全 文 ：收稿日期:2004-01-15
作者简介:赵燕燕(1972-), 女(汉族),辽宁盖州人 , 博士研究生;崔承彬(1956-), 男 , 吉林通化人 , 教授 , 博士生导
师 , 主要从事天然产物活性物质的研究 , Tel:(010)86301131 , E-mail:cuicb@sohu.com。
文章编号:1005-0108(2004)03-0169-03
洋紫荆中生物碱类抗肿瘤活性成分的研究
赵燕燕1 , 2 ,崔承彬3 , 4 ,蔡 兵2 ,韩 冰2 ,孙启时1
(1.沈阳药科大学中药学院 ,辽宁 沈阳 110016;2.天津生物医药研究所 ,天津 300384;
3.中国海洋大学海洋药物与食品研究所 ,山东 青岛 266003;4.军事医学科学院毒物药物研究所 , 北京 100850)
摘　要:目的 研究洋紫荆中的抗癌活性成分。方法 采用色谱法与生物活性追踪相结合分离纯化
活性成分 。丽丝胺罗丹明 B(S RB)法检测化合物对 K562 细胞增殖的影响 ,流式细胞仪检测化合物
对 K562 细胞周期的影响。结果 分离得到 4 个具有活性的生物碱类化合物 , 用现代谱学方法鉴定
为 N-naphthyl-2-aniline(1)、biocyclomahanimbine(2)、mahanimbine(3)、girinimbine(4)。化合物 1 ～ 3
体外具有明显诱导 K562 细胞调亡作用。结论 4 个生物碱类化合物均为该属中首次分离 , 其中化
合物 1的体外抗癌活性为首次报道。
关键词:药物化学;分离;鉴定;色谱法;抗癌活性;羊蹄甲属;生物碱
中图分类号:R284.1　　　文献标识码:A
　　洋紫荆(Bauhinia variegata L.)为豆科
(Leguminosae)羊蹄甲属植物 ,该属植物在全世界
有600余种 ,我国有 40种 , 11个变种 ,主要分布
在我国的南部和西南部地区 ,其中 10余种植物在
云南思茅地区作为民间用药 ,主治风湿病和消化
不良[ 1] 。迄今为止 ,国内外有关该属植物的化学
成分和药理活性研究的文献报道很少。在对云南
植物进行抗癌活性筛选的过程中发现 ,洋紫荆的
氯仿萃取物对 K562细胞具有明显的诱导凋亡活
性 ,进一步追踪分离得到 4个具有活性的生物碱:
N-naphthyl-2-aniline (1)、 biocyclomahanimbine
(2)、mahanimbine(3)、girinimbine(4)。
1　实验部分
核磁共振谱采用 JEOL Eclips-600型仪器测
定 , TMS为内标。质谱采用 Esquire LC质谱仪测定 ,
紫外光谱采用岛津 UV-2501 PC仪测定 ,DNA分布
直方图采用 EPICS®　XL型流式细胞仪测定 ,吸光度
采用SPECTRA MAX Plus型酶标仪测定。柱色谱及
薄层色谱用硅胶均为青岛海洋化工集团出品。
1.1　提取分离
洋紫荆药材 8.4 kg ,粉碎后用 95%(φ)的乙
醇冷浸 ,得浸膏 1.8 kg 。加入适量水混悬 ,等体积
的氯仿萃取3次 ,得氯仿提取物 45 g ,经硅胶柱减
压色谱 ,石油醚-丙酮(V∶V , 100∶1※1∶1)、氯仿-
甲醇(V∶V , 100∶5※1∶1)梯度洗脱 ,按照薄层和
生物活性检测结果合并得到 9个部分。从部分Ⅰ
得到化合物 1(9 mg),从部分 Ⅱ中分别得到化合
物 2(20 mg),3(9 mg),4(4 mg)。
1.2　结构鉴定
化合物 1:白色砂晶(丙酮),mp 107 ～ 108 ℃,
UVλmax(logε):346(3.62), 309(4.35), 271(4.41),
220(4.44)nm 。阳离子ESI-MS在 m/ z 220处给出
伪分子离子峰[ M+H] + ,确定分子式为 C16H13N 。
1H-NMR(CDCl3)谱显示化合物组成为单取代苯环
δ:7.17(dd ,1H , J =7.4 ,0.9 Hz ,H-2′,6′),7.31(dd ,
1H , J =7.4 ,1.1 Hz ,H-3′,5′),6.98(dt ,1H , J =7.4 ,
0.9 Hz ,H-4′)。2位单取代萘环 δ:7.44(d ,1H , J =
2.2Hz ,H-1),7.23(dd , 1H , J =8.8 , 2.2 Hz ,H-3),
第 14 卷　第 3 期
2004 年6月　总 59期
中 国 药 物 化 学 杂 志
Chinese Journal o f Medicinal Chemistry
Vol.14　No.3　p.169
Jun.2004 Sum 59
DOI :10.14142/j.cnki.cn21-1313/r.2004.03.011
7.73(br d ,1H , J =8.8 Hz ,H-4),7.74(br d ,1H , J=
8.8 Hz ,H-5),7.30(dd , 1H , J =8.0 , 8.8 Hz ,H-6),
7.40(dd ,1H , J =8.0 ,7.0 Hz ,H-7),7.65(br d ,1H ,
J =7.0 Hz ,H-8),另外 , δ5.88处的宽峰为氮上的
H信号。13C-NMR(CDCl3)谱给出 14 个烯碳信号
δ:111.51(C-1),140.81(C-2), 120.01(C-3),129.15
(C-4), 127.61(C-5), 123.46(C-6), 126.45(C-7),
126.42(C-8), 134.58(C-9), 129.15(C-10), 142.87
(C-1′), 118.22(C-2′, C-6′), 129.41(C-3′, C-5′),
121.38(C-4′)。分析以上数据并与文献[ 2]数据对
照 ,鉴定化合物 1为 N-naphthyl-2-aniline。
化合物 2:无色柱状结晶(丙酮), mp 146 ～
147 ℃,UVλmax(logε):304(4.07), 254(4.27), 241
(4.46),218(4.37),196(2.10)nm。阳离子ESI-MS在
m/z 332处给出伪分子离子峰[M +H] + ,确定分子
式为 C23H25NO。1H-NMR(CDCl3)δ:7.68(s , 1H , H-
4), 7.92(d ,1H , J =7.7 Hz ,H-5), 7.17(dd , 1H , J =
8.0 ,7.7 Hz , H-6), 7.29(dd , 1H , J =8.0 , 8.1 Hz , H-
7),7.38(d , 1H , J =8.1 Hz ,H-8), 3.29(d , 1H , J =
9.5 Hz ,H-10), 2.70(dd ,1H , J =9.2 ,9.2 Hz , H-11),
2.05(m ,1H ,H-13),1.68(m ,1H ,H-13),1.65(m ,1H ,
H-14),1.73(m ,1H , H-14), 2.50(m , 1H , H-15), 2.32
(s ,3H , 3-CH3),1.44(s , 3H ,12-CH3), 1.58(s ,3H , H-
17),0.64(s , 3H , H-18), 7.43(br s , 1H , NH)。 13C-
NMR数据见表 1 ,以上数据结合相关文献[ 3 ,4]分析 ,
鉴定化合物 2为biocyclomahanimbine。
化合物 3:无色针晶(氯仿), mp 92 ～ 94 ℃,
UV λmax(logε):357(3.74), 342(3.78), 329
(3.75), 287(4.50), 237(4.54), 200(4.26)nm 。
阳离子 ESI-MS 在 m/ z 332 给出伪分子离子峰
[ M+H] + ,与分子式 C23H25NO 相符。 1H-NMR
(CDCl3)δ:7.66(s , 1H , H-4), 7.90(d , 1H , J =
7.7 Hz ,H-5), 7.17(dd , 1H , J =8.0 , 7.7 Hz , H-
6),7.30(dd , 1H , J =8.0 , 8.1 Hz , H-7), 7.37(d ,
1H , J =8.1 Hz ,H-8),6.64(d , 1H , J =9.9 Hz ,H-
10), 5.65(d ,1H , J =9.9 Hz ,H-11),1.76(m ,2H ,
H-13),2.17(m , 2H , H-14), 5.11(m , 1H , H-15),
2.33(s , 3H , 3-CH3), 1.45(s , 3H , 12-CH3), 1.57
(s ,3H ,H-17), 1.65(s ,3H , H-18), 7.86(br s ,1H ,
NH)。13C-NMR 数据见表 1 ,以上数据结合文
献[ 3 ,5]分析 ,鉴定化合物 3为 mahanimbine 。
化合物 4:无色片状结晶(氯仿), mp 117 ～
118 ℃, UVλmax(logε):357(2.93), 341(2.99),
327(2.97), 287(3.68), 237(3.74)nm 。阳离子
ESI-MS 在 m/ z 264 给出伪分子离子峰[ M +
H] + ,与分子式 C18H17NO 相符 。1H-NMR(CD-
Cl3)δ:7.67(s ,1H ,H-4), 7.91(d , 1H , J =7.6 Hz ,
H-5), 7.13(dd , 1H , J =8.0 , 7.6 Hz , H-6), 7.30
(dd ,1H , J =8.0 , 8.1 Hz , H-7), 7.37(d , 1H , J =
8.1 Hz , H-8), 6.63(d , 1H , J =9.9 Hz , H-10),
5.70(dd , 1H , J =9.9 Hz , H-11), 2.33(s , 3H , 3-
5 CH3), 1.49(s , 6H , H-13 , 14), 7.83(br s , 1H ,
NH)。 13C-NMR 数据见表 1 , 以上数据结合文
献[ 3 ,5]分析 ,鉴定化合物 4为 girinimbine 。
Table 1　The 13C-NMR data of compounds 2～ 4
Position
Compd.
2 3 4
Position
Compd.
2 3 4
1 106.33 104.17 104.42 10 37.37 117.49 117.22
2 150.37 149.89 149.80 11 37.82 128.51 129.42
3 120.03 118.40 118.63 12 83.54 78.31 75.85
4 119.31 121.17 121.17 13 38.34 40.75 27.59
4a 115.77 116.59 116.73 14 25.62 22.73 27.59
5a 124.17 123.90 123.91 15 46.62 124.18
5 119.31 119.27 119.33 16 39.30 131.67
6 119.28 119.44 118.63 17 25.62 25.64
7 123.89 124.15 124.27 18 18.60 17.56
8 110.28 110.33 110.37 3-CH3 16.71 16.06 16.07
8a 139.23 139.42 139.44 12-CH3 27.42 25.81
9a 137.76 134.82 134.80
1.3　体外抗癌活性
分别精密称定化合物 1 ～ 4 ,加入甲醇配成
0.6 mmol/L的母液 ,超声溶解 ,置于-20 ℃冰箱
贮存 ,用前加入甲醇稀释 。
1.3.1　对 K562细胞增殖抑制活性测试
收集对数生长期的 K562 细胞 ,配成分子浓
度为1×105个/mL的细胞悬液 ,按每孔 200 μL 接
种于 96孔板中 ,于 37 ℃, 5%(φ)CO2 培养箱内
培养4 h ,将化合物 1 ～ 4按上述方法配制 ,每孔加
入2 μL ,每个浓度设 3个平行孔 ,同时设空白对照
170 中 国 药物 化 学 杂 志 第 14 卷
和加入甲醇的阴性对照。加药后培养 24 h ,每孔
加入50μL 80%(φ)三氯醋酸溶液 , 4 ℃条件下固
定1 h , 冲洗 , 空气干燥。再向每孔加入 100 μL
0.4%(ρ)SRB 染色液 , 室温染色 30 min 后 ,用
1%(φ)的醋酸将未与蛋白质结合的 SRB冲洗干
净 ,空气干燥。每孔加入 150 μL 10 mmol/L Tris
(pH 10.5)缓冲液 , 置于微量振荡器中振荡
15 min ,用酶标仪在 520 nm 处检测 ,得每孔溶液
的吸光度(A)值 。实验按此法重复 3次。
1.3.2　细胞 DNA 含量测定
将上述培养 24 h 的细胞从 24 孔板转移至
1.5 mL 离心管中 ,4 ℃,3 000 r/min离心 3 min ,
吸弃上清液并收集细胞 ,加 0.5 mL 磷酸盐缓冲
液振荡洗涤一次 , 相同条件下收集细胞 , 加入
100 μL碘化丙啶水溶液 , 4 ℃下避光染色 30 min ,
相同体积的磷酸盐缓冲液稀释 ,用流式细胞仪测
定细胞的 DNA 含量分布 。与空白对照比较 ,判
断被测样品细胞凋亡诱导活性及强度。
2　结果与讨论
K562细胞经化合物 1 ～ 4以 2 、1 、0.5 、0.25 、
0.01 μmol/L 终浓度处理 24 h 后 ,利用酶标仪在
520 nm 处测得每孔溶液的吸光度(A)值 ,计算化
合物 1 ～ 4的半数抑制浓度(IC50)值 ,结果见表 2。
结果表明:化合物 3对 K562 细胞增殖抑制作用
最强 ,化合物 4的抑制作用最弱。
　　用流式细胞仪检测并分析细胞 DNA含量分
布变化 ,结果表明:化合物 1 ～ 4处理后凋亡区域
(Sub-G1)的细胞含量百分率分别为 72.1%、
87.1%、95.7%、2.3%。化合物 3 的诱导凋亡活
性最大。该结果与细胞增殖抑制的结果一致 。
Table 2　The inhibitory effects of compounds 1～ 4
on the proliferation of K562 cell μmol·L-1
Compd. IC50(x±s , n =3)
1 1.73±0.013
2 0.81±0.008
3 0.62±0.002
4 >2
　　实验结果表明:化合物 1 ～ 4在体外均具有抑
制K562细胞增殖和诱导细胞凋亡的活性 ,活性
强度为化合物 3>2>1>4。这 4 个化合物都是
首次从该属植物中分离得到 ,且化合物 1的体外
抗癌活性为首次报道 。本研究为洋紫荆的进一步
开发利用提供了理论依据 。
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1457-1482.
Study on the constituents with anticancer activities
of alkaloids from Bauhimia variegata L.
ZHAO Yan-yan1 , 2 , CUI Cheng-bin3 , 4 , CAI Bing2 ,HAN Bing2 , SUN Qi-shi1
(1.School of Traditional Chinese Materia Medica , Shenyang Pharmaceut ical Universi ty , Shenyang
110016 , China;2.Tianjin Inst itute for Biomedicinal Research , Tianj in 300384 , China);
3.Marine Drug and Food Inst itute , Ocean University of China , Qingdao 266003 , China;
4.Beij ing Insti tute of Pharmacology and Toxicology , Beij ing 100850 , China)
Abstract:Aim To study the anticancer constituents from Bauhimia variegata L.Methods The compounds were iso-
lated through a bioassay-guided separation procedure and identified by spectroscopic analysis.The cell proliferation in-
hibitory and apoptosis inducing activities were assayed using K562 cells by the SRB method and flow cytometry re-
spectively.Result Four alkaloids were isolated and identified as N-naphthyl-2-aniline ,biocyclomahanimbine ,mahan-
imbine ,girinimbine.Conclusion The four compounds were obtained from this genus for the first time and the apopto-
sis inducing activities of N-naphthyl-2-aniline had never been reported before.
Key words:medicinal chemistry;isolation;identificantion;chromatog raphy;anticancer activity;Bauhimia;alkaloid
171第 3期 赵燕燕等:洋紫荆中生物碱类抗肿瘤活性成分的研究