全 文 ：[中药指纹图谱 ]
半边莲药材 HPLC指纹图谱的研究
周　颖 , 　王　彦 , 　王刃锋＊
(上海交通大学药学院 ,上海 200240)
收稿日期:2007-02-12
作者简介:周　颖(1982～ ),女 ,硕士生 ,从事中药分析研究 ,电话:021-34204833。
＊通讯作者:王刃锋 ,男 ,教授 ,研究方向:药物分析中的新方法 、新技术;毒素组学;镇痛 、麻醉新药的作用机理及新剂型研究 ,天然药物研
究 , E-mail:edgewang@sjtu.edu.cn。
关键词:半边莲;指纹图谱;反相高效液相色谱法
摘要:目的:建立半边莲药材反相高效液相色谱(RP-HPLC)指纹图谱分析方法 ,为有效控制半边莲药材的质量奠定基础。
方法:采用 RP-HPLC,色谱柱为 DaisoC18 , 甲醇-水梯度洗脱 ,紫外检测波长为 261nm, 流速为 1.0 mL/min, 分析时间为 60
min,分析了 10批半边莲药材的 HPLC指纹图谱。结果:在选定的色谱条件下通过相似度分析确定 11个色谱峰构成半边
莲药材指纹图谱的特征峰。结论:采用 RP-HPLC所建立的指纹图谱具有稳定 、重复性好的特点 ,可用于半边莲药材的质
量控制。
中图分类号:R284.1　　　　　文献标识码:A　　　　　文章编号:1001-1528(2007)12-1717-04
HPLCfingerprintofLobeliachinesisLout
ZHOUYing, 　WANGYan, 　WANGRen-feng＊
(SchoolofPharmacy, ShanghaiJiaotongUniversity, Shanghai200240, China)
KEYWORDS:LobeliachinesisLour;fingerprint:RP-HPLC
ABSTRACT:AIM:ToestablishthechromatographicfingerprintsofLobeliachinesisLour.byRP-HPLCwhich
maybepotentialybeneficialtothequalitycontrolinproduction.METHODS:SeparationwasperformedonaDai-
soC18 columnwithmethanol-waterasmobilephaseusinggradientelutionatflowrateof1.0mL/min.TheUVde-
tectionwavelengthwasat261 nmandtheanalysistimewasupto60 min.TotaltenbatchesofLobeliachinesis
Lout.werestudied.RESULTS:11peakswereidentifiedasthecharacteristicfingerprintsofLobelictchinesisLour.
undertheabovechromatographicconditions.CONCLUSION:TheRP-HPLCfingerprintmethodisfoundtohave
satisfactoryaccuracy, stabilityandreproducibility.ApotentialmethodforthequalitycontrolofLobelia, chinesis
Lour.wasestablished.
　　半边莲是我国传统的中药 ,为桔梗科多年生草本植物半
边莲(LobeliachinesisLour.)的带根全草。主产江苏 、浙江 、
安徽等地。全草主要含哌啶类生物碱如 L-山梗菜碱(L-Lo-
beline)、山梗菜酮碱(lobelanine)、山梗菜醇碱(lobelanidine)、
异山梗菜酮碱(isotobelanine)等 [ 1] 。此外还含有吡咯烷类生
物碱半边莲碱 A(radicamineA)、半边莲碱 B(radicamine
B)[ 2] 和多炔类成分如 Lobetyol、Lobetyolin和 Lobetyolinin
等 [ 3] 。
半边莲清热解毒 , 利水消肿。主治毒蛇咬伤 , 痈肿疔疮 ,
扁桃体炎 , 阑尾炎 ,肝硬化腹水及多种癌症 [ 1] 。现代药理学
研究还表明它具有抗糖尿病 、拮抗内皮素等多种药理活
性 [ 4～ 7] 。但目前为止一直缺乏综合评价和分析半边莲药材
品质的方法。中药材指纹图谱是近年来被国际公认的控制
中药或天然药物质量的有效方法 , 其优点在于可全面反映中
药复杂的化学成分及其相对比例。本研究采用反相高效液
相色谱法(RP-HPLC),建立了半边莲约材的指纹图谱 , 为半
边莲药材的质量评价提供了依据。
1　实验材料
1.1　仪器
　　LC-20AB高效液相色谱仪 , 包括 LC-20AB泵 、SPD-20A
检测器 、LCsolution工作站和 DGU-20A3脱气仪(日本岛津公
司);Waters分析及制备型高效液相色谱 , 包括 1525型二元
高压梯度泵系统 、 2996型二极管矩阵检测器 、717增强型自
动进样器 、1500型柱温控制系统(美国 Waters公司);Daiso
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C18色谱柱(4.6 mmI.D.×250mm, 5 μm, UnimicroTechnolo-
gies.IncUSA);KQ2200B型超声波清洗器(昆山市超声仪器
有限公司);SHB-Ⅲ型循环水多用真空泵(郑州长城科工贸
有限公司);旋转蒸发器 RE-52AA(上海振捷实验设备有限
公司);DRT-TW型调温电热套(郑州长城科工贸有限公
司);SXJQ-1型数显直流无级调速搅拌器(郑州长城科工贸
有限公司);0.22 μm微孔滤膜(偏氟膜 , 上海亚东核级树脂
有限公司);中药粉碎机(上海淀久中药机械制造有限公
司);BT224S电子天平(北京赛多利斯仪器有限公司)。
1.2　药材与试剂
　　10批半边莲药材的来源见表 1, 经上海交通大学药学院
中药品质与活性物质组学课题组王梦月博士鉴定为桔梗科
植物半边莲 LobeliachinesisLour.的干燥全草。将上述药材
样品经低温干燥后 , 粉碎成粗粉(过 60目筛), 备用。甲醇
(色谱纯 ,江苏汉邦科技有限公司);超纯水(MILLIPROE),
其余试剂均为分析纯 。
表 1　 半边莲药材的来源
Tab.1　 SourcesofLobeliachinesisLour.
SampleNo. ProductionArea ColectionDate
1. 安徽(上海万仕诚国药制品有限公司) 2005.10
2. 安徽(上海华宇药业有限公司) 2004.07
3. 安徽(上海市闵行区雷允上药店) 2005.10
4. 江苏(上海华宇药业有限公司) 2004.05
5. 江苏(上海余天成中药饮片有限公司) 2004.04
6. 江苏(上海蔡同德中药饮片有限公司) 2005.09
7. 江苏(北京市志诚堂药业有限公司) 2004.12
8. 浙江(上海华宇药业有限公司) 2005.12
9. 湖北(上海同济堂药业有限公司) 2005.11
10. 广西(安徽省亳州市金泉中药饮片有限公司) 2005.02
2　方法与结果
2.1　供试品溶液的制备
取半边莲药材粉末(过 60目筛)1.0 g, 精密称定 , 置圆
底烧瓶中 , 加甲醇 50 mL,称重 , 60°C下加热回流 1 h。滤过 ,
蒸干 , 甲醇定容至 10 mL, 微孔滤膜滤过 , 取续滤液作为供试
品溶液。
2.2　色谱条件
色谱柱:DaisoC18柱(4.6 mm×250 mm, 5 μm);流动相:
甲醇(B)-水(A);洗脱方式:线性梯度 , B相 , 0 ～ 40 min(0 ～
100 ), 40 ～ 60min(100 ～ 100 ), 60 min(停止);检测波
长:261nm;流速:1.0mL/min,进样量 10 μL。
2.3　测定方法
吸取供试品溶液 10 μL,按 2.2项下的色谱条件进行分
析 ,结果见图 1。
图 1　半边莲药材提取物的 RP-HPLC色谱图(样品 1)
Fig.1　ThechromatogramoftheextractofLobelia
chinesisLour(Sample1)
2.4　方法学考察
2.4.1　精密度试验　取同一批药材 ,按 2.1项下方法制备
供试品 , 按 2.2项下色谱条件连续进样 5次 , 测定其 RP-
HPLC图谱。选出 11个共有指纹峰进行考察 , 以 8号峰为参
照峰 ,结果表明各共有峰相对保留时间的 RSD值 <2 , 相
对峰面积的 RSD值 <3 (见表 2),表明仪器精密度良好。
2.4.2　重复性试验　取同一批药材 5份 , 按 2.1项下方法
制备供试品 ,按 2.2项下色谱条件分别进样 , 测得各共有峰
的相对保留时间的 RSD值 <2 , 相对峰面积的 RSD值 <
4 (见表 3),结果表明本试验方法的重现性良好。
2.4.3　稳定性试验　取同一批药材 ,按 2.1项下方法制备
供试品 ,按 2.2项下色谱条件分别在 0, 4, 8, 12, 24h进样 ,测
得各共有峰的相对保留时间的 RSD值 <2 , 相对峰面积的
RSD值 <5 (见表 4),表明样品溶液在 24 h内稳定。
表 2　 精密度试验
Tab.2　 PrecisionTest
PeakNo. 1 2 3 4 5 6 7 8(S) 9 10 11
RSDofRT 0.122 1.527 1.357 1.087 0.615 0.646 0.339 - 0.047 0.084 0.109
RSDofRA 2.049 2.359 1.448 0.999 1.409 1.972 1.178 - 0.558 0.824 1.161
表 3　 重复性试验
Tab.3　 RepeatabilityTest
PeakNo. 1 2 3 4 5 6 7 8(S) 9 10 11
RSDofRT 0.923 0.927 1.056 0.682 0.638 0.735 0.456 - 0.156 0.468 0.339
RSDofRA 1.823 2.774 3.338 1.296 3.299 2.822 2.851 - 1.26 0.828 1.161
表 4　 稳定性试验
Tab.4　 StabilityTest
PeakNo. 1 2 3 4 5 6 7 8(S) 9 10 11
RSDofRT 0.569 0.832 1.653 0.95 1.099 1.269 0.776 - 0.133 0.566 0.334RSDofRA 2.330 1.961 4.597 2.282 2.348 1.868 1.195 - 1.809 2.494 0.618
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图 2　10批半边莲药材的指纹图谱
Fig.2　HPLCfingerprintsoftenbatches
S1～ S10分别代表表 1中的 1～ 10号样品;R-对照图谱
S1～ S10respresentsamplesof1 ～ 10respectivelyinTab.1;R-control
2.5　指纹图谱及各项技术参数
按上述方法检测表 1中不同产地 10批半边莲药材的指
纹图谱 , 结果如图 2所示。
　　将这 10批供试品药材的指纹图谱数据输入国家药典委
员会开发的 《中药色谱指纹图谱相似度评价系统研究版
(2004A)》中 ,进行时间窗宽度的设定 、多点校正 、谱峰匹配 ,
最后生成了对照图谱 R(见图 2), R含有 11个共有色谱峰 ,
其中 8号峰面积较大 , 且较稳定。根据 《中药注射剂色谱指
纹图谱实验研究技术指南(试行)》 ,选择 8号峰作为参照峰。
各峰相对保留时间 、相对峰面积结果分别见表 5和表 6。
表 5　 10批半边莲药材共有峰相对保留时间
Tab.5　 RelativeretentiontimeofcommonpeaksfortenbatchesofLobeliachinesisLour.
PeakNo. RelativeretentiontimeS1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9 S10 Average RSD/
1 0.127 0.127 0.129 0.128 0.128 0.127 0.128 0.128 0.128 0.128 0.128 0.63
2 0.312 0.317 0.317 0.311 0.314 0.312 0.312 0.312 0.316 0.311 0.313 0.80
3 0.332 0.334 0.335 0.329 0.331 0.332 0.330 0.332 0.329 0.331 0.331 0.54
4 0.353 0.355 0.354 0.352 0.351 0.353 0.352 0.352 0.355 0.352 0.353 0.43
5 0.436 0.431 0.437 0.431 0.435 0.435 0.433 0.434 0.438 0.434 0.434 0.51
6 0.460 0.457 0.462 0.454 0.459 0.459 0.457 0.457 0.462 0.459 0.459 0.54
7 0.545 0.540 0.546 0.538 0.543 0.544 0.543 0.544 0.547 0.544 0.543 0.49
8 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 —
9 1.118 1.119 1.118 1.119 1.118 1.118 1.120 1.119 1.118 1.119 1.119 0.07
10 1.450 1.457 1.447 1.457 1, 456 1.452 1.460 1.455 1.456 1.455 1.455 0.26
11 1.808 1.814 1.808 1.807 1.809 1, 808 1.813 1.809 1.806 1.807 1.809 0.14
表 6　 10批半边莲药材共有峰的相对峰面积
Tab.6　 RelativeareaofcommonpeaksfortenbatchesofLobeliachinesisLour.
PeakNo. RelativeAreaS1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9 S10 Average RSD/
1 0.128 0.145 0.103 0.130 0.447 0.127 0.131 0.100 0.096 0.050 0.146 75.02
2 0.053 0.037 0.025 0.031 0.151 0.032 0.060 0.036 0.046 0.066 0.054 68.43
3 0.044 0.013 0.058 0.035 0.537 0.058 0.052 0.093 0.030 0.045 0.097 161.83
4 0.275 0.284 0.21.3 0.299 1.482 0.310 0.308 0.150 0.257 0.287 0.387 100.37
5 0.129 0.021 0.054 0.026 0.121 0.016 0.032 0.122 0.040 0.067 0.063 71.26
6 0.087 0.102 0.066 0.115 0.264 0.100 0.067 0.079 0.082 0.t28 0.109 53.26
7 0.049 0.045 0.022 0.046 0.029 0.031 0.033 0.041 0.077 0.092 0.046 47.17
8 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 —
9 0.187 0.158 0.181 0.101 0.140 0.113 0.152 0.153 0.130 0.457 0.177 57.45
10 0.255 0.368 0.331 0.437 0.682 0.352 0.326 0.297 0.346 0.331 0.372 31.83
11 0.056 0.052 0.059 0.074 0.112 0.064 0.072 0.090 0.064 0.062 0.070 25.58
出峰总数 23 21 22 22 25 17 21 22 21 18
΢共有峰面积
百分比 / 80.93 73.22 77.76 77.56 76.06 72.48 74.56 70.69 82.36 72.46
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　　各色谱峰的相对保留时间的 RSD<1 ,相对峰面积的
RSD较大。对表 6进行仔细分析 , 可看出 , 在 10个样品中 ,
所有 11个特征峰中 S5相对峰面积比较明显的偏离平均值 ,
因此导致相对峰面积的 RSD较大 , 说明这 10批药材个别批
次的成分含量差异较大。
2.6　指纹图谱相似度计算
将 10批半边莲样品指纹图谱的 AIA数据文件导入 2004
年国家药典委员会开发的《中药色谱指纹图谱相似度评价系
统研究版(2004A)》, 计算各样品指纹图谱与生成的对照图
谱 R的相似度 ,结果见表 7。
表 7　 相似度分析结果
Tab.7　 Theresultsofsimilarityanalysis
SampleNo. Similarity SampleNo. Similarity
1 0.975 6 0.988
2 0.987 7 0.988
3 0.979 8 0.960
4 0.979 9 0.984
5 0.672 10 0.750
3　讨论
3.1　提取方法的选择
通过对提取方式(超声 、冷浸 、热回流提取)的考察 [ 3 , 8] ,
发现超声与冷浸的提取效果相当 ,但所得色谱图的总峰面积
远小于热回流提取所得色谱图的总峰面积。而对提取溶剂
(纯甲醇 、纯乙醇 、70 甲醇水溶液 、70 乙醇水溶液)考察后
发现 , 与后 3种溶剂比较 , 纯甲醇提取物所得色谱峰的信息
量最多 , 且总峰面积最大。同时也对不同提取时间(30 min,
60 min, 90 min)对提取物的影响进行了考察 , 发现甲醇热回
流提取 60min后色谱图的总峰面积最高。所以综合以上因
素最终选用纯甲醇为提取溶剂 ,热回流提取 60 min为半边莲
药材的提取方法。
3.2　色谱条件的选择
分别用甲醇-水 、乙腈-水 、乙腈-磷酸盐缓冲体系为流动
相 , 以不同梯度进行试验 ,结果表明用甲醇-水线性梯度洗脱
效果最好。同时采用 Waters二级管阵列检测器对指纹图谱
的检测波长进行了选择 ,首先从中选出 243、 254、261 nm3个
分离度较好的波长 , 然后进一步通过分析比较这 3个波长下
的指纹图谱 , 发现检测波长为 261 nm时色谱图所包含的信
息量最大 , 且各色谱峰分离较好 , 基线较平稳。后采用实验
选定的色谱条件对 10批半边莲药材进行指纹图谱研究 , 实
验证明 , 选定的色谱方法可操作性强 , 重现性好 ,可作为半边
莲药材指纹图谱研究的基础。
3.3　指纹图谱的评价
由表 7可见 , 除 5号 、10号样品外其他 8批药材的相似
度均在 0.96以上 , 相似度高 ,说明这 8批药材的质量是相对
稳定的。而 5号江苏产地与 10号广西产地的药材相似度较
低 , 分别为 0.672, 0.750。表 6的数据也已说明 5号样品的
含量与平均值差别较大 ,但还不能直观定量的说明各个样品
之间的差异。采用的国家药典委员会颁布的 “中药色谱指纹
图谱相似度评价系统”软件 ,该软件具有生成对照图谱功能 ,
支持多点校正 , 相似度计算方法为夹角余弦法。能达到快
速 、准确评价药材质量的目的。
对相似度结果进行深入分析 , 发现其中 10号广西产地
的半边莲 , 生药学鉴定结果显示其中含有石竹科植物漆姑草
和禾本科的未知植物 ,所以对 10号样品来说 ,一方面可能是
因为这些杂草的存在导致了其图谱的变化;当然另一方面也
可能是由于产地不同造成它与其它几个产地的药材相比相
似度较低。对于 5号样品来说 , 由于本研究中属于江苏产地
的药材共 4批 , 即 4号 、5号 、6号和 7号 , 其中 4号 、 6号和 7
号样品的相似度很高 ,唯独同一江苏产地的 5号样品较差。
而在实验中对这 10批药材进行性状考察时 ,也已发现 5号
样品其形 、味都异于其他几批样品 , 所以很可能是由于此 5
号样品存放时间过长或存放不当 , 造成其质量变化 , 相似度
变低。从本试验的相似度计算结果可知 , 产地相同的半边莲
药材相似度也可能存在较大的差异 ,说明本文建立的分类方
法与传统的按产地分类的方法有一定的差异 ,更强调样品的
内在化学特征 。
3.4　结论
本试验采用 RP-HPLC色谱法 , 建立了半边莲药材的指
纹图谱分析方法。结果表明方法稳定 、可靠 、重现性好 ,为半
边莲药材质量的分析与控制提供了可靠的依据。
致谢　上海交通大学药学院中药品质与活性物质组学课题
组王梦月博士为实验鉴定了半边莲药材。
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