全 文 ：第 9 卷
19 9 1年
第 2期 北 京 农 学 院 学 报
JO U R N A L O F B E I」n阅G A (丑 1已 J L T U R A L 〔X〕L L EG E
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1塑润
低温条件下君迁子幼苗 S O D
同工酶谱带与活性研究 `
姚允聪 王有年 赵晓芳
(北京农学院园艺系 , 北京 10 2 20 8 )
赵玉 田
(中国农科院品资所 )
摘 要 本文用聚丙烯酞胺凝胶 电泳方法 和 N旧T光化学反应法测试 了君迁子幼苗 (4 士 l) ℃
( ck ) 和 (0 土 1) ℃ 条件下随低温处理 时间 的加 长 , SO D 同 工酶 谱带和活 性 变化 . 结果
表明 , 在 (4 士 l) ℃ 条件下君迁子幼苗 S O D 酶共有 9条酶带 , 其中有 3条一级带 , 4 条二级
带和 2条三级带 ; 在 (O士 l) ℃ 条件下 , 随低温处理时间 的加 长 , S O D 酶带中 , 一级带在
9h6 之后全部消失 , D 区中三级带在低温处理 24h 之后就消失 , 三 级带数逐渐减少 . 说明
随着低温处理时间的加长君迁子幼苗中 SO D 酶活性降低 , N田T 光化学反应 测试结果同样
说明了这一论点 .
关键词 君迁子 , 低温 , SO D
超氧化物岐化酶 (s u p eor ix de d is m u at se )是一切需氧有机体中普遍存在的一种含金属的酶: ’ ;
.
自 M仗飞) dr 和 F ir do vi hc 1970 年首次从 牛血 清 中发 现这 种酶 以 后 , 近 几年 许 多研究 者就 其
Q 亿n 一 SO D 、 M n 一 S O D 和eF 一 S O D等对动植物体中活性氧和过氧化 自由基抑制 , 保护细胞膜正
常代谢的功能进行了广泛的研究 “` .1I 却 8,n .认为 s o D在有机体中以 2 0 ; + ZH ` +瞥 .H o + o , 的方式
消除自由基 , 使膜脂的过氧化作用减弱 . 从而保护细胞膜免受自由基 的攻击和伤害 ! ” ’ 二〕. B a Ll c ll a m p
和 F巧d o v ich ( z973y ” , B a ke r ( 19 7 6y 2 ’ , G ia n o p o il出和R ,二 ( 19 77 ) {“ ’以及罗广华等 (一9 8 5 ) : 6· 刁先后对
豌豆 、 小麦 、 燕麦 、 玉米 、 花生和大豆等组织和器官 中的 S O D 酶进行研究 , 证明组织中普遍
存在着 S O D 酶 . 王爱国等 t s 〕探讨了花生 、 大豆和水稻种子在衰老过程 中 SO D 酶 的作用 , 认
为 S O D 酶 与植物 的保护性反 应有 关 . 王 以柔 I川 对低 温处理 下 水稻幼 苗 , aJ m es (1 9 7 6) 和
aR ib no iw icl 等 ( 19 8 1) ! ” }对过熟的果实 (如苹果 、 香蕉 、 鳄梨等 )的研究都证明逆境中的植物细
胞内SO D 酶活性有不同程度的下降 . 君迁子 ( D isP y川 5 . oL t二 . )L 是我国柿树的重要砧木 . 其
对土壤环境的适应性和对不 良土壤因子的抗性和适应性代谢的研究 目前还未报道 , 为此 , 我
们在研究水分亏缺条件下君迁子 S O D 酶活的基础上 , 选用不同的低温处理 , 对君迁子幼苗S O D
同工酶的特性进行研究 , 以探讨 SO D 酶作为君迁子抗性生理指标在低温环境下的特性变化 .
收稿 日期 : l男 4 一 03 一 龙
州匕京市科 干局青年科技基金资助项 目
DOI : 10. 13473 /j . cnki . i ssn. 1002 -3186. 1994. 02. 007
北 京 农 学 院 学 报 第 9 卷
1
一
1
材料和方法
试验材料
本文所用君迁子种子来 自北京市昌平县 . 挑选果实较大 , 整齐度较高 , 含 7 一 8 粒 种子
的果实 , 取其种子发芽后的幼苗 .
1.2 发 芽
2 5 ℃ 条件下浸种 Zd , 待种子吸水膨胀后 , 放在 中15c m 的培养器中 , 于 28 ℃ 条件滤纸 包
埋下发芽 , 芽长 加m 时进行低温处理 .
1 3 低温处理
挑选芽长与芽粗一致的幼苗进行不同时数的低温处理 . (4 士 1) ℃ 作为对照 , ( 0 士 l) ℃ 条
件下采用下列时间间隔进行处理 , 处理 L 2h4 ; 处理 n : 4h8 ; 处理 1 : 7h2 ; 处理 W : 9 6h ;
处理 V : 12 h0 ; 处理 VI : 14 .h
L 4 测试方法
l) 酶液制备 取芽长 1 . 2 一 1 .父m , 芽粗一致的芽 .0 59 , 加人 1 . s inl .0 0 5r lo l压 p H .7 8的磷酸钠
缓冲液 , 于冰浴上研磨后 , 在 T G L 一 10 型台式离心机上 以 14 0 Or /面 n 离心 20m in , 上清液 即
为酶粗提液 .
2) 酶活性测定 按照 G in on p o il ist 和瓦。 ( 19 77) 的方法 冈
. 并参 照王爱 国 l( 9 83) 的方法测
定S O D 对氮蓝四哇 (N B T )光化还原的抑制作用阔 . 3耐反应液 中含有 1 . 3拜mo l压核黄素 , 13拜mo l瓜
甲硫 氨 酸 , 64 # mo l压氮 蓝 四 哇 (N B T ) , 10 一 ,orn l压 E D T A 一 N a , 0
.
0 5mo l压 p H 7
.
8磷 酸
缓 冲 液 , 加 人 2 0( ) In l酶 液 后 , 经 4 0( 刃lx 光 照 12m i n ,用 7 51 分光 光 度计在 5 60 住m 处测定 光密
度 , 以不加酶液作为空 白 , 用抑制 ({N B )T 光化还原 50 % 作为一个酶活性单位 .
3) 聚丙烯 酞胺凝胶 电泳 按照吴少伯介绍的方法 , 并参照罗广 华等的方法 .6t 刀 制 胶 . 采
用瑞 士 L K丑— M ul[ t lp ho r n哆 用 电泳 仪 n 型 ) 垂 直式 电泳系 统 . 为避 免过 硫酸钠 对 SO D酶活 性 的抑制 , 换 以核黄素 为凝胶剂制胶 , 凝 聚时采用 4 0X() h 光直射 . 电泳条件是 : 间隔胶
T = .3 75
,分 离 胶 T = .7 5 , 电 泳 强 度 : 浓 缩 胶 1 5v0 .0 8m A厅L , 在 冰 箱 中 2 一 4 ℃ 条件 下 电
泳 , 时间为 3 . h5 .
SO D 同工酶活性染色 参照 B ae u ch a m p 和 F ir d io ch 的方法 I’ ] . 其过程是 : 电泳后取下凝胶
片 , 在黑 暗中浸泡于 .2 5 x lo 一 3mo l压氮蓝 四哇 ( N’B )T 中 60 11五n ,然后将凝胶片取出 , 移人含
有 2 . 5 x 10 一 , orn l / L 核黄素 , 2
.
5 x 10
一加。 lL/ 四 甲基 乙 二胺 (花M E D ) 和 3 . 6 x l o 一 b o lL/ . p H 7 . s 的
磷酸缓冲液 中 , 在黑暗中浸泡 2伍面n , 取出凝胶片 , 再浸人含有 1 xl o 一 4mo l压 EDT A和 5 x 10
一 ,
mo l压
、
p H .7 8 的磷酸钠缓冲液 中 , 在灯光下照光 5而 n , 此时 , 蓝色背景上出现的无色透明区
带即 SO D 同工酶活性带 .
1卯4 年 第 2期 姚允聪等 : 低温条件下君迁子幼苗 S OD 同工酶谱带与活性研究 5 1
2 试验结果
1 1低温处理下君迁子幼苗 S OD 酶带分级
按照酶学特性原 理 , 本 试验 对低温处理下 的 SO D 酶带 按照迁移率分 为 A l , 2A , 3A ,
4A … … , nA 等带 . 按照酶带透明度及带宽分为 : 一级带 、 二级带 、 三级带 , 以示其 酶活性变
化如图 1 .
1 2 低温处理下君迁子幼苗 S O D 酶谱带数目
供士 1) ℃ 条件下和 (0 士 l) ℃ 条件下君迁子幼苗 SO D 酶共有 3 个区 9 条带 , 即 .B C D 三个
区和 A l , 2A , 3A , 4A , 5A , 6A , 7A , A S , 9A 九条带 . 其中 B 区有 3 条一级带 , C 、 D 区分别
有 2 条二级带和 1条三级带 . 但各级带的迁移率不同 , 如图 .2
城038451.9眼0673L一ù姗跳赢罕训11ù一皿圈甲川人.A凡/l;:11区AB. . 一级带 , 带色深而宽
婆委留 二级带 “ 带色浅而宽
区习 三级带 。 带色极浅而宽
. . . 一级带 酶带色深而窄
忽召刃 二级带 酶带色浅而窄
巨三习 三级带 酶带色极浅而窄
{ A
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I
A ,
C 区 ` } A
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` 一一一一一一一一一一一七一一一一一一一
图 ] 君迁子幼苗 S O D 同工酶谱带分级标准 图 2 君迁子幼苗 S O D 同工酶电泳图谱
2 3 不同低温处理条件下君迁子幼苗 S O D 酶带数 目和带级变化
君迁子幼芽经 (0 士 1) ℃ 条件下 , 24 h 处理后具有 8 条酶带 , 原来 的 A 6 酶带消失 , A g 酶
带活性减弱 ; 经 48 h 处理后 , 具有 8 条酶带 , 原来的 8A 酶带消失 , 7A 酶带及 9A 酶带活性
减弱 ; 经 72 h 低温处理后 , 具有 7 条酶带 , 原来 的 A 6 酶带消失 , A 7 酶带和 9A 酶带活性减
弱 , 经 % h 低温处理后 , 具有 7条酶带 , 原来的 8A 谱带和 9A 酶带消失 , A l , 2A 、 3A , A 7 酶
带活性减弱 ; 经 120 h 低温处理后 , 具有 8 条酶带 , A 6 酶带消失 , A l , 2A , 3A , A 7 , A S 酶带
活性减弱 ; 经 14 h 低温处理后 的酶带数 目及活性与 12 0 h 的相同 . 如图 3 所示 .
北 京 农 学 院 学 报 第 9 卷
巍ù譬翻图ù圈翻ǎ甲丁l一删刚圈一皿聊国甲。一ù侧圆图ō甲…山一ù圈撇罕
…
戊几.纵人凡气
24 h 847 h 2h 96 h 10 h 214 h
图 3不同低温处理条件下君 迁子幼苗 S O D电泳图谱
随着低温处理时间的加长 , 酶带数 目发生变化 , 处理后 24 h , 48 h , 120 h 和 14 h 酶带数 比
对 照减少一条 , 处理后 721 和 9h6 比对照减少 2 条 , 各级别的酶带数目也发 生相应变化 , 低
温处理 7h2 以 后由于酶活性降低 , 一级带数 目为零 . 处理 % h 以后 , 二级酶带数 目明显增
加 , 三级带数 目的变化各处理大致相 同 . 即随着低温处理时数的增加 , 酶带数 目减少 , 一级
酶带数目减少 , 说明 SO D 在低温处理过程中活性降低 . 如表 1所示 . A 6 , A S 带的变化说明
其 对低温 的敏感性 .
表 1 不同低温处理条件下君迁子幼芽 S O D 同工酶比较
处理时间
( O 士 1) ℃
酶谱带数目
一级带 二级带 三级带 谱带总数
24 h 3 3 2 8
120 h
1拼 ! 1
c k (4 士 I ) ℃ 3
.2 4 不 同低温处理条件下君迁子幼苗 SO D 酶迁移率变化
从表 2 可 以看 出 , 君迁子幼苗 S O D 同工酶在 (4 士 1) ℃ 处理 (对照 )时的迁移率分别是 0 . 38,
1卯 4年 第 2期 姚允聪等 :低温条件下君迁子幼苗O S D同工酶谱带与活性研究
. 0科 , .0 51 0 . 5 5 , 0 . 5 9 .0 64 , .0 69 , 0 . 7 3 , 0 . 7 7 . 在 ( o 士 1) ℃ 条件下低温处理时间的加长 ,
相应酶带 的迁移率稍有增加 .
表 2 不同低温处理条件下君迁子幼苗 S O D 同工酶迁移率 ( fR % )
处 理 ck 24 h 48 h 7 2 h 96 h 120 h 14 h
3845刃66170nù汀oné八曰0 3 9
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2 5 低温处理对君迁子幼苗 S O D 酶活性的影响
本试验用 N B T 光化学反应法进行 SO D 活性测定 , 从图 4 可以 看出 , ( O士 l) ℃ 条件下随
着低温处理时间的加长 , SO D 活性显著降低 . 酶活性降低说明君迁子幼苗对低温伤害的防御二了!lesw中
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能力减弱 .
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120 124图 4 不同时数低温处理下君迁子幼苗 S O D 活性
3 讨 论
S O D酶是机体中清除超氧 自由基的酶 , 其对超氧 自由基的清除避免了自由基对机体的攻击
和伤害 , 尤其是对细胞膜的攻击 . 在逆境中 , S O D 活性的高低是机体抗逆能力的标志 ` ,郊 ,4 ” , ’刹.
在低温处理过程 中 , 黄瓜幼苗 , 水稻叶片中 SO D 活性 降低 {’ } , 说明机体抗 低温能 力 降低 . 本
北 京 农 学 院 学 报 第 9卷
试验中 , 君迁子幼苗在 ( O士 1) ℃ 条件下 SO D 酶活性随低温处理时间的加长而降低 , 同样说
明了君迁子幼苗对低温抵抗能力的降低 .
凝胶电泳结果表明 , 许多植物中都存在着 SO D 酶 , 但同工酶的类型不同 . 有人认为玉米
中有九条 SO D 酶带 、 燕麦有三条 、 高粱有二条 、 小麦有三条 、 黄瓜有三条 、 水稻有三条 . 刘
鸿先等 1984 年分别对水稻和黄瓜叶片 S O D 酶研究中 , 用 K (入 和氯仿 一 2醇抑制法得到结果
认为 , 水稻的三条酶带中的 I 、 n 带为 uC
、
Z n 一 S O D , 黄瓜叶片 中的 S O D 酶带 I 、 n 为
uC
、
nZ 一 5 0 口 6…7, l叩 ’ ]. 酶带 1 为 M n一 SO D . 君迁子幼苗中的 9条 SO D酶带分别 属于哪种
同工酶需要进一步的研究 .
林植芳等 ( 19 84) 认为 , 水稻 叶片在衰老过程中 , 变化较 明显的是酶带 n 和酶带 班 , 其
为 uC
、
Z n 一 50 创 ’ OJ . 刘鸿先等 [ ’ ]也认为 , 黄瓜低温处理 中 , 变化最 明显 的是酶带 I 和酶带
n
, 其也是 uC
、
nZ 一 S O D
. 本文 中 SO D 酶带变化较明显的 B 区 中 A l , 2A , 3A 变化 最 明
显 , C 区中的 6A 在 24 h , 7h2 , 12 0h 和 l科 h 均消失 , D 区中的 A S , 9A 变化也是较 明显 的 ,
它一方面说明了酶活性的降低 , 一方面说明了同工酶类型的变化 , 但其 中这些 明显变化 的酶
属于哪一种同工酶尚需进一步研究 .
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1卯 4年 第 2 期 姚允聪等 : 低温条件下 君迁 子幼苗 O SD 同工酶谱带与活性研究
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