 3 4 10 1
2.2.2　正交试验　取普通针毛蕨地上部位 ,按优选
工艺制得浸膏。精密称取普通针毛蕨醇提浸膏约
16 g ,碱提酸沉法操作 ,加碱水超声提取 10 min ,过
滤 ,合并滤液用浓盐酸调节 pH 。 4 ℃静置 24 h 。过
滤 ,取沉淀 ,水洗至中性 。依亚硝酸铝显色法测量总
黄酮含量 。每因素试验平行做 3次 ,取平均值 ,结果
见表 5。
2.3　色谱条件 　色谱柱:Agilent TC-C18柱(4.6
mm×250 mm ,5μm);流动相:乙腈-0.1%磷酸溶液
(30∶70);流速:1.0 mL·min-1 ;检测波长:248 nm;
柱温:25 ℃。见图 1。
2.4　溶液的制备　精密称取原芹菜素 0.004 8 g ,
用甲醇分别配制成 480 ,30 ,20 ,6 ,3 ,1.5 mg ·L-1对
照品溶液 。过0.45 μm 微孔滤膜 ,备用。取纯化后
的总黄酮甲醇溶液各 200 μL 于 EP 管 ,过0.45 μm
微孔滤膜 ,备用(样品溶液)。
2.5　线性关系考察　取原芹菜素对照品系列溶液 ,
依次进样 10 μL ,记录峰面积 ,以浓度对峰面积积分
值进行回归处理 , 得标准曲线 Y =44 385 X -
3 922.5(R2 =0.999 9),表明在1.5 ～ 480 mg·L-1范
·1970· 中国医院药学杂志 2010年第 30卷第 23期 Chin H osp Pharm J , 2010 Dec , Vol 30 , No.23
围内线性关系良好。
表 5　纯化工艺正交试验结果
Tab 5 　Results of or tho gonal experiment of purification
process
试验号 A B C D 黄酮提取率/ %
纯化后
黄酮含量/
g·(100 g)-1
原芹菜
素含量
g·(100 g)-1
1 1 2 8 5 0.404 9.61 13.66
2 1 3 9 3 0.315 11.54 13.65
3 1 4 10 1 0.447 20.32 16.69
4 2 2 9 1 1.038 21.75 19.17
5 2 3 10 5 0.528 9.22 12.90
6 2 4 8 3 0.581 8.15 11.36
7 3 2 10 3 0.388 14.61 16.75
8 3 3 8 1 0.308 10.61 16.13
9 3 4 9 5 0.367 12.57 22.64
均值 11 0.389 0.610 0.431 0.432
均值 21 0.715 0.383 0.573 0.428
均值 31 0.354 0.465 0.454 0.598
极差 1 0.361 0.227 0.142 0.170
均值 12 13.823 15.323 9.457 10.467
均值 22 13.040 10.457 15.287 11.433
均值 32 12.597 13.680 14.717 17.560
极差 2 1.226 4.866 5.830 7.093
均值 13 14.667 16.527 13.717 16.400
均值 23 14.477 14.227 18.487 13.920
均值 33 18.507 16.897 15.447 17.330
极差 3 4.030 2.670 4.770 3.410
图 1　高效液相色谱图
A.对照品;B.普通针毛蕨样品
Fig 1　HPLC chromatogram
A.reference su bstan ce B.Macrothelyp ter is torresiana sample
2.6　精密度试验　取对照品溶液 ,连续进样 5次 ,
记录峰面积 , RSD为1.07%。精密度良好。
2.7　重复性与稳定性试验　精密称定同一供试品
约0.2 g ,5份 ,甲醇溶解 ,过0.45μm 微孔滤膜 ,进样
分析 ,记录峰面积 , RSD 为2.5%。重复性良好 。取
上述同一样品溶液 ,每隔 2 h进样 10 μL ,记录峰面
积 , RSD为1.4%。表明样品溶液至少 10 h内稳定 。
2.8　加样回收率试验[ 4] 　精密称取同一批次原芹
菜素含量为11.1 mg·g-1的醇提浸膏0.200 g ,5份 ,
各准确加入5.0 mL(0.480 0 g·L-1)原芹菜素对照
品溶液 ,超声溶解混合 ,过0.45 μm 微孔滤膜 ,依次
进样分析 , 记录原芹菜素含量。平均回收率为
96.1%, RSD为2.4%。
2.9　纯化工艺正交试验
2.9.1　结果　取供试品依次进样分析 ,记录原芹菜
素含量 ,各因素取平均值 ,结果见表 5。方差分析见
表 6。
表 6　纯化工艺方差分析结果
Tab 6 　 Results of variance analy sis fo r the purification
pro cess
指标 因素 偏差平方和 自由度 F比 P值
黄酮提取率 A 0.239 2 6.829 >0.05
B 0.079 2 2.257 >0.05
C 0.035 2 1.000 >0.05
D 0.056 2 1.600 >0.05
误差 0.04 2
纯化度 A 2.315 2 1.000 >0.05
B 36.775 2 15.886 >0.05
C 61.981 2 26.774 <0.05
D 88.786 2 38.352 <0.05
误差 2.31 2
原芹菜素含量 A 31.023 2 2.471 >0.05
B 12.556 2 1.000 >0.05
C 34.987 2 2.786 >0.05
D 18.643 2 1.485 >0.05
误差 12.56 2
　　以上结果表明 ,在 3个考察指标中 pH 9的碱
水提取 ,浓盐酸条件 pH 1是最优条件 ,而 A , B 2个
因素存在分歧 。针对黄酮提取率的最优化条件为 2
倍量碱水提取 2次;针对黄酮纯化为 1 倍量碱水提
取 2次 ,针对原芹菜素含量为 3倍量碱水提取 4次。
综合考虑操作简便和成本因素 ,选取最终的优化条
件为 2 倍量 pH 9的碱水提取 2 次后浓盐酸条件
pH 1。
2.9.2　优选纯化工艺的验证　精密称取普通针毛
蕨浸膏16.00 g用优选工艺纯化 ,测量黄酮提取率分
别为1.013 ,1.098 ,1.006 g·(100 g)-1 ;纯化后黄酮
含量分别为21.74%,21.67%,22.15%;原芹菜素含
量分别为19.37 ,19.26 ,19.08 g·(100 g)-1 。
3　讨论
本实验从保护普通针毛蕨不可再生的地下资
源 ,为扩大药用资源 ,避免大量地上资源浪费 ,从地
上部位获取可持续生产的普通针毛蕨总黄酮成分为
目的 ,分别对总黄酮的提取和纯化过程进行正交试
验法优选最佳工艺 。在最终的工艺选择上综合评价
了总黄酮提取率 、黄酮纯化度 、主要活性成分原芹菜
素含量以及生产成本。考虑到黄酮的纯化过程可能
涉及的黄酮类损失 ,在该部分正交设计中收录了总
黄酮提取量这一指标 ,结果证明纯化后总黄酮的提
取量为 75%乙醇粗提总黄酮提取量的77.56%。黄
酮类损失量较小 ,同时纯化后总黄酮和原芹菜素含
量均有大幅度提高。该工艺全过程仅使用常见 、廉
价 、安全的化学试剂 。由于未使用纯化工艺中的常
规器具大孔树脂 ,避免了苯等毒性有机物残留以及
树脂各型号和批次之间比表面积和功能基团含量差
别大 、在中药成分纯化中重复性差的问题 。在纯化
工艺考察中 ,我们选取了原芹菜素含量这一指标 ,原
芹菜素已在本实验室前期研究中发现具有优良的抗
·1971·中国医院药学杂志 2010年第 30卷第 23期 Chin H osp Pharm J , 2010 Dec , Vol 30 , No.23
肿瘤活性 ,以其为指标使得在总黄酮的提取纯化的
同时确保了药理活性 。上述正交试验经 3次平行操
作后确定最终工艺条件 ,并再次进行 3批验证 ,证实
该工艺重复性好 ,为后期研究提供了实验基础。
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[ 收稿日期] 2010-01-23
[基金项目] 贵州省科技厅重大专项[ 编号:黔科合重大专项字(2008)6020] ;贵州大学 2008年青年基金项目[ 编号:贵大自青基合字(2007)077
号] 　[ 作者简介] 欧琴 ,女 , 硕士研究生 ,电话:15286049696 , E-mai l:ouqin2005827@163.com 　[ 通讯作者] 钱一鑫 , 女, 助理研究员 ,电话:
0851-8298735 , E-mai l:qianyixin@gmai l.com
高效液相色谱法测定银杏叶充液胶囊黄酮和内酯的含量
欧琴1 , 2 ,钱一鑫2 ,康冀川2 ,何珺2 ,卿晓红2 　(1.贵州大学生命科学学院 ,贵州 贵阳 550025;2.贵州大学西南药用生物
资源教育部工程研究中心 ,贵州 贵阳 550025)
[ 摘要] 　目的:建立银杏叶充液胶囊中黄酮和萜类内酯的含量测定方法。 方法:采用高效液相色谱法 , 色谱柱为依利特 C18
(150 mm×4.6 mm , 5 μm);流动相分别为甲醇-0.8%磷酸溶液(47∶53)、四氢呋喃-甲醇-水(3∶7∶17);流速分别为0.8 , 0.5 m L·
min -1 ;紫外检测波长为 360 nm;示差检测器;柱温均为45 ℃。结果:3 种黄酮和 4 种内酯均能达到较好的分离效果 , 线性关系
良好 ,平均回收率分别为 98.14%, 99.18%, 98.81%, 99.07%, 99.33%, 99.40%, 98.95%, RSD 分别为 1.09%, 1.16%,
1.43%, 1.62%, 1.76%, 1.72%, 1.68%。结论:该方法灵敏 、准确 、专属性强 ,可作为银杏叶充液胶囊的质量控制的有效方法。
[ 关键词] 　银杏叶充液胶囊;银杏黄酮;银杏内酯;高效液相色谱法
[ 中图分类号] R927.2　　[ 文献标识码] A　　[ 文章编号] 1001-5213(2010)23-1972-04
Determination of Ginkgo biloba flavonoids and terpene lactones in Ginkgo leaf liquid-filled hard
capsules by HPLC
OU Qin1 , 2 , QIAN Yi-xin2 , KANG Ji-chuan2 , HE Jun2 , QIN Xiao-hong2(1.Co llege o f Life Science , Guizhou Uni-
versity , Guizhou Guiy ang 550025;2.The Enginee ring and Resea rch Center fo r Southw est Bio-pharmaceutical Resource o f Na-
tional M inistry of China , Guizhou Univer sity , Guizhou Guiyang 550025 , China)
ABSTRACT:OBJECTIVE　To establish a determina tion method for liquid-filled capsules of Ginkgo biloba f lavonoids and te r-
pene lactone.METHODS　The high-per formance liquid chr omatog r aphy , co lumn:According to Bartlett C18(150 nm×4.6 nm ,
5 μm);mobile phase w ere methano l-0.8% pho spho ric acid(47∶53), tet rahydrofur an-methanol-w ater(3∶7∶17);flow rate , re-
spectively 0.8 mL·min -1 , 0.5 mL·min -1 ;detector s w ere UV detector (detection wave length o f 360 nm), diffe rential detec-
to r;column tempe ratures we re 45 ℃.RESULTS　The three kinds o f f lavono ids and four kinds o f lactone we re able to achiev e
a be tter separation efficiency , good linearity , ave rage recove ry w ere 98.14%, 99.18%, 98.81%, 99.07%, 99.33%,
99.40%, 98.95%, RSD respectively , 1.09%, 1.16%, 1.43%, 1.62%, 1.76%, 1.72%, 1.68%.CONCLUSION　This
method is sensitiv e , accur ate , specific, which can be used a s an effec tive method of quality contr ol of liquid-filled capsules
Ginkgo biloba.
KEY WORDS:Ginkgo leaf liquid-filled hard capsules;Ginkgo biloba f lavonoids;terpene lactones;H PLC
　　充液胶囊是近年来出现的一种新剂型 ,为美国
辉瑞公司新开发的一种新型胶囊制剂 ,采用明胶或
羟丙基甲基纤维素(HPMC)为外壳 ,以全新概念的
固体剂型液体释放而备受关注[ 1-2] ,国内已有叶黄素
充液胶囊剂上市 ,十滴水充液胶囊剂已获得国家新
药证书。
银杏叶主要活性成分为黄酮类(槲皮素 、山奈
素 、异鼠李素等)、内酯类化合物(银杏内酯 A 、B 、C
和白果内酯等),具有很强的药理活性[ 3] ,能够舒张
冠脉 ,改善血液循环 ,降低心肌耗氧量 ,对心脑血管
·1972· 中国医院药学杂志 2010年第 30卷第 23期 Chin H osp Pharm J , 2010 Dec , Vol 30 , No.23