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紫红獐牙菜 5 种 酮类成分的分离及含量测定
常晓沥1，陈 晖2，王 婷1，郝 康3，李 冲1*
(1．兰州大学药学院，甘肃 兰州 730000;2. 甘肃中医学院，甘肃 兰州 730000;3. 兰州市第一人民医院，甘
肃 兰州 730000)
摘要 目的:研究紫红獐牙菜中 5 种 酮类成分的分离及其含量测定。方法:采用大孔吸附树脂、硅胶、聚酰
胺等柱色谱技术和重结晶方法对 酮类成分进行分离纯化，应用 NMＲ、紫外、质谱等波谱学方法进行结构鉴定;采
用 HPLC法测定含量，色谱柱为 Alltimal C18柱(250 mm ×4. 6 mm，5 μm)，甲醇-0. 06%磷酸水溶液作流动相梯度洗
脱，流速为 1. 0 mL /min，检测波长 254 nm，柱温 30 ℃。结果:从紫红獐牙菜中分离得到 5 个 酮类化合物，分别鉴
定为:8-O-D-吡喃葡萄糖基-1，5-二羟基-3-甲氧基 酮(S1)、Tetrahydrosertianolin(S2)、1，3，7，8-四羟基 酮(S3)、1，
3，8-三羟基-5-甲氧基 酮(S4)、1，5，8-三羟基-3-甲氧基 酮(S5)，且这 5 种 酮类成分分别在 14 ～ 140 μg /mL、6
～ 60 μg /mL、4 ～ 40 μg /mL、5 ～ 50 μg /mL、9 ～ 90 μg /mL内线性关系良好，相关系数分别为 0. 9996、0. 9995、0. 9997、
0. 9999、0. 9996;平均回收率分别为 99. 72%、99. 21%、98. 92%、99. 32%、98. 80%，ＲSD 均小于 2%(n = 5)。结论:
所有化合物都为已经分离得到过的，HPLC法用于紫红獐牙菜 酮类化合物的含量测定，简便、准确，重现性好，为
紫红獐牙菜 酮类化合物的研究提供理论依据，可作为紫红獐牙菜药材的质量控制方法。
关键词 紫红獐牙菜;分离;HPLC;含量测定; 酮
中图分类号:Ｒ284. 1 /Ｒ284. 2 文献标识码:A 文章编号:1001-4454(2014)02-0269-04
收稿日期:2013-09-24
作者简介:常晓沥(1988-)，女，在读硕士研究生，专业方向:天然药物化学;E-mail:cxl880718@ sina. com。
* 通讯作者:李冲，Tel:0931-8915058，E-mail:lichong@ lzu. edu. cn。
紫红獐牙菜是龙胆科獐牙菜属植物紫红獐牙菜
Swertia punicea Hemsl. 的干燥全草，主要分布于湖
北、四川、贵州、西藏等省区〔1〕。民间全草入药，具
清肝利胆、除湿清热解毒之功效，治急性黄疸型肝
炎，同时，对胆囊炎也有显著疗效。目前，已报道紫
红獐牙菜主要有 酮、三萜和环烯醚萜类等化学成
分〔2，3〕，獐牙菜苦苷、龙胆苦苷、齐墩果酸及部分
酮类含量测定方法也已见报道〔4，5〕，但 酮类化合
物系统研究较少，本研究根据 酮类的理化特性，通
过大孔吸附树脂、聚酰胺、硅胶柱等色谱技术分离、
结合重结晶纯化，制备 5 种 酮类单体，并采用
HPLC 法对其各自的含量进行测定，取得了满意结
果，为评价其药材质量和疗效提供实验依据。
1 仪器与材料
1. 1 仪器 Waters 600 高效液相色谱仪(Waters
600 Controller，Waters 600 Pump，Waters In-Line De-
gasser AF，Waters 2487 DualλAbsorbance Detector)，
Discovery 专业型分析天平 DV215CD(ohaus corpora-
tion pine Brook NJ. USA)。甲醇、磷酸为色谱纯，水
为纯净水，均经 0. 45 μm滤膜滤过。
1. 2 材料 紫红獐牙菜药材(批号:20110913、
20110914、20110915)于 2011 年 9 月采自云南省大
理，经兰州大学药学院马志刚教授鉴定为龙胆科植
物紫红獐牙菜 S. punicea Hemsl. 的干燥全草。
2 分离与鉴定
2. 1 5 种 酮单体的提取与分离 紫红獐牙菜干
燥全草(12 kg)，用 80%乙醇回流提取 3 次，提取时
间分别为 2、1、1 h，回收乙醇得流浸膏 1 280 g，浸膏
热水超声溶解，硅藻土过滤，离心，然后用大孔吸附
树脂柱色谱分离，用不同浓度的乙醇梯度洗脱，得
50%乙醇洗脱部分 512 g、90%乙醇洗脱部分 325 g。
其中 90%乙醇洗脱部分析出的絮状沉淀经热甲醇
重结晶得 S1(92 mg);90%乙醇洗脱其他部分经硅
胶柱色谱，以氯仿-甲醇(3∶ 1)洗脱得 S2(34 mg);经
硅胶柱色谱，以氯仿-丙酮(7∶ 1)洗脱得 S3(30 mg);
经聚酰胺柱色谱，以氯仿-甲醇(100 ∶ 1)洗脱得 S4
(20 mg);经硅胶柱色谱，以石油醚-丙酮-甲醇(7 ∶ 1
∶ 0. 1)洗脱得 S5(46 mg);经硅胶柱色谱，以石油醚-
·962·Journal of Chinese Medicinal Materials 第 37 卷第 2 期 2014 年 2 月
丙酮-甲醇(3∶ 1∶ 0. 1)洗脱得 S6(15 mg)。
2. 2 5 种 酮单体的结构鉴定
S1:乳黄色结晶(甲醇)。ESI-MS m/z:435［M －
H］－。1H-NMＲ(DMSO-d6，600 MHz)δ:13. 06(1H，
s，-OH)，10. 04(1H，s，-OH)，7. 26(1H，d，J = 8. 4
Hz，H-6)，7. 11(1H，dd，J = 8. 4 Hz，H-7)，6. 54(1H，
d，J = 1. 8 Hz，H-4)，6. 33(1H，d，J = 1. 8 Hz，H-2)，
4. 80(1H d，J = 7. 8 Hz，H-1)，3. 19 ～ 33. 73(m，H-2
～ 6)，3. 86(3H，s，-OCH3);
13C-NMＲ(DMSO-d6，150
MHz)δ:181. 2(C = O)，166. 3(C-3)，162. 7(C-1)，
156. 5(C-4a)，149. 5(C-8)，145. 1(C-4b)，141. 1(C-
5)，121. 2(C-6)，112. 4(C-7)，112. 0(C-8a)，103. 6
(C-1)，103. 2(C-8b)，97. 3(C-2)，92. 2(C-4)，77. 5
(C-5)，76. 2(C-3)，73. 6(C-2)，69. 8(C-4)，60. 9
(C-6)，56. 2(-OCH3)。以上数据与文献
〔6〕报道对
照基本一致，故鉴定 S1 为 8-O-D-吡喃葡萄糖基-1，
5-二羟基-3-甲氧基 酮。
S2:淡黄色粉末(甲醇)。ESI-MS m/z:439［M －
H］－。1H-NMＲ(CD3OD，600 MHz)δ:6. 47(1H，d，J
= 3. 6 Hz，H-4)，6. 31(1H，d，J = 3. 6 Hz，H-2)，4. 92
(1H，t，J = 3. 6 Hz，H-8)，4. 86(1H，d，J = 8. 4 Hz，H-
1)，4. 64(1H，d，J = 9. 6，7. 8 Hz，H-5)，3. 17 ～ 3. 93
(m，H-2 ～ 6)，3. 89(3H，s，-OCH3)，2. 28(1H，dq，J
= 13. 2，2. 4 Hz，Heq-7)，2. 15(2H，m，H-6)，1. 51
(1H，tt，J = 13. 2，2. 4 Hz，Hax-7);13C-NMＲ(CD3OD，
150 MHz)δ:180. 1(C = O)，166. 3(C-4b)，164. 1(C-
3)，159. 5(C-1)，156. 9(C-4a)，115. 1(C-8a)，103. 3
(C-8b)，102. 4(C-1)，98. 4(C-2)，93. 8(C-4)，75. 8
(C-5)，75. 5(C-3)，72. 3(C-2)，68. 9(C-4)，68. 3
(C-8)，64. 8(C-5)，60. 6(C-6)，54. 1(-OCH3)，26. 2
(C-7)，25. 1(C-6)。以上数据与文献〔6〕报道对照基
本一致，故鉴定 S2 为 Tetrahydrosertianolin。
S3:黄色粉末(甲醇)。ESI-MS m/z:259［M －
H］－。1H-NMＲ(DMSO-d6，600 MHz)δ:11. 90(1H，
s，-OH)，11. 75(1H，s，-OH)，11. 18(1H，s，-OH)，
9. 37(1H，s，-OH)，7. 25(1H，d，J = 9. 0 Hz，H-6)，
6. 62(1H，d，J = 9. 0 Hz，H-5)，6. 40(1H，d，J = 2. 4
Hz，H-4)，6. 21(1H，d，J = 2. 4 Hz，H-2);13 C-NMＲ
(DMSO-d6，150 MHz)δ:183. 7(C = O)，166. 5(C-
3)，162. 3(C-1)，157. 5(C-4a)，148. 3(C-4b)，14
7. 7(C-8)，139. 3(C-7)，123. 6(C-6)，107. 5(C-8a)，
106. 3(C-5)，101. 1(C-8b)，98. 5(C-2)，94. 3(C-4)。
以上数据与文献〔7〕报道对照基本一致，故鉴定 S3
为 1，3，7，8-四羟基 酮。
S4:黄色针晶(甲醇)。ESI-MS m/z:273［M －
H］－。1H-NMＲ(DMSO-d6，600 MHz)δ:11. 96(1H，
s，-OH)，11. 41(1H，s，-OH)，7. 38(1H，d，J = 9. 0
Hz，H-6)，6. 67(1H，d，J = 9. 0 Hz，H-7)，6. 36(1H，
d，J = 2. 4 Hz，H-4)，6. 20(1H，d，J = 2. 4 Hz，H-2)，
3. 85(3H，s，-OCH3);
13C-NMＲ(DMSO-d6，150 MHz)
δ:184. 4(C = O)，168. 1(C-3)，162. 9(C-1)，157. 8
(C-4a)，154. 0(C-8)，146. 9(C-4b)，139. 8(C-5)，
121. 4(C-6)，109. 9(C-7)，107. 8(C-8a)，102. 1(C-
8b)，99. 2(C-2)，95. 6(C-4)，57. 6(OCH3)。以上数
据与文献〔8〕报道对照基本一致，故鉴定 S4 为 1，3，
8-三羟基-5-甲氧基 酮。
S5:黄色针晶(丙酮)。ESI-MS m/z:273［M －
H］－。1H-NMＲ(DMSO-d6，600 MHz)δ:11. 89(1H，s，
OH)，11. 06(1H，s，OH)，9. 68(1H，s，OH)，7. 26
(1H，d，J = 9. 0 Hz，H-6)，6. 64(1H，d，J = 9. 0 Hz，H-
7)，6. 59(1H，d，J = 2. 4 Hz，H-4)，6. 37(1H，d，J =
2. 4 Hz，H-2)，3. 89(3H，s，-OCH3);
13 C-NMＲ(DM-
SO-d6，150 MHz)δ:185. 6(C = O)，168. 5(C-3)，
163. 5(C-1)，158. 6(C-4a)，153. 9(C-8)，144. 3(C-
4b)，137. 7(C-5)，124. 5(C-6)，109. 5(C-7)，107. 9
(C-8a)，102. 9(C-8b)，97. 9(C-2)，93. 3(C-4)，56. 2
(-OCH3)。以上数据与文献
〔6〕报道对照基本一致，
故鉴定 S5 为 1，5，8-三羟基-3-甲氧基 酮。
3 含量测定
3. 1 色谱条件及系统适应性试验 色谱柱:Allti-
mal C18柱(250 mm × 4. 6 mm，5 μm);流动相:甲醇-
0. 06%磷酸水溶液，梯度洗脱(0 min，甲醇 20%;50
min，甲醇 80%;50 min，甲醇 100%);流速:1. 0 mL /
min;检测波长:254 nm;柱温:30 ℃。理论塔板数均
＞ 104，对称因子 0. 95 ～ 1. 05。
3. 2 对照品溶液的制备 精密称取 S1 4. 67 mg、
S2 2. 0 mg、S3 1. 33 mg、S4 1. 67 mg、S5 2. 5 mg至 25
mL量瓶中，加一定量甲醇溶解，超声 30 min，使完全
溶解，待冷至室温后定容至 25 mL，即得混合对照品
溶液。
3. 3 供试品溶液的制备 紫红獐牙菜全草粉碎，
过 80 目筛，精密称取过筛后的药粉 3 g，共取 3 份，
加甲醇 30 mL，超声提取 2 次，每次 40 min，抽滤，滤
渣甲醇 20 mL，超声提取 30 min，抽滤，合并滤液，滤
液水浴蒸干，用甲醇将干浸膏洗入 10 mL 量瓶中，定
容，摇匀，经 0. 45 μm滤膜滤过，滤液作为样品溶液。
3. 4 方法学考察
3. 4. 1 线性关系考察:取上述对照品溶液，分别精
密吸取 0. 75、2. 5、4. 25、5. 85、7. 5 mL 至 10 mL 量
瓶，加甲醇定容，摇匀，配成 5 个不同浓度的混合对
·072· Journal of Chinese Medicinal Materials 第 37 卷第 2 期 2014 年 2 月
照品溶液，每个浓度的混合对照品溶液都精密吸取
2 μL进样，按上述色谱条件作 HPLC 分析，以进样
浓度为横坐标、峰面积为纵坐标进行回归计算，得
S1、S2、S3、S4、S5 的回归方程，结果见表 1。
表 1 5 种 酮类成分的回归方程与线性范围
样品 回归方程 r 线性范围 /(μg /mL)
S1 Y1 = 4. 44 × 107X1 + 5. 22 × 105 0. 9996 14 ～ 140
S2 Y2 = 1. 33 × 108X2 － 7. 96 × 103 0. 9995 6 ～ 60
S3 Y3 = 1. 84 × 108X3 + 1. 74 × 105 0. 9997 4 ～ 40
S4 Y4 = 1. 15 × 108X4 + 3. 36 × 105 0. 9999 5 ～ 50
S5 Y5 = 6. 71 × 107X5 + 9. 05 × 105 0. 9996 9 ～ 90
3. 4. 2 精密度试验:取对照品溶液，重复进样 5
次，每次进样 2 μL，记录色谱图及峰面积，以峰面积
计算 S1、S2、S3、S4、S5 的 ＲSD分别为 1. 6%、0. 9%、
1. 2%、0. 7%、0. 8%，结果表明仪器精密度良好。
3. 4. 3 重复性试验:取同一批紫红獐牙菜药材 5
份，按“3. 3”项下方法制备样品溶液并测定含量，以
含量计算 S1、S2、S3、S4、S5 的 ＲSD 分别为 0. 75%、
1. 23%、1. 49%、0. 56%、0. 95%，结果表明重复性良
好。
3. 4. 4 稳定性试验:取供试品溶液，分别于 0、2、4、
8、12 h 进样，以峰面积计算 S1、S2、S3、S4、S5 的
ＲSD 分 别 为 1. 09%、1. 34%、0. 48%、0. 97%、
1. 18%，结果表明样品溶液在 12 h内稳定。
3. 4. 5 加样回收率试验:取已知含量同一批紫红
獐牙菜样品 5 份，精密称定，分别加入 S1、S2、S3、
S4、S5 适量;按“3. 3”项下方法制备样品溶液，测定
含量，计算回收率及平均回收率，结果见表 2。表明
HPLC法用于本品的质量控制具有良好的准确性。
表 2 5 种 酮类成分加样回收率试验结果
样品 原含量 /mg 加标量 /mg 实测量 /mg 回收率 /% 平均回收率 /% ＲSD /%
S1 0. 294 0. 30 0. 5793 97. 53 99. 72 1. 47
0. 294 0. 31 0. 6017 99. 62
0. 294 0. 28 0. 5816 101. 33
0. 294 0. 33 0. 6201 99. 37
0. 294 0. 32 0. 6186 100. 76
S2 0. 096 0. 10 0. 1960 98. 83 99. 21 1. 09
0. 096 0. 11 0. 2060 99. 57
0. 096 0. 12 0. 2160 100. 60
0. 096 0. 10 0. 1940 99. 44
0. 096 0. 13 0. 2260 97. 63
S3 0. 060 0. 10 0. 1600 97. 23 98. 92 1. 19
0. 060 0. 11 0. 1700 99. 58
0. 060 0. 12 0. 1800 99. 37
0. 060 0. 10 0. 1590 98. 21
0. 060 0. 14 0. 2000 100. 21
S4 0. 081 0. 10 0. 1810 99. 31 99. 32 1. 13
0. 081 0. 11 0. 1910 99. 59
0. 081 0. 12 0. 2010 101. 02
0. 081 0. 10 0. 1800 98. 72
0. 081 0. 14 0. 2210 97. 98
S5 0. 204 0. 20 0. 4040 99. 85 98. 80 1. 48
0. 204 0. 20 0. 4050 99. 76
0. 204 0. 20 0. 4060 97. 31
0. 204 0. 20 0. 4010 100. 01
0. 204 0. 20 0. 4070 97. 05
3. 5 样品测定 取紫红獐牙菜药材，按“3. 3”项下
方法制备样品溶液，根据测定成分的线性范围进样，
记录色谱峰面积，外标法计算 5 种 酮类成分的含
量，结果见表 3。色谱图见图 1。
4 讨论
4. 1 提取溶剂的选择 提取时不同的溶剂的对提
取效果有显著影响，比较了甲醇和乙醇，发现两者提
取效果都较好，甲醇提取更完全些，但考虑到提取的
杂质会很多，且热提用甲醇对实验人员身体有损，综
合考虑以上因素，以乙醇作为提取溶剂效果较好。
·172·Journal of Chinese Medicinal Materials 第 37 卷第 2 期 2014 年 2 月
表 3 紫红獐芽菜中 5 种 酮类成分的
含量测定结果(n =2)
批号 样品 含量 /(mg /g) ＲSD /%
20110913 S1 0. 098 1. 41
S2 0. 032 0. 93
S3 0. 027 0. 83
S4 0. 020 0. 64
S5 0. 068 1. 24
20110914 S1 0. 103 1. 04
S2 0. 026 0. 86
S3 0. 038 0. 67
S4 0. 026 0. 74
S5 0. 083 1. 56
20110915 S1 0. 094 1. 56
S2 0. 029 0. 95
S3 0. 026 0. 84
S4 0. 023 0. 78
S5 0. 070 1. 18
图 1 混合对照品(A)与紫红獐牙菜样品(B)HPLC图谱
S1. 8-O-D-吡喃葡萄糖基-1，5-二羟基-3-甲氧基 酮
S2. Tetrahydrosertianolin S3. 1，3，7，8-四羟基 酮 S4. 1，3，
8-三羟基-5-甲氧基 酮 S5. 1，5，8-三羟基-3-甲氧基 酮
4. 2 色谱条件的选择试验 比较了以下色谱系
统:甲醇-水、甲醇-0. 03%磷酸水、甲醇-0. 05%磷酸
水、甲醇-0. 06%磷酸水、乙腈-水，所得的色谱图以
甲醇-0. 06%磷酸水梯度洗脱为最佳。
4. 3 检测波长的选择 考察了检测波长 254 和
360 nm下所得的色谱图，254 nm 下明显灵敏，故选
择检测波长为 254 nm。
4. 4 5 种 酮类成分的含量差异 在这 5 种 酮
类成分中，8-O-D-吡喃葡萄糖基-1，5-二羟基-3-甲氧
基 酮在紫红獐牙菜全草中含量最高，1，5，8-三羟
基-3-甲氧基 酮其次，Tetrahydrosertianolin、1，3，7，
8-四羟基 酮和 1，3，8-三羟基-5-甲氧基 酮含量
小于 1，5，8-三羟基-3-甲氧基 酮，三者含量差异不
显著。
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480-483．
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·272· Journal of Chinese Medicinal Materials 第 37 卷第 2 期 2014 年 2 月